雙佐劑疫苗組合物、製備和用途的製作方法

2023-05-18 18:10:16

本發明涉及疫苗、它們的製備和用途。本發明更具體涉及雙佐劑疫苗，其包含在水包油包水(wow)乳液中的至少一種抗原和另外的佐劑。本發明的疫苗可包含任何類型的抗原(優選細菌抗原)，並且特別適宜獸醫用途，例如用於給雞(chicken)接種疫苗。

發明背景

疫苗通常與佐劑一起配製，以增強並改善免疫反應，尤其延長抗體反應。例如弗氏佐劑(freund’sadjuvant)(proceedingsofthesocietyforexperimentalbiologyandmedicine,1942,49,548-553)，其對應於乳化於礦物油中的抗原溶液，首先被用作免疫增強劑或用作免疫加強劑(immunobooster)。弗氏佐劑形成油包水(wo)乳液，並本質上通過抗原的持續釋放來展現佐劑效果。

已經評估了各種各樣的其它佐劑系統，以便提供有效的疫苗。這些包括例如殼聚糖、細胞因子、寡核苷酸、脂質、毒素、半抗原載體或氫氧化鋁。在這方面，matsumoto等人(aviandiseases,1971,15,109-117)已經測試了鋁衍生物(例如氫氧化鋁凝膠和鉻鋁)在疫苗中的功效。blackall等人(aviandiseases,1992,36,632-636)已經比較了氫氧化鋁佐劑和wo乳液。角鯊烯、皂苷、quila、類脂胺、聚糖或阿夫立定也已經作為佐劑被添加到疫苗中，以改善它們的功效。

ep0640348涉及包含wo乳液和免疫刺激性聚糖的疫苗。us2014/0099358提議包含油包水乳液以及鋁或鋁的化合物或titermax(角鯊烯)的疫苗。然而，組合的乳液-佐劑系統的設計因為可能的副作用而產生安全性問題(reid和blackall,aviandiseases,1987,31,59-63)。此外，傳統的wo乳液經常具有高粘度並且難以配製或注射。

基於wow乳液的疫苗已經在禽類胚胎的卵內免疫中測試(us5,817,320)，並針對(against)具體的病毒例如紐卡斯爾病病毒、傳染性支氣管炎病毒(cajavec等人,actaveterinariahungarica,1998,46,25-34)和傳染性鼻炎(blackall,world’spoultrysciencejournal,1995,51,17-26)進行測試。

根據用於製備wow乳液的表面活性劑的性質和比例，已經在穩定性方面使此類在wow乳液中的疫苗得到了改善。關於這一點，hunter和bennet已經研究了在低於2的親水-親脂平衡(hlb)下的式ho(c2h4o)b(c3h6o)a(c2h4o)b的聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(us5,622,649)。他們還已經在用於B型肝炎感染的接種疫苗方法中測試了此類wow乳液，並已提及它們對抗破傷風、瘧疾、愛滋病、流感和肺炎球菌性肺炎的效力。

jiao和burgess(aapspharm.sci.,2003,5,1-12)已經關於兩種具體的表面活性劑(司盤83(span83)和吐溫80(tween80))的濃度評估了wow多相乳液的長期穩定性，並且已確定，20％司盤83和0.1％吐溫80的濃度比率提供了wow乳液的最佳長期穩定性。然而，wow乳液不總是產生令人滿意的免疫反應。此外，wow可能涉及許多潛在的缺點，包括它們缺乏均一性(例如在顆粒的尺寸分布輪廓(profile)中)和不均勻的製劑的可能的粘性。此外，尚未確立此類系統用於配製大的對象(例如細胞)的合適性。

因此，本領域對替代的、安全的和改善的疫苗，尤其用於動物中的疫苗存在著需求。

發明概述

本發明提供具有改善的功效的新穎疫苗。本發明特別公開了將wow乳液與佐劑化合物組合的雙佐劑系統疫苗。本發明源自發明人的意料不到的以下發現：此類雙佐劑系統是安全的並且在體內產生改善的免疫反應。尤其，本發明顯示，此類疫苗在非人動物中誘導有效的保護性免疫反應，並且特別適合於細菌抗原，優選包括全細胞細菌。

