一種大腸桿菌k88的快速檢測方法
2023-05-18 16:57:56
專利名稱：一種大腸桿菌k88的快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸桿菌K88的快速檢測方法，尤其是涉及一種利用大腸桿菌 K88菌毛蛋白適配體對大腸桿菌K88進行快速檢測的方法。
背景技術：
環境、食品攜帶病原菌致病是當今世界上最為普遍的問題之一。在環境衛生不良的情況下，大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia co/i)常隨 糞便散布在周圍環境中，若在水和食品中檢出大腸桿菌，可認為是被糞便汙染的指標，從而 證明可能有腸道病原菌存在。因此，大腸菌群數或大腸菌值常作為飲水和食物或藥物的衛 生學標準。大腸桿菌為人和動物腸道中的常居菌，一般多數不致病，但在一定條件下可引起 腸道外感染。大腸桿菌菌毛株含有特定的菌毛蛋白，與細菌對宿主上皮細胞的吸附起到至 關重要的作用。它們大多數能產生耐熱腸毒素與不耐熱腸毒素黏附於小腸黏膜上皮並定居 繁殖產生腸毒素導致嚴重腹瀉、脫水最後衰竭死亡。應用傳統的檢測方法檢測大腸桿菌整個過程需要48_72h。利用快速檢測技術與富 集培養基技術相結合，能使整個過程所需時間減少如利用大多數大腸桿菌血清型的運動 性能發展的選擇運動性富集技術，預富集和選擇富集的結合技術；阻抗微生物學技術；利 用過濾、離心和超聲波從食品和競爭菌中移去目標菌並濃縮到一個小體積中的分離濃縮技 術。免疫學技術構成了最大一類選擇性技術，它們包括螢光抗體技術，ELISA技術。為了增 加目標抗原量達到檢測水平105-107cfU/ml，大多數市場可獲得的ELISA方法均結合了傳 統的預先和後選擇富集培養基方法，整個檢測過程還是需要24-56h。而核酸檢測方法涉及 DNA雜交和PCR技術，也包括菌落雜交，水溶液中單相雜交和幾種商業PCR檢測試劑盒，它 們的檢測下限為10°-102cfu/ml。從整體水平看，傳統的檢測技術要求低，不需要特殊的儀器，並且價廉。但最大的 缺點是耗時費力。選擇性技術明顯克服了傳統方法的缺點，但富集過程複雜並且要求熟練 工人操作，而且由於要得到一個陽性結果需要較高數量的目標菌，也不能在一天內得到結 果。總之，現在還沒有一種理想的技術用於檢測環境中的大腸桿菌。
發明內容
本發明的目的在於克服現有大腸桿菌K88檢測技術存在的缺陷，提供一種靈敏度 高，設備簡單，操作簡便的大腸桿菌K88的快速檢測方法。本發明之大腸桿菌K88快速檢測方法的技術方案是
研究表明，適配體(Aptamers )是能夠與許多目標分子(包括蛋白、藥物、無機或有機分 子等)發生高親合性和特異性結合的一類單鏈核苷酸(DNA or RNA)，長度通常在30-70核 苷酸之間，能藉助自身的摺疊能力形成一個複雜的具有結合能力的口袋和溝糟三維結構， 將小分子結合到它們的核酸結構中或者整合到大分子結構中，具有pmol的解離常數。至今發現高親和特異性適配體的方法是配體指數富集系統展開(SELEX)。與抗體比較，適配體優 勢在於其大小和非蛋白質特性，並且在許多方面呈現較強的化學特性和生物學特性。最大 的優勢是不需要使用動物生產並可用體外方法分離製備。也可用化學合成生產、修飾，以提 高它們的穩定性、親合性、特異性、抗變性能力和壽命。本發明技術方案的原理是大腸桿菌K88菌毛蛋白的適配體能特異性的識別大腸 桿菌K88，標記有螢光基團(FAM)的適配體與大腸桿菌K88結合後，適配體上的螢光信號通 過螢光分光光度計捕捉，根據螢光信號的有無可以進行大腸桿菌K88的定性檢測，根據不 同的螢光強度，可以實現對大腸桿菌K88的定量檢測。 應用大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體檢測大腸桿菌K88的具體方法，包括以下步 驟
(1)選擇生化方法合成並完成螢光修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體5』端螢光基 團修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體，其基因序列是
將上述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體用滅菌的超純水溶解，使濃度為5 μ Μ, -20°C保 存；使用之前，90-95°C處理5-10 min，置於冰上冷卻至室溫，使之變性；
(2)製備已知濃度的檢測體系將1-3ml大腸桿菌K88接種於200_500ml LB培養基 中，35-37°C 180-200rpm培養26-32h後，進行平板計數，求出每毫升大腸桿菌的數目；按比 例稀釋成 102、IO3UO4 UO5 UO6 UO7 UO8、109cfu/ml 8 個濃度；各濃度各取 500 μ 1 至 EP 管中，6000-8000g離心10-20分鐘後棄上清，每個EP管中加100-200 μ 1磷酸緩衝液(所述 磷酸緩衝液簡稱「PBS」，市場有銷售)懸浮菌體；
