一種水稻胚乳特異性表達啟動子及其應用的製作方法

2023-05-17 22:49:41 2

一種水稻胚乳特異性表達啟動子及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種水稻胚乳特異性表達啟動子，含有該啟動子的表達盒、植物表達載體、宿主菌和轉化子，並且本發明還涉及上述啟動子在植物轉基因工程中的應用。本發明提供的啟動子可以啟動外源基因在植物胚乳中特異性表達，適用於任何種子具有胚乳的植物，特別是單子葉植物或胚乳型雙子葉植物，尤其能夠驅動外源基因在稻米胚乳中特異性表達，因此可以用於提高和改善稻米的品質，從而培育出理想的、品質更加優良的稻米。
【專利說明】一種水稻胚乳特異性表達啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種水稻基因表達啟動子及其應用，該啟動子能夠在水稻轉基因調控體系中驅動目標基因在胚乳中表達。
【背景技術】
[0002]植物種子不僅貯存有作為人類和動物食用植物蛋白主要來源的大量蛋白質，而且植物種子還可用作生物反應器，用來生產在醫療和工業領域中具有重要價彳的蛋白質。其中，為了控制外源基因在轉基因植物種子中高效專一表達，尋找具有種子特異表達特性的啟動子或其相關調控序列具有重要意義。
[0003]啟動子是指基因中一段能準確有效起始轉錄的DNA序列，通常位於基因上遊。啟動子是基因表達調控的重要元件，它與RNA聚合酶及其它蛋白輔助因子等反式作用因子相互作用從而調控基因在轉錄水平的表達。近年來，隨著人們對種子特異性啟動子結構、功能的深入研究，發現了一系列 的種子特異性啟動子，為研究種子發育以及獲得外源基因僅在種子中特異表達的轉基因植物奠定了基礎。如張世平等研究發現水稻醇溶蛋白4a基因啟動子在轉基因水稻胚乳中特異表達；Hwang等將水稻球蛋白基因啟動子控制的溶菌酶基因導入水稻中，結果發現，溶菌酶在水稻種子中表達，並且表達的溶菌酶佔水稻種子中全部可溶性蛋白的13%左右；Datta等分離了一個水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子，並申請了專利保護；Qu等2004年將水稻26kDa的球蛋白啟動子和⑶S報告基因連接後導入水稻，經檢測GUS基因僅在種子胚乳中表達;Minic等研究發現擬南芥a -L-阿拉伯糖苷酶基因啟動子為胚乳特異性啟動子。
[0004]水稻是我國最重要的糧食作物，人們經常食用的大米即為水稻的胚乳。胚乳的形成和發育直接影響著水稻的產量和品質，同時胚乳也是一個優良的重組蛋白表達系統。通過生物技術和基因工程策略可以提高種子中稀有蛋白質、維生素和必需胺基酸的含量，提高稻米的營養價彳和改善稻米的品質，從而培育出品質更加優良的稻米。
[0005]如何實現外源基因在轉基因水稻中定點、定時、高效表達一直是轉基因育種工作者追求的目標。選用具有組織特異性、表達水平高的啟動子是實現外源基因在轉基因植物特定組織中高效表達的關鍵。在利用基因工程改良技術改良稻米品質的研究中，除了要具有優良的基因資源及相關的轉基因技術外，另一個重要的決定因素是要使相關基因能在水稻種子尤其是胚乳中高效特異地表達並積累基因產物。對此，使用胚乳特異性表達的啟動子來指導外源基因的表達是一個十分有效的途徑。例如，近年來培育成功的「黃金稻米」、「高鐵米」和「芝麻營養米」等都是使用了水稻本身來源的谷蛋白GluB-1等胚乳特異性高效表達啟動子。因此，分離並鑑定水稻胚乳特異性高表達啟動子是開展基因工程改良稻米品質的首要環節之一。
[0006]篩選和分離一些具有組織專一性、高表達水平的啟動子以及分析有關重要特異性調控元件的功能，在基因工程研究中有著廣泛的用途。胚乳是糧食作物營養的最重要組成部分，因此分離胚乳特異性強表達啟動子對植物品質的改良具有重要意義。

【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種驅動外源基因在水稻胚乳中特異性表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。其中，本文中所涉及的「植物」是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻。
[0008]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0009]一方面，本發明提供一種植物胚乳特異性表達啟動子，所述啟動子包含SEQ IDNo:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列為來源於日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)的水稻胚乳特異表達啟動子,本文中稱為pENPl或啟動子pENPl。
[0010]優選地,本發明提供的所述啟動子其序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者優選地,所述啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者進一步優選地，所述啟動子的核苷酸序列能夠與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交。這些啟動子序列與SEQID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅動目標基因在植物胚乳中特異性表達。
[0011]根據本發明的具體實施方案，本發明提供的啟動子的DNA序列為SEQID No:1所示的序列，即pENPl或啟動子pENPl。
[0012]另一方面，本發明還提供一種包含上述植物胚乳特異性表達啟動子的表達盒。
[0013]又一方面，本發明還提供一種重組載體，所述重組載體包含根據本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子；
[0014]優選地，所述重組載體為重組表達載體；進一步優選地，在所述重組表達載體中，本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子可操作地連接於待表達的基因序列的上遊。
[0015]根據本發明的具體實施方案，所述待表達的基因為Gus基因；所述重組表達載體為將SEQ ID No:1所示的序列即pENPl或啟動子pENPl構建與pCAMBIA1381中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1381-pENPl。
[0016]並且，本發明還提供一種宿主菌，所述宿主菌包含本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子、上述表達盒、或上述重組載體；優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0017]另一方面，本發明提供一種轉化子，所述轉化子包含本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子、上述表達盒、上述重組載體、或上述宿主菌。其中，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