因此，本發明的一個目的涉及疫苗，其包含有效量的在水包油包水(wow)乳液中的至少一種抗原和另外的佐劑。

本發明的另一個目的涉及疫苗，其在水包油包水(wow)乳液中包含有效量的至少一種抗原和佐劑化合物。

本發明的另一個目的是如上所定義的疫苗，其用於在非人動物中誘導針對所述抗原的免疫反應。

本發明的進一步目的涉及在非人動物中誘導針對抗原的免疫反應的方法，其包括對所述動物施用組合物，所述組合物包含有效量的在wow乳液中的所述至少一種抗原和另外的佐劑。

本發明的另一個目的是製備疫苗的方法，其包括：

a)將至少一種抗原的溶液在油基(oilbase)中乳化，由此形成wo乳液，

b)將所述wo乳液加入到分散相中，由此形成wow乳液，並且任選地，進一步乳化所述wow乳液，和

c)將所述wow乳液與另外的佐劑混合，所述另外的佐劑優選與額外量的所述至少一種抗原組合。

在特別的實施方式中，另外的佐劑是氫氧化鋁。

在另一個特別的實施方式中，至少一種抗原是細菌抗原，優選為活細菌、減毒細菌或滅活細菌。

在本發明的特別方面，如上所定義的疫苗包含包埋在油性顆粒中的所述抗原，所述油性顆粒優選具有1至40μm的尺寸。

如將進一步公開的，本發明組合物特別適合給非人動物，特別是家禽(例如雞(chicken)、水禽)或鳥類接種。

附圖說明

圖1：wow乳液的說明。

圖2a-2b：通過皮下途徑(sq,圖2a)和肌內途徑(im,圖2b)用疫苗a處理的雞中針對腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritidis)(se)的保護百分率。

圖3a-3b：通過皮下途徑(sq,圖3a)和肌內途徑(im,圖3b)用疫苗a處理的雞中針對鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)(st)的保護百分率。

圖4：通過皮下和肌內途徑用疫苗a處理的雞中針對肯塔基沙門氏菌(salmonellakentucky)(sk)的保護百分率。

圖5a-5b：通過皮下途徑(sq,圖5a)和肌內途徑(im,圖5b)用疫苗a處理的雞中針對海德爾堡沙門氏菌(salmonellaheidelberg)(sh)的保護百分率。

圖6：小母雞中對於疫苗a的肌內注射位點反應。

發明詳述

本發明提供新穎且改善的疫苗組合物、其製備方法和它們的用途。本發明尤其公開了新穎的疫苗，其包含在wow乳液中的有效量的至少一種抗原，並進一步包含佐劑。本發明源自發明人的意料不到的以下發現：此類雙佐劑系統可容易注射、是安全的，並且提供比使用其它佐劑系統的現有技術疫苗更大的功效(保護性免疫)。尤其，發明人已經證明了關於包含至少一種抗原和雙佐劑系統的本發明的疫苗的協同效應。發明人也已經證明了此類疫苗在體內針對沙門氏菌感染的改善的保護功效以及它們的安全性。

因此，本發明的一個目的涉及疫苗或組合物，其包含有效量的在wow乳液中的至少一種抗原和另外的佐劑。

本發明的另一個目的是疫苗或免疫原性組合物，其在wow乳液中包含抗原和另外的佐劑，其中所述抗原包括在包含內水相和油相的油性顆粒中，並且其中所述另外的佐劑包括在外水相中，所述另外的佐劑優選與所述抗原複合。

本發明的另一個目的是疫苗或免疫原性組合物，其在wow乳液中包含全細胞，其中wow乳液中的至少90％的油性顆粒具有低於20μm的尺寸，所述組合物具有優於4的od600/ml，且所述組合物中的至少60％的細胞包含在所述油性顆粒中。

本發明的進一步的目的是在非人動物中誘導針對至少一種抗原的免疫反應的方法，其包括對所述動物施用疫苗或組合物，該疫苗或組合物在wow乳液中包含有效量的所述至少一種抗原和佐劑化合物。