(3)將此大腸桿菌Κ88菌毛蛋白適配體與待測細菌結合在所述8個盛有不同濃度大 腸桿菌Κ88溶液的EP管中分別加入50 μ 1大腸桿菌Κ88菌毛蛋白適配體，再加入磷酸緩衝 液使終體積為500μ 1，37°C孵育l-2h後6000-8000g離心10-20min，棄上清；再分別加入 500-1000 μ 1 PBS吸打混勻8000g IOmin棄上清；重複3次，結合了適配體的菌體沉澱懸 浮於500 μ 1磷酸緩衝液中待用；
(4)用大腸桿菌Κ88菌毛蛋白適配體檢測大腸桿菌Κ88，測定螢光值，繪製標準曲線 分別將8個EP管中的溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計測定450nm激發波長時 520nm發射波長的螢光值；根據大腸桿菌K88濃度的對數值相應的螢光值繪製標準曲線；
(5)製備待測樣品檢測體系，測定待測樣品的螢光值製備樣品檢測體系取 500-1000 μ 1 樣品 6000-8000g 離心 10-20 min，棄上清；沉澱懸浮於 100-200 μ 1 PBS 中， 加入50 μ 1適配體至終體積500 μ 1 ；再加入磷酸緩衝液使終體積為500μ 1，37°C孵育 l-2h後6000-8000g，離心10-20min，棄上清；再加入500-1000 μ 1磷酸緩衝液吸打混勻， 6000-8000g離心10-20min棄上清；重複3次，結合了適配體的菌體沉澱懸浮於500 μ 1磷 酸緩衝液中待用；將溶液置於石英比色皿中，將溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計 測螢光值；
(6)根據測得的待測樣品的螢光值，查大腸桿菌Κ88濃度的對數值與對應的螢光值標 準曲線，即求得樣品中大腸桿菌Κ88的含量。本發明的優點靈敏度高，特異性強，操作簡便，適合測定含大腸桿菌Κ88的各種 試樣，在環境監測及食品分析等方面具有十分重要的意義。
圖1為本發明實施例測定大腸桿菌K88的螢光濃度圖譜(A，B, C, D, E, F, G, H分別代表著IO9UO8UO7 UO6 UO5UO4UO3UO2 cfu/ml的大腸桿菌K88的螢光值)。圖2為大腸桿菌K88濃度的對數值與對應的螢光值標準曲線。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步說明。(1)選擇由上海生工合成並完成螢光修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體5』端 螢光基團修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體，其基因序列是
將所述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體用滅菌的超純水溶解，使濃度為5 μ Μ, -20°C保 存；使用之前，95°C處理5 min，置於冰上冷卻至室溫，使之變性；
(2)製備已知濃度的檢測體系將Iml大腸桿菌K88接種於200mlLB培養基中， 370C 200rpm培養26h後，進行平板計數，求出每毫升大腸桿菌的數目；按比例稀釋成102、 IO3UO4 UO5 UO6 UO7 UO8、109cfu/ml 8個濃度；各濃度各取500 μ 1分別放於8個EP管 中，8000g離心10分鐘後，棄上清，每個EP管中加100 μ 1 PBS懸浮菌體；
(3)將所述5』端螢光基團修飾的大腸桿菌Κ88菌毛蛋白適配體與待測細菌結合在所 述8個盛有不同濃度大腸桿菌Κ88溶液的EP管中分別加入50 μ 1大腸桿菌Κ88菌毛蛋白 適配體，吸打混勻，再分別加入PBS使終體積為500 μ 1，37°C孵育Ih後8000g離心lOmin， 棄上清；再分別加入500 μ IPBS吸打混勻，SOOOg離心lOmin，棄上清；重複3次，結合了所 述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體的菌體沉澱懸浮於500 μ 1 PBS中，待用；
(4)用大腸桿菌Κ88菌毛蛋白適配體生物傳感器比色皿檢測大腸桿菌Κ88，測定螢光 值，繪製標準曲線分別將8個所述EP管中的溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計測 定450nm激發波長時520nm發射波長的螢光值(大腸桿菌Κ88的螢光濃度圖譜參見圖1)； 根據大腸桿菌K88濃度的對數值相應的螢光值繪製標準曲線(參見圖2)；
(5)製備待測樣品檢測體系，測定待測樣品的螢光值取500μ 1樣品SOOOg離心10 min，棄上清；沉澱懸浮於100 μ IPBS中，加入50 μ 1所述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體至終 體積500 μ 1 ；再加入PBS使終體積為500μ 1，37°C孵育Ih後8000g，離心lOmin，棄上清； 再加入500 μ IPBS吸打混勻8000g IOmin棄上清；重複3次，結合了適配體的菌體沉澱懸 浮於500μ1 PBS中；將溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計測定450nm激發波長時 520nm發射波長的螢光值；