[0018]再一方面，本發明提供上述植物胚乳特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。其中所述培育轉基因植物，是將本發明提供的上述植物胚乳特異性表達啟動子可操作地連接於待表達的基因序列上遊(例如，所述啟動子與目標基因融合)，並構建在重組表達載體中，經轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。待表達的基因即目標基因包括用於改良植物品質和積累的基因以及植物營養吸收相關的基因。
[0019]並且優選地，所述應用為用於改良植物胚乳性狀，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻；更優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1381-pENPl，以用於改良水稻胚乳形狀。
[0020]本發明的具體內容如下。[0021]本發明人從日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分離克隆得到結構包括轉錄起始位點在內的2091bp的DNA序列，並將其命名為pENPl (序列表中的SEQ ID No: 1，+1位置處為轉錄起始位點)。將該序列經酶切後連接到植物雙元表達載體PCAMBIA1381上，利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105，然後用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行組織化學檢測發現，轉基因植株整體上的Gus基因表達水平相對較低，僅在胚乳處顯藍色，從而證明該2091bp的序列具有驅動基因表達的活性，而且該啟動子驅動的Gus基因在水稻胚乳中特異性表達。
[0022]本發明所述的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，用於取代組成型啟動子。並且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連結，構建重組植物表達載體，經轉化後可驅動靶標基因在胚乳中的特異性表達，從而提高外源靶標基因在植物胚乳中的表達量，增加轉基因的效果，減輕外源靶標基因由於過量表達而對作物性狀的影響。
[0023]本發明的技術效果表明，所克隆的水稻啟動子pENPl能夠調控基因在胚乳中集中表達，在實際應用中具有顯著價彳。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，如通過該啟動子調控目標基因在胚乳中特異性表達，可以提高種子中稀有蛋白質、維生素和必需胺基酸的含量，提高稻米的營養價彳和改善稻米的品質，從而培育出品質更加優良的稻米。
[0024]因此，該啟動子在轉基因作物開發中，可以提高和改善稻米的品質，從而培育出理想的、品質更加優良的稻米，由於其具有在胚乳中特異性表達的特徵，可用其代替35S等組成型啟動子，從而培育出理想的生物安全性高的轉基因植物品種。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0026]圖1A-1B為將pENPl啟動子構建於pCAMBIA1381載體質粒中的示意圖，其中圖1A為pCAMBIA1381示意圖，圖1B為pCAMBIA1381_pENPl示意圖，其中示出了利用pENPl啟動子驅動位於其下遊的GUS基因表達；
[0027]圖2A-2C為利用pENPl啟動子驅動Gus基因表達的結果示意圖，示出了水稻各部位Gus染色結果，其中圖2A為Tnos::gus轉基因水稻植株，圖2B示出了正對照CaMV35S::gus轉基因水稻植株，圖2C示出了 pENPl::gus轉基因水稻植株，各圖中的A表示根，B表示莖，C表示葉，D表示葉鞘，E表示葉枕，F表示花，G表示種子，H表示胚乳橫切面；
[0028]圖3為酶切驗證的示意圖。
【具體實施方式】
[0029]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
[0030]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0031]實施例1含有酶切位點的pENPl啟動子的獲得
[0032]步驟1、引物的設計
[0033]根據NCBI中提供的水稻品種日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組序列，依據水稻PENPl基因的序列設計擴增引物，並根據選用的載體及靶標基因的特點，設計引物的酶切位點。
[0034]本實施例中以水稻雙元表達載體pCAMBIA1381(圖1A，來自於CAMBIA，公開使用載體，安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)為例，靶標基因為Gus基因，具體設計的引物為:正向引物(SEQ ID No:2) 5』端帶Hindlll，酶切位點(AAGCTT),反向引物(SEQ ID No: 3) 5』端帶E.coRI,酶切位點(GAATTC),引物序列如下:
[0035]正向引物:AAGCTTGTCGCTTCACCTACCGCCAAGTHindIII
[0036]反向引物:GAATTCATGACCGGACAAGCACCACCAC Ε.coRI由深圳華大基因公司合成。
[0037]步驟2、啟動子pENPl的獲得
[0038]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、正向引物擴增啟動子pENPl，按常規PCR體系，擴增程序採用如下:
[0039]95°C預變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，35 個循環；最後 72°C延伸 IOmin0 [0040]回收PCR擴增的目的片段，目的片段長度2091bp，連接到PGEM-T-Easy載體(購自Promega公司，按載體說明書中的比例混合)上,按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞後，經菌落PCR篩選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用HindIII和E.coRI進行雙酶切驗證，如圖3。經過鑑定的陽性克隆送交Invitrogen公司測序。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子pENPl,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0041 ] 實施例2植物表達載體的構建和農桿菌的轉化
