有機溶劑輔助peg修飾蛋白質藥物的方法

2023-05-18 07:52:51

專利名稱：有機溶劑輔助peg修飾蛋白質藥物的方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥領域，特別是涉及有機溶劑輔助聚乙二醇修飾蛋白質藥物的方法。
背景技術：
聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質藥物是利用聚乙二醇衍生物修飾劑共價修飾蛋白質或多肽等生物分子的過程，使製備長效生物藥物的有效手段。聚乙二醇具有良好的生物相容性、無毒性和無抗原性等優點，修飾後的蛋白和多肽類藥物的藥代動力學和藥效學性質能夠得到改善，獲得許多更有利於臨床應用的性質，包括更好的物理和熱穩定性、更強的抗蛋白水解酶降解能力、更好的溶解性、更低的清除率以及更好的藥效等。PEG修飾的蛋白常常是通過蛋白和適宜的PEG修飾劑進行反應得到的，根據蛋白氨基側鏈上不同的化學基團進行反應，如-NH2、-NH-, -COOH、-OH、-SH0選擇修飾劑還需要考慮蛋白活性，結構以及修飾劑性質等幾個方面。大部分蛋白藥物修飾反應主要是在氨基上進行，氨基修飾又分為隨機修飾和定點修飾。隨機修飾一般是在蛋白質賴氨酸的ε氨基上進行。由於蛋白鏈上通常存在多個賴氨酸殘基且通常位於蛋白表面，因此易與PEG修飾劑發生反應，反應迅速並且容易產生複雜的多修飾混合物。同時隨機修飾還容易發生在蛋白N端氨基和組氨酸的咪唑基上。這些隨機的PEG修飾劑通常包括SS-PEG、SC-PEG等，其中最為常用是SC-PEG。定點修飾目前主要包括N末端修飾和半胱氨酸殘基修飾。半胱氨酸修飾是利用修飾劑與蛋白分子的游離巰基發生反應進行，如MAL-PEG，因此半胱氨酸殘基定點修飾要求蛋白質分子有游離巰基。而N末端修飾是現在最為常見的另一定點修飾方式。N末端修飾通常是通過PEG-醛類修飾劑與一定量的還原劑如氰基硼氫化鈉進行的還原烷化過程。蛋白分子水溶液添加適當濃度的有機溶劑後結構性質往往會發生變化，因此有機溶劑有時可作為蛋白分子變性劑。但有機溶劑也可能增加一些蛋白分子的穩定性， Richard K 等(Enzyme and MicrobialTechnology, 1989,11 (9) :568-574)指出在一種有機相-水相中10種微生物蛋白和中性蛋白酶的熱穩定性高於水相，John F.等(Genet, mol. Res. ,2006,5(2) =350-372)研究蛋白熱穩定時發現在水-乙醇混合體系中，乙醇在低溫下所起的作用是一種天然核糖核酸酶的穩定劑。雖然有機溶劑可能造成蛋白分子沉澱失活，但有時也會對蛋白分子的化學反應產生有利影響，Mirtha M.等(Biotechnology and Bioengineering, 1991,37(10) :967-972)證明在水溶液中加入15%左右的二甲基甲醯胺有機溶劑木瓜酶的催化活性達到最大,KAZUHIK0 HAYASHIDA等(Journal of Fermentation andBioengineering, 1992, 73 (3) =239-240)發現環糊精葡萄糖基轉移酶催化反應生成環糊精過程中添加小分子有機溶劑能大幅提高產率。HUANGXiaohong等(Chin J Appl Environ Biol, 2005,11 (1) :71-73)證明低濃度的乙醇，丙醇，甘油等提高殼多糖酶活性。目前PEG修飾反應普遍是在水相中進行，常用的PEG為與氨基反應的PEG，通過和蛋白藥物的氨基進行反應生成穩定的酯鍵。但它的主要問題在於水解速度快，不利於控制反應，PEG也會與蛋白賴氨酸上的氨基反應，產生許多異構體，而蛋白藥物要求為均一的單修飾產物。員強等證明在PH7. 6時，SC-mPEG的半衰期約為5分鐘，經測定，PEG的水解半衰期隨著有機溶劑的加入及濃度的提高而變長，有利於控制反應。同時聚乙二醇具有親水性和親脂性，加入適宜有機溶劑能夠改善PEG的性質，提高修飾效率及降低成本。重組人幹擾素β Ib通過目前最常用的表達系統-大腸桿菌進行表達(USpatent 4,518,584)。通過 Lin 等(Methods Enzymol. 1986,119 :183-192)的方法進行純化。國外採用IFNlb治療某些疾病，例如性疣、C型肝炎及相關肝癌，美國食品和藥物管理局(FDA) 已於1993年批准IFNi3 Ib用於治療多發性硬化症。但該蛋白體內半衰期短，易被酶水解和腎臟清除，需要多次注射，給患者帶來了很大不便，且重複注射也會引起不良反應。重組人 β Ib幹擾素在小鼠體內注射半衰期為1. lh，Katre等(US patent 4，917，888)用聚乙二醇修飾劑mPEG-SC5000對該蛋白進行修飾並用S印hacryl-200凝膠過濾得到單修飾產物，使半衰期提高 5 倍，Amartya Basu 等(BioconjugateChem，2006，17 ( :618-630)用分支型 40K mPEG-NHS對β Ib進行修飾同時用Superdex 200 high load凝膠過濾柱得到單修飾產物， 半衰期達到9. 