(6)根據樣品測得的螢光值，查標準曲線，即可以求得樣品中的大腸桿菌K88的含量。驗證用本方法測定廢水樣品2份，用上述1-6步驟進行檢測，檢測結果是大腸杆 菌K88含量分別為3981 cfu/ml和501cfu/ml，證明本方法可靠。本發明實施例測定大腸桿菌K88的檢出限為102cfu/ml。
權利要求
一種大腸桿菌K88的快速檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)選擇生化方法合成並完成螢光修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體5』端螢光基團修飾的大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體，其基因序列是將所述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體用滅菌的超純水溶解，使濃度為5μM， 20℃保存；使用之前，90 95℃處理5 10 min，置於冰上冷卻至室溫，使之變性；(2)製備已知濃度的檢測體系將1 3 ml大腸桿菌K88 接種於200 500ml LB培養基中，35 37℃ 180 200rpm培養26 32h後，進行平板計數，求出每毫升大腸桿菌的數目；用滅菌的超純水按比例稀釋成102、103、104 、105 、106 、107 、108 、109cfu/ml 8個不同濃度溶液；各濃度溶液分別取500μl放於8個EP管中，6000 8000g離心10 20分鐘後棄上清，每個EP管中加100 200μl 磷酸緩衝液懸浮菌體；(3)將所述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體與待測細菌結合50μl所述大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體分別加入步驟(2)所述8個不同濃度的大腸桿菌K88溶液中吸打混勻，再加入磷酸緩衝液使終體積為500μl，37℃孵育1 2h後6000 8000g離心10 20min，棄上清；再分別加入500 1000μl PBS 吸打混勻， 8000g離心 10min 棄上清；重複3次，結合了大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體的菌體沉澱懸浮於500μl 磷酸緩衝液中待用；(4)用大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體檢測大腸桿菌K88, 測定螢光值，繪製標準曲線分別將所述8個EP管中的溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計測定450nm激發波長時520nm發射波長的螢光值；根據大腸桿菌K88濃度的對數值相應的螢光值繪製標準曲線；(5)製備待測樣品檢測體系，測定待測樣品的螢光值取500 1000μl樣品6000 8000g離心10 20 min，棄上清；沉澱懸浮於100 200μl PBS中，加入50μl大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體至終體積500μl；再加入磷酸緩衝液使終體積為500μl，37℃孵育1 2h後6000 8000g，離心10 20min，棄上清；再加入500 1000μl 磷酸緩衝液吸打混勻，6000 8000g離心10 20min 棄上清；重複3次，結合了大腸桿菌K88菌毛蛋白適配體的菌體沉澱懸浮於500μl 磷酸緩衝液中待用；將溶液置於石英比色皿中，用螢光分光光度計測螢光值；(6)根據測得的待測樣品的螢光值，查大腸桿菌K88濃度的對數值與對應的螢光值標準曲線，即求得樣品中大腸桿菌K88的含量。365275dest_path_image002.jpg
全文摘要
一種大腸桿菌K88的快速檢測方法，該方法是選擇標記螢光基團(FAM)的適配體與大腸桿菌K88結合後，適配體上的螢光信號得到捕捉；製備已知大腸桿菌K88濃度的被測體系，在激發波長455nm處測量發射波長nm的螢光值，繪製標準曲線，再製備待測樣品體系，根據其螢光值查對標準曲線，求得待測樣品中的大腸桿菌K88含量。本發明靈敏度高，特異性強，測定範圍寬，設備簡單，操作簡便，適合測定含大腸桿菌K88各種樣品中大腸桿菌K88含量，在環境監測及食品分析等方面具有十分重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/06GK101968447SQ20101029199
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者丁興華, 彭智輝, 李華, 鄧樂 申請人:鄧樂