[0042]從實施例1獲得的陽性克隆中提取質粒，用HindIII和E.coRI雙酶切，回收啟動子pENPl片段。同時HindIII和E.coRI線性化處理、回收pCAMBIA1381，將上述的兩個片段用T4連接酶(購於TaKaRa公司)進行連接，得到啟動子pENPl與Gus基因融合的植物表達載體pCAMBIA1381-pENPl (圖1B)，利用凍融法將表達載體轉入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 (安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)，提取陽性質粒，用HindIII和E.coRI進行酶切驗證如圖3。
[0043]對照:轉CaMV35S:gus作為正對照，同時以Tnos:gus作為負對照。利用凍融法將表達載體pCAMBIA1381轉入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105,操作步驟及驗證同pCAMBIA1381-pENPl的轉化方法。
[0044]實施例3利用啟動子pENPl驅動Gus報告基因在水稻中表達
[0045]步驟1:農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0046]成熟種子去掉穎殼後，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大於4%)溶液浸泡種子40min (150r/min)o倒掉次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀種子的沿糊粉層將胚剝下，將胚接種於愈傷誘導培養基上。30°C下暗培養Ild後將愈傷與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養3~5d後用於農桿菌轉化。
[0047]採用實施例2中轉入了 3種重組表達載體的根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參照Yongbo Duan (YongboDuan, Chenguang Zhai, et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等的方法。
[0048]共獲得46株pENPl-1381植株(pENPl::gus轉基因水稻植株)，28株35S-1381植株(CaMV35S::gus轉基因水稻植株)和32株Tnos-1381植株(Tnos::gus轉基因水稻植株)。
[0049]步驟2、⑶S組織化學染色
[0050]參照Jefferson (Jefferson RA 等人.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等的方法，將需要染色的組織抽真空，然後浸入染色液中，37°C染色24h。脫色時在37°C條件下用95%乙醇處理，至陰性對照材料呈白色。
[0051]通過⑶S組織染色，檢測啟動子pENPl在水稻轉基因植株中對⑶S的啟動活性。結果顯示，正對照CaMV35S:gUs轉基因植株的根、莖、葉各組織均有明顯染色；而負對照Tnos::gus轉基因水稻植株各組織中，均未檢測到Gus基因的活性；pENPl::gus轉基因水稻植株的根經⑶S染色後呈現藍色，且染色與正對照CaMV35S:gus的轉基因植株的根部位染色程度相當，而在地上部分組織染色微弱。結果說明，啟動子PENPl能夠驅動Gus基因在水稻根中特異性高水平的表達。結果見圖2A至2C。
[0052]以上對本發明【具體實施方式】的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求的範圍。
【權利要求】
1.一種植物胚乳特異性表達啟動子，其特徵在於，所述啟動子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的植物胚乳特異性表達啟動子，其特徵在於，所述啟動子的序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述啟動子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物； 或者，所述啟動子的核苷酸序列能夠與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交； 優選地，所述啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列。
3.一種包含根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子的表達盒。
4.一種重組載體，其特徵在於，所述重組載體包含根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子； 優選地，所述重組載體為重組表達載體； 進一步優選地，在所述重組表達載體中，根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子可操作地連接於待表達的基因序列的上遊； 更優選地，所述待表達的基因為Gus基因； 再優選地，所述重組表達載體為pCAMBIA1381-pENPl。
5.一種宿主菌，其特徵在於，所述宿主菌包含根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子、根據權利要求3所述的表達盒、或根據權利要求4所述的重組載體； 優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
6.一種轉化子，其特徵在於，所述轉化子包含根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子、根據權利要求3所述的表達盒、根據權利要求4所述的重組載體、或根據權利要求5所述的宿主菌。
7.根據權利要求6所述的轉化子，其特徵在於，所述轉化子為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
8.根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述培育轉基因植物，是將根據權利要求1或2所述的植物胚乳特異性表達啟動子可操作地連接於待表達的基因序列上遊，並構建在重組表達載體中，經轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
10.根據權利要求8或9的應用，其特徵在於，所述應用為用於改良植物胚乳性狀，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優選為水稻； 優選地，所述待表達的基因為Gus基因；所述重組表達載體為pCAMBIA1381-pENPl。
【文檔編號】C12R1/01GK103540592SQ201310195377
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2013年5月23日
【發明者】楊劍波, 李娟 , 魏鵬程, 張銀萍, 李 浩, 李莉 申請人:安徽省農業科學院水稻所