4h。複合幹擾素(Consensus Interferon)是一種重組的非自然存在的I型幹擾素，含 166個胺基酸殘基，等電點為5. 4，理論分子量為19 600，20世紀80年代實現在基因工程菌中的表達。它具有抗病毒、抗增殖、天然殺傷細胞(NK)激活和基因誘生活性，主要用於C型肝炎治療，但同樣存在分子量小，易被腎臟清除，體內半衰期短等缺點。Yun QCJoumal of C hemicalTechnology&Biotechnology, 2006,81 (5) :776-781)等對其進行修飾，極大改善了它的藥代動力學性質。

發明內容
本發明的目的在於提供一種有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法。為實現上述目的，本發明提供的有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，主要步驟為非特異氨基修飾將在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子加入緩衝液I進行溶解，調節PH至7-9，加入聚乙二醇修飾劑，蛋白和聚乙二醇修飾劑摩爾比為1 1-1 10; 所述緩衝液I為0. 02-0. 2mol/L Tris-Cl或磷酸鹽緩衝液(PB)，10-30%有機溶劑，pH7_9， 恆溫狀態下，4°C -37°C進行修飾；或N端氨基修飾將在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子加入緩衝液II進行溶解，調節PH至4-6，加入聚乙二醇修飾劑，蛋白和修飾劑摩爾比為1 1-1 10;所述緩衝液II為0. 02-0. 2mol/L NaAc-HAc或磷酸鹽緩衝液，10_30%有機溶劑，pH4_6，恆溫狀態下， 40C -37 °C進行修飾。所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中非特異氨基修飾所用的聚乙二醇修飾劑為 mPEG-SC5000、mPEG-SClOOOO、mPEG_SC20000、mPEG_SC30000、mPEG_SC40000 或Y-shapemPEG-NHS40000 ；N端氨基修飾所用聚乙二醇修飾劑為mPEG_ALD20000、 mPEG-ALD30000,mPEG-ALD40000 或 Y-shapemPEG_ALD40000。所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中修飾時間為3- 小時。所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中修飾後的蛋白採用凝膠過濾層析法進行單修飾產物純化，層析柱為Hiload superdex 20016/60 prep grade層析柱，流動相為0. 05-0. 2mol/L Tris-HCl或磷酸鹽緩衝液，0_20%有機溶劑，pH6_8。所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子為重組人幹擾素β Ib或重組人複合幹擾素或重組人幹擾素α 2b。所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中所用有機溶劑為甲醇、乙醇、 異丙醇、乙腈、丙酮或四氫呋喃。本發明的有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，可以增加蛋白藥物穩定性， 提高單修飾率，減少修飾劑量，降低成本且操作簡單。


圖1為本發明修飾結果與水相修飾結果比較的SDS-PAGE電泳圖，M為分子量 marker (從小到大依次為 14. 3kD，20. lkD，29kD，44. 3kD，66. 4kD，97. 2kD，116kD)，l 為重組人幹擾素β Ib原蛋白，2為實施例一非特異氨基修飾水相修飾對照，3為實施例一有機溶劑輔助非特異氨基修飾新方法修飾結果，4為實施例二 N端氨基修飾水相修飾對照，5為實施例二有機溶劑輔助N端氨基修飾新方法修飾結果，6為PEG20K單修飾蛋白。圖2為修飾前後蛋白凝膠過濾層析圖；圖3為本發明純化的重組幹擾素β Ib單修飾蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖中M為分子量 marker (從小到大依次為 14. 3kD，20. lkD，29kD，44. 3kD，66. 4kD，97. 2kD, 116kD)，1 為重組人幹擾素β Ib原蛋白，2為PEG修飾後的未修飾蛋白與修飾蛋白混合物，3為修飾後再純化的單修飾蛋白。