本發明的進一步的目的是針對病原體給非人動物接種疫苗的方法，其包括對所述動物施用疫苗或組合物，該疫苗或組合物在wow乳液中包含有效量的至少一種病原體抗原和佐劑化合物。

本發明的進一步的目的是組合物，其在wow乳液中包含有效量的至少一種抗原和佐劑化合物，用於在非人動物中誘導針對所述至少一種抗原的免疫反應。

抗原

術語「抗原」指在被引入動物中時可被該動物的免疫系統識別，並引起免疫反應的試劑。在施用於動物時，抗原通常與免疫系統的抗原識別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或t細胞抗原受體(tcr)發生特異性相互作用，以引起免疫反應，所述免疫反應導致細胞反應(例如記憶細胞(例如記憶b-細胞和t-細胞)或細胞毒性細胞)和/或體液(抗體)反應的產生。

本發明可以使用任何類型的抗原，非限制性地例如為完整的病原體(例如細胞、病毒)或其片段(fragments)或部分(fractions)(例如蛋白質、多肽、肽、核酸、脂質等)。病原體可以是能夠感染動物(例如人、禽類(例如雞、火雞、鴨子、鴿子等)、犬、貓、牛、豬或馬)的任何試劑。優選地，抗原是禽類(更優選雞)病原性試劑。抗原可以是例如完整的病原體、天然表達在例如病原體或感染的或患病的(例如腫瘤)細胞的表面上的「表面抗原」。

更尤其，抗原可以是任何病原性微生物或非病原性微生物，例如病毒、細菌、任何其它寄生蟲或抗原。這些可以是活的、減毒的、滅活的或殺死的微生物(或者是完整的微生物或者是微生物的亞單位)、滅活的嵌合微生物或重組微生物、破裂的微生物、突變微生物、有缺陷的微生物或它們的組合。抗原還可以是或包括完整的微生物結構(例如病毒、細菌或寄生蟲)的一個或更多個表位或抗原性部分，例如來自病原體的抗原性蛋白、重組蛋白，優選病毒抗原例如病毒衣殼蛋白、細胞壁蛋白、肽或細菌或寄生蟲結構的部分例如多糖、脂多糖和糖蛋白的製劑。抗原還可以是dna或重組dna。可以以純化的形式或未純化的形式提供抗原。

當抗原是減毒的微生物(例如病毒、細菌或其它病原體)時，該減毒病原體保留免疫原性性質並且基本上沒有致病性質。減毒(作用)可來自天然或人工的減毒方法，例如在活的動物或各種各樣的天然培養基(包括器官、細胞、含胚卵等)中傳代。還可以通過化學處理、乾燥、老化、對低溫或特別的培養條件的適應、遺傳缺失(geneticdeletion)等來獲得人工減毒。

抗原還可以包括殺死的滅活微生物。通常經由化學方法或物理方法來實現用於接種的滅活病毒的製備。可通過例如用酶、甲醛、(β-丙內酯、二元吖丙啶或其衍生物來實現化學滅活。然後可使如此得到的滅活病毒中和或穩定。可通過使病毒經受高能輻射(例如紫外光、x-輻射或(γ-輻射)來實施物理滅活。

可例如通過熱、壓力和/或經常稱為殺菌劑的化學試劑的使用來將細菌(包括孢子)滅活。例如，腐蝕性組合物(例如甲醛和次氯酸鈉(漂白劑))已經用於將細菌滅活。或者，可以通過環氧乙烷暴露、伽馬輻照、蒸汽殺菌、或通過使用近臨界二氧化碳處理和超臨界二氧化碳處理來獲得細菌的滅活。還可以通過對致病性中所涉及的一種或數種基因的基因修飾來滅活細菌或使其無毒性。此類基因修飾的實例公開在例如wo2012/092226中。

還可以從商業來源購買此類減毒的或滅活的微生物(例如病毒、細菌或其它禽類寄生蟲)。

抗原可以是同種(例如雞病毒來保護雞)類型或異種(例如火雞病毒來保護雞)類型。

本發明的疫苗或組合物可包含活抗原、合成抗原、其片段或部分片段(fragments)或部分(fractions)的組合。所述組合物還可包含來自各種各樣病原體的抗原，以提供廣泛的免疫反應。