具體實施例方式本發明的有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，是將蛋白質藥物用含有機溶劑的緩衝液I和緩衝液II進行溶解，溶解後調節PH至適宜值，預熱後再加入PEG修飾劑恆溫進行反應，反應一段時間後再用緩衝液III通過凝膠過濾純化得到單修飾產物。純化後的單修飾蛋白具有活性。具體地說，本發明的修飾蛋白質分子的方法如下1)非特異氨基修飾將製得的重組人幹擾素β Ib或重組人複合幹擾素或重組人幹擾素α 2b加入緩衝液I (0. 02-0. 2mol/L Tris-Cl (或磷酸鹽緩衝液)，10-30%乙醇(甲醇或異丙醇或乙腈)，PH7-9)進行溶解，稀釋至適宜蛋白濃度，調節pH至7-9，加入一定比例的聚乙二醇修飾劑，包括 mPEG-SC5000，mPEG-SC10000, mPEG-SC20000, mPEG-SC30000, Y-shapePEG-NHS 40000，蛋白和修飾劑摩爾比為1 1-1 10;幻N端氨基修飾將製得的重組人幹擾素β Ib或重組人複合幹擾素或重組人幹擾素α 2b，加入緩衝液II (0.02-0. 2mol/L NaAc-HAc (或磷酸鹽緩衝液)，10-30%乙醇(甲醇或異丙醇或乙腈)，PH4-6)進行溶解，稀釋至適宜蛋白濃度，調節pH至4-6，加入一定比例的聚乙二醇修飾劑，包括 mPEG-ALD5000，mPEG-ALD 10000, mPEG-ALD20000, mPEG-ALD30000, mPEG-ALD40000, Y-shape PEG-ALD40000和過量的氰基硼氫化鈉，蛋白和修飾劑摩爾比為 1 1-1 10 ；3)加入修飾劑後，在恆溫狀態下，4°C _37°C，置於水浴中進行修飾，修飾時間從3h-24h ；4)對修飾後蛋白進行電泳鑑定，分析修飾率並與不添加有機溶劑的水相修飾方法進行比較；5)用凝膠過濾層析法對修飾後蛋白進行單修飾產物純化，用緩衝液 111(0. 05-0. 2mol/L Tris-HCl (或磷酸鹽緩衝液)，0-20% (甲醇或乙醇或異丙醇或乙腈)， PH6-8 ；)作為流動相；6)純化後蛋白進行純度及活性檢測。以下結合附圖舉實施例作進一步說明，實施例中是以重組人幹擾素β lb、重組人複合幹擾素以及重組人幹擾素α 2b為例採用有機溶劑輔助方式對蛋白質分子進行修飾； 實際操作中，有機溶劑可以是甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、丙酮或四氫呋喃中的一種，均能達到修飾的目的，為簡明起見，實施例中只給出了乙醇。實施例一重組幹擾素β Ib的修飾非特異氨基修飾用5ml緩衝液I (50mM/LPB，20 %乙醇，pH8)溶解重組人幹擾素 β lb 5mg至lmg/ml，調節pH至7. 8，取Iml置於1. 5ml離心管中，15°C水浴中放置30分鐘以上，再加入mPEG-SC20000，修飾劑與蛋白摩爾比為1 2，在10秒內迅速溶解修飾劑並充分振蕩混合均勻，再迅速置於15°C水浴中反應16小時。水相修飾對照用5ml緩衝液I (50mM/LPB，pH8)溶解重組人幹擾素β lb 5mg至 lmg/ml，調節pH至7. 8，取Iml置於1. 5ml離心管中，15°C水浴中放置30分鐘以上，再加入 mPEG-SC20000，修飾劑與蛋白摩爾比為1 2，在10秒內迅速溶解修飾劑並充分振蕩混合均勻，再迅速置於15°C水浴中反應16小時。實施例二N末端氨基修飾用5ml緩衝液II (50mM/LPB，20%乙醇，pH 5. 2)溶解重組人幹擾素β lb 5mg至lmg/ml，調節pH至5. 2，取Iml置於1.5ml離心管中，15°C水浴中放置30min 以上，再加入mPEG-ALD20000粉末，修飾劑與蛋白摩爾比分別為1 2，同時加入10倍PEG 摩爾量的氰基硼氫化鈉，在10秒內迅速溶解修飾劑並充分振蕩混合均勻，再迅速置於15°C 水浴中反應16小時。水相修飾對照用5ml緩衝液II (50mM/LPB, pH 5. 2)溶解重組人幹擾素beta Ib 5mg至lmg/ml，調節pH至5. 2，取Iml置於1. 5ml離心管中，15°C水浴中放置30min以上，再加入mPEG-ALD20000粉末，修飾劑與蛋白摩爾比分別為1 2，同時加入10倍PEG摩爾量的氰基硼氫化鈉，在10秒內迅速溶解修飾劑並充分振蕩混合均勻，再迅速置於15°C水浴中反應16小時。實施例三SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析比較單修飾率採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析實施例一和實施例二的修飾後樣品，通過測定被修飾的單修飾蛋白在總蛋白中所佔比例來確定單修飾率。以此來比較在同樣修飾條件下，添加和不添加有機相的修飾效率。由圖1可知添加有機相單修飾率明顯高於不添加有機相的樣品。實施例四