根據本發明，抗原可以是(源自)導致常見疾病的病毒，所述常見疾病如由g.d.butcher、j.p.jacob和f.b.mather(ps47,veterinarymedicine-largeanimalclinicalsciencesdepartment,floridacooperativeextensionservice,instituteoffoodandagriculturalsciences,universityofflorida；1999年5月)所描述的，例如為禽痘、紐卡斯爾病、傳染性支氣管炎、鵪鶉支氣管炎、造淋巴細胞組織增生、馬雷克病、傳染性粘液囊病、傳染性喉氣管炎、產蛋下降症候群、reovirosis、傳染性腱鞘炎、禽腦脊髓炎、腫頭症候群、火雞鼻氣管炎或禽流感；源自導致支原體病、巴斯德氏菌病、沙門氏菌病、鮑特桿菌病等的細菌；和/或源自導致球蟲病、彎曲桿菌病的其它禽類寄生蟲。在本發明的疫苗組合物中使用的優選疫苗包括完整的減毒活病毒株。

優選的抗原是細胞病原體或源自細胞病原體，尤其源自細菌或真菌，例如胸膜肺炎放線桿菌(actinobacciluspleuropneumoniae)、多殺巴斯德氏菌(pasteurellamultocida)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)、化膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、大腸桿菌(e.coli)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀菌屬(shigella)、耶爾森菌屬(yersinia)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、梭菌屬(clostridium)、弧菌屬(vibrio)和賈第蟲屬(giardia)、內阿米巴屬(entamoeba)和隱孢子蟲屬(cryptosporidium)。

在特別的實施方式中，至少一種抗原包含細菌細胞，優選活細菌、減毒細菌或滅活細菌。在本發明的上下文中，細菌細胞可包括全細胞、細胞亞部分(sub-fractions)或碎片或其團塊(pellets)。

在優選的實施方式中，細菌細胞是沙門氏菌屬細菌，優選選自以下菌株：腸炎沙門氏菌、肯塔基沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、海德爾堡沙門氏菌或其組合。更尤其，抗原包含數種不同的細菌細胞的組合，更優選沙門氏菌屬的不同菌株的組合，和/或其亞部分。在優選的實施方式中，抗原包含選自以下的至少兩種不同的沙門氏菌細胞：腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和肯塔基沙門氏菌。

佐劑

如所指出的，本發明將wow製劑與佐劑化合物組合。wow製劑和佐劑均發揮佐劑活性，當wow製劑和佐劑根據本發明組合時，其令人驚訝地提供協同效應。

在本發明的上下文中，另外的佐劑是可促進或刺激對抗原的免疫反應的任何化合物。

佐劑的非限制性實例包括蛋白質、多肽、肽、核酸(例如寡核苷酸)、糖、毒素、脂質、合成分子或鹽(例如鋁鹽)。佐劑的更具體的實例包括增強免疫系統對抗原的反應的化學和多肽免疫刺激劑。此類佐劑可包括例如氫氧化鋁、磷酸鋁、細胞因子、淋巴因子、粘附分子、細菌毒素、幾丁質衍生物和殼聚糖等。

目前，鋁鹽與抗原作為鋁沉澱的疫苗和作為鋁吸附的疫苗使用。作為鋁鹽的實例，可引用氫氧化鋁。

在優選的實施方式中，另外的佐劑是鋁鹽，優選氫氧化鋁。

在特別的實施方式中，佐劑是抗原-佐劑複合物，優選與額外量的如上定義的至少一種抗原組合。更優選地，佐劑是抗原-氫氧化鋁複合物。

wow乳液

術語「wow」指水包油包水乳液。水包油包水(wow)乳液是其中小的水滴或水泡(內水相)包埋在油性顆粒(油相)內，所述油性顆粒分散在連續水相(外水相)中的乳液。wow乳液產生自其中水相被加入到油相中的初級乳液，隨後其中油相分散在水相中的至少一種二級乳液。如圖1中所闡述的，本發明的特別wow乳液或組合物通常包含對應於由第一表面活性劑膜包圍的水泡或小水滴的內水相、由第二表面活性劑膜包圍的油相、和外水相。