凝膠排阻色譜法純化修飾後單修飾產物用Hiload Superdex200 16/60prep grade預裝凝膠過濾柱在AKTA purifier蛋白純化儀上進行單修飾產物純化，流動相為 50mMPB,pH7. 0，平衡1個柱體積以上，上樣1ml，流速lml/min，紫外檢測^Onm，收集洗脫峰， 再通過50mMPB，pH7. O溶液透析去除SDS等小分子幹擾物質。圖2為修飾前後蛋白凝膠過濾層析圖。實施例五單修飾產物純度分析SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法對純化後的單修飾產物進行電泳分析。由圖3可知洗脫峰在相應位置只有一條帶，純度達到電泳純。實施例六單修飾產物生物活性分析採用VSV攻擊的Wish細胞病變法。WISH細胞形成單層後，加不同濃度的幹擾素處理，對照組用營養液代替，37°C培養24h後傾去幹擾素，加病毒VSV攻擊，37°C繼續培養，待對照細胞完全病變後判斷結果。測出修飾前原蛋白活性約為2.49X 107IU/mg，而單修飾產物活性約為1.62X 107IU/mg。
權利要求
1.一種有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，主要步驟為非特異氨基修飾將在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子加入緩衝液I進行溶解，調節PH至7-9，加入聚乙二醇修飾劑，蛋白和聚乙二醇修飾劑摩爾比為1 1-1 10; 所述緩衝液I為0. 02-0. 2mol/L Tris-Cl或磷酸鹽緩衝液，10-30%有機溶劑，pH7_9，恆溫狀態下，4°C -37°C進行修飾；或N端氨基修飾將在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子加入緩衝液II進行溶解， 調節PH至4-6，加入聚乙二醇修飾劑，蛋白和修飾劑摩爾比為1 1-1 10;所述緩衝液 II為0. 02-0. 2mol/L NaAc-HAc或磷酸鹽緩衝液，10_30%有機溶劑，pH4_6，恆溫狀態下， 40C -37 °C進行修飾。
2.根據權利要求1所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中，非特異氨基修飾所用的聚乙二醇修飾劑為 mPEG-SC5000、mPEG-SC10000、mPEG-SC20000、mPEG-SC30000、 mPEG-SC40000 或 Y-shape mPEG_NHS40000 ；N 端氨基修飾所用聚乙二醇修飾劑為 mPEG-ALD20000、mPEG-ALD30000、mPEG-ALD40000 或 Y-shape mPEG_ALD40000。
3.根據權利要求1所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中，修飾時間為 3-24小時。
4.根據權利要求1所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中，修飾後的蛋白採用凝膠過濾層析法進行單修飾產物純化，層析柱為Hiload superdex 200 16/60 prep grade層析柱，流動相為0. 05-0. 2mol/LTris-HCl或磷酸鹽緩衝液，0-20%有機溶劑， pH6-8。
5.根據權利要求1所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中，在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子為重組人幹擾素β Ib或重組人複合幹擾素或重組人幹擾素 α 2b。
6.根據權利要求1所述有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，其中，所用有機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、丙酮或四氫呋喃。
全文摘要
一種有機溶劑輔助PEG修飾蛋白質藥物的方法，主要步驟為將在含有機溶劑的溶液中穩定的蛋白質分子加入緩衝液進行溶解，調節pH值，加入聚乙二醇修飾劑，恆溫狀態下，4℃-37℃進行修飾；通過凝膠過濾純化得到單修飾產物。純化後的單修飾蛋白具有活性。本發明的優點在於增加蛋白藥物穩定性，提高單修飾率，減少修飾劑量，降低成本且操作簡單。
文檔編號A61P1/14GK102309764SQ20101022715
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者劉永東, 彭飛, 胡濤, 蘇志國 申請人:中國科學院過程工程研究所