典型的wow組合物是顆粒組合物，其包含包埋在油性顆粒中的水泡，所述油性顆粒分散在外水相中。

優選地，抗原或其部分(fraction)含於包埋或封裝在油性泡中的內水相中，且另外的佐劑化合物在外水相中。在優選的實施方式中，外水相包含一小部分(afractionof)所述至少一種抗原和所述另外的佐劑，優選處於抗原-佐劑複合物的形式。根據優選的實施方式，組合物中抗原總量的約75％在油性泡中，且組合物中抗原總量的約25％在外水相中，其任選地與佐劑化合物複合。

wow乳液可具有各種各樣的尺寸/分布特性。然而，在優選的實施方式中，油性顆粒的尺寸在1至40μm、更優選3至30μm、甚至更優選3至20μm、最優選5至20μm。顆粒的尺寸通常指其直徑。本發明的確顯示，此類尺寸範圍一經體內施用提供最佳的免疫效力。

更尤其，在本發明的優選wow組合物中，至少80％的油性顆粒具有小於20μm的尺寸，更優選至少85％、甚至更優選至少90％的油性顆粒具有小於20μm的尺寸。另外，在優選的實施方式中，至少5％、優選約10％的油性顆粒具有等於或小於10μm的尺寸，優選5至10μm的尺寸。本發明的最優選組合物具有這樣的油性顆粒的分布輪廓：至少90％的油性顆粒具有小於或等於20μm的尺寸並且至少10％具有小於10μm的尺寸(例如d10≤10μm且d90≤20μm)。本發明顯示，具有此類尺寸和分布輪廓，可產生針對細菌抗原的特別強的免疫反應。

油

用於本發明的wow乳液中的合適的油非限制性地包括植物油、動物油和礦物油、或它們的混合物。

植物油的實例非限制性地包括椰子油、玉米油、棉籽油、橄欖油、棕櫚油、花生油、菜籽油、低芥酸菜子油、紅花油、芝麻油、大豆油(soybeanoil)、葵花油、芥子油、羊毛脂油、杏仁油、摩洛哥堅果油、蓖麻油、澳洲堅果油、腰果油、榛子油、蒙剛果(mongogonut)、胡桃油、開心果、核桃油、紅厚殼油(calophyllumoil)、鱷梨油、大豆油(soyaoil)、荷荷巴油、或其混合物。

動物油的實例非限制性地包括魚油、海龜油、貂油、雞脂肪油、鯨油、抹香鯨油、海豹油、鱈魚肝油、鴯鶓油、氫化角鯊烯(或全氫角鯊烯)、或其一種或更多種混合物。

礦物油的實例非限制性地包括石蠟油例如石蠟和異鏈烷烴、凡士林油、drakeol或輕質礦物油5號。

在特別的實施方式中，本發明的wow乳液和油性顆粒包含一種或數種油，其優選選自植物油、動物油和礦物油、或其混合物。優選地，wow乳液和油性顆粒包含至少一種礦物油。

表面活性劑

在優選的實施方式中，本發明的wow乳液進一步含有至少一種表面活性劑。通常，在為製劑提供適當的親水-親脂平衡(hlb)的條件下選擇、或組合或使用一種或更多種表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合的hlb是其親水或親脂的程度的度量，如griffin所述的(journalofthesocietyofcosmeticchemists,1949,1(5),311-26和journalofthesocietyofcosmeticchemists,1954,5(4),249-56)，通過計算分子的不同區域的值來確定。

最優選地，在第一乳液中使用的表面活性劑或表面活性劑的組合具有低的hlb值(通常在4至7、優選為約6.0)，且在第二乳液中使用的表面活性劑或表面活性劑的組合具有高的hlb值(通常在7至15，優選為約10.5)。

在乳液疫苗中使用的表面活性劑的實例非限制性地包括失水山梨糖醇單油酸酯(司盤80)、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)、失水山梨糖醇倍半油酸酯(司盤83)、卵磷脂和失水甘露糖醇單油酸酯(mannidemonooleate)、或它們的混合物。

優選地，本發明的wow乳液包含至少一種選自聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯和失水山梨糖醇單油酸酯的表面活性劑。更優選地，在第一wo乳液中使用的表面活性劑是司盤80和吐溫80的組合，並且在第二ow乳液中使用的表面活性劑是吐溫80。

鹽

本發明的疫苗和組合物任選進一步包含一種或數種鹽。鹽的加入可抑制水滲透進入油性顆粒中並且進一步使油性顆粒穩定。

此類鹽的實例非限制性地包括氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉或硫酸鎂。在特別的實施方式中，所述鹽是氯化鈉。

防腐劑

本發明的組合物可進一步包含一種或更多種獸醫領域中可接受的防腐劑。合適的防腐劑的實例非限制性地包括：

-酸，例如苯甲酸、山梨酸、和其鈉鹽或鉀鹽；

-酯，例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯；

-醇，例如氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、苯氧基乙醇、苯酚，例如氯甲酚和鄰苯基苯酚；

-含汞化合物，例如硫柳汞、硝甲酚汞、硝酸苯汞和乙酸苯汞；

-季銨化合物，例如苯扎氯銨和氯化十六烷基吡啶鎓。

在優選的實施方式中，防腐劑是硫柳汞溶液，通常為10％硫柳汞溶液。

製備的方法

可使用本領域中本身通常已知的技術來生產本發明的組合物。然而優選地，該方法包括形成wow乳液的第一步驟和將所述wow乳液與另外的佐劑化合物混合的第二步驟。

更尤其，本發明的疫苗可通過包括以下步驟的方法得到：

a)將所述至少一種抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(wo)乳液，

b)將所述wo乳液加入到分散相中，由此形成wow乳液，並乳化所述wow乳液，和

c)將所述wow乳液與另外的佐劑混合，所述另外的佐劑優選與額外量的所述至少一種抗原組合。

因此，本發明的進一步的目的在於用於製備包含至少一種抗原和另外的佐劑的組合物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將所述至少一種抗原的溶液在油基中乳化，由此形成油包水(wo)乳液，

b)將所述wo乳液加入到分散相中，由此形成wow乳液，並乳化所述wow乳液，和

c)將所述wow乳液與另外的佐劑混合，所述另外的佐劑優選與額外量的所述至少一種抗原組合。

在特別的實施方式中，步驟a)的油基包含如上定義的一種或數種油和至少一種表面活性劑。優選地，油基包含礦物油、以及司盤80和吐溫80的組合。更優選地，表面活性劑或表面活性劑的混合物提供4至7、優選約6.0的hlb。

在另一個特別的實施方式中，步驟b)的分散相包含去離子水和至少一種表面活性劑(優選吐溫80)。在特別的實施方式中，分散相進一步包含如上定義的鹽和/或防腐劑。優選地，分散相包含去離子水、氯化鈉、吐溫80和硫柳汞溶液。尤其，表面活性劑(例如吐溫80)或表面活性劑的混合物提供7至15(優選約10.5)的hlb。

在另一個特別的實施方式中，步驟c)中的另外的佐劑例如為如上定義的。優選地，另外的佐劑是或包含氫氧化鋁，其優選與額外量的所述至少一種抗原組合。

乳化步驟可通過多級乳化劑組(multistageemulsifierset)來運行，在所述多級乳化劑組中確定循環的參數，以獲得具有預定的尺寸的油性顆粒。

在特別的實施方式中，以非常高的每分鐘轉數(rpm)(優選15000至30000rpm，更優選20000至25000rpm，通常約22000rpm)持續至少一個循環，優選持續三個循環將所述至少一種抗原的溶液在油基中乳化。然後將乳液加入到所述分散相中，並在低的rpm(優選1000至6000rpm，更優選2000至5000rpm，通常約3000rpm)下乳化，持續至少一個循環，優選持續兩個循環，更優選持續三個循環。任選地，在中等的rpm(優選5000至15000rpm，更優選8000至12000rpm，通常約10000rpm)下實施另外的循環。

此類特別的工藝條件允許獲得負載有至少一種抗原的油性顆粒，所述油性顆粒具有如上定義的尺寸分布輪廓(distributionprofile)，優選約10％的顆粒(d10)具有<10μm(優選5至10μm)的尺寸，並且約90％的顆粒(d90)具有0.7，且圖2b：對於肝/脾、盲腸和卵巢，保護se功效>75％)。

對於sq和im途徑兩者，所有內臟的95％置信下限值都大於0，這是統計學上顯著的證據，用通過sq和im途徑施用的疫苗a對雞進行接種有效地減少所述內臟器官的se攻擊菌株定殖。

2.針對鼠傷寒沙門氏菌(st)感染的保護

結果闡述於下表5以及圖3a和3b。

表5：使用疫苗a的再分離頻率(％)、預防分數和95％置信界限。

1cl＝置信界限

im:肌內

sq:皮下

n/a:不適用

結果顯示：

通過sq或im途徑施用的疫苗a有效地減少和預防肝/脾和盲腸的st定殖。尤其，在肝/脾中獲得大於0.5的預防分數，這意味著在此類內臟中改進的保護功效。圖3a和3b還闡述了對於sq和im途徑兩者，在肝/脾(保護st功效>70％)和盲腸(保護st功效為40％)中改進的保護功效。

3.針對肯塔基沙門氏菌(sk)感染的保護

結果闡述於下表6和圖4中。

表6：對於盲腸使用疫苗a的再分離頻率(％)、預防分數和95％置信界限。

1cl＝置信界限

2一隻雞在攻擊後一天死亡，並從統計中排除。

3兩隻雞在攻擊之前死於敗血症。

4一隻雞死於球蟲感染且一隻雞由於充滿水的作物且沒有飼料而死亡。

im:肌內

sq:皮下

n/a:不適用

結果顯示：

通過sq或im途徑施用的疫苗a有效地減少和預防盲腸內的sk定殖。

尤其，通過im途徑獲得約0.64的預防分數，且通過sq途徑獲得大於0.4的預防分數。圖4還說明了使用sq和im途徑，該疫苗具有改進的針對sk的保護功效(保護sk功效>85％，圖4)。

4.針對海德爾堡沙門氏菌(sh)感染的保護

表7：使用疫苗a的再分離頻率(％)、預防分數和95％置信界限。

1cl＝置信界限

im:肌內

sq:皮下

n/a:不適用

結果顯示：

在通過sq途徑使用疫苗a進行接種的組中，來自內臟器官肝和脾的sh攻擊菌株的再分離百分率是13％，來自盲腸的sh攻擊菌株的再分離百分率是41％，且來自卵巢的sh攻擊菌株的再分離百分率是8％，在安慰劑組中分別是82％、69％和59％(圖5a)。對於所有三種組織，預防分數的95％置信下限大於零。因此，當通過sq途徑施用時，在所述內臟器官、盲腸和卵巢中疫苗a減少了sh感染。

在通過im途徑使用疫苗a進行接種的組中，來自內臟器官肝和脾的sh菌株的再分離百分率是19％、來自盲腸的sh菌株的再分離百分率是70％，來自卵巢的sh菌株的再分離百分率是14％(圖5b)。對於所述內臟器官和卵巢，預防分數的95％置信下限大於零。因此，當通過im途徑施用時，在所述內臟器官和卵巢中疫苗a減少了sh感染。

通過im或sq途徑施用的包含se-st-sk細菌的疫苗a令人驚奇地有效減少和預防接種疫苗的動物的內臟器官(肝/脾)和卵巢的sh感染。

e.疫苗組合物的安全性

通過計算小母雞中肌內注射位點反應，已經分析了疫苗a的安全性。在表8中定義評分方法。

表8

結果闡述於圖6中並且顯示了取決於沙門氏菌od/劑量，與簡單的wo乳液中的現有技術疫苗相比的疫苗a(se-st-sh)的平均反應得分。

在1.15和1.03seod/劑量下，簡單的wo乳液中的疫苗分別具有4.8和10.2的平均反應得分。

疫苗a獲得的平均反應得分是3.7，然而沙門氏菌od/劑量是約5倍濃縮(5.1)。

這些結果令人驚奇地顯示，本發明疫苗的肌內注射具有弱的平均反應得分，由此證明改進的安全性。