二氧化矽球狀體及親和載體的製作方法

2023-05-18 16:12:56 2

二氧化矽球狀體及親和載體的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結合容量大的親和載體。一種二氧化矽球狀體，其特徵在於，(a)利用雷射式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30μm～40μm；(b)利用庫爾特計數法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始為10％的粒徑(D10)與90％的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細孔徑在85nm～115nm的範圍內，細孔容積在1.5mL/g以上。
【專利說明】二氧化矽球狀體及親和載體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種二氧化矽球狀體及親和載體。
【背景技術】
[0002]近年，高精度地純化或除去特定的蛋白質在醫藥領域以及醫療領域中得到了重視。例如，在純化具有特定功能的藥物的情況下，需要高精度地純化特定的蛋白質。
[0003]親和色譜法廣泛使用作為配體有特異結合性的A蛋白。A蛋白是來源於作為革蘭氏陽性球菌的真細菌葡萄球菌(Staphylococcus)的蛋白質,具有與來源於各種動物的IgG的Fe區域特異結合的性質，廣泛使用於IgG的純化。眾所周知將A蛋白固定於不溶性載體上，通過使用該不溶性載體的親和色譜法特異地分離純化IgG的方法。
[0004]在親和色譜法中使用的親和載體中，通常，使稱為連接物(日文d >力一)的結構介於不溶性載體和配體之間，使連接物的一端與載體結合，並且使連接物的另一端與配體結合，以此將配體固定在不溶性載體上(專利文獻I)。
[0005]專利文獻2中，提出了通過含有具有大於630A小於1000A的細孔徑以及大於55 μ m小於70 μ m的平均粒徑的二氧化矽粒子的、適於親和色譜法的實施的固相載體，提供一種具有改善了的動態容量、在更短的滯留時間下的大流量的色譜法。然而，在專利文獻2中，如果為了增多二氧化矽粒子的填充量而減小平均二氧化矽粒徑則存在壓力損失上升的問題，如果壓力損失高則線流速的上限受到限制。 現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本專利特開2011-1336號公報
[0009]專利文獻2:日本專利特開2009-31277號公報

【發明內容】

[0010]發明所要解決的技術問題
[0011]本發明的目的是提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結合容量大的親和載體。
[0012]解決技術問題所採用的技術方案
[0013]本發明的一個方面為一種二氧化娃球狀體，其特徵在於，(a)利用雷射式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30 μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計數法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始10%的粒徑(DlO)與90%的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細孔徑在85nm~115nm的範圍內，細孔容積在1.5mL/g以上。
[0014]本發明的另一方面為一種親和載體，其特徵在於，含有所述的二氧化矽球狀體，配體固定於所述的二氧化矽球狀體上。
[0015]發明的效果[0016]如果採用本發明，可提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結合容量大的親和載體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發明的一實施方式的乳化裝置的簡要剖視圖。
[0018]圖2是表示實施例以及比較例的柱的線流速和壓力損失的關係的圖。
[0019]圖3是表示實施例以及比較例的柱的滯留時間和動態結合容量的關係的圖。
【具體實施方式】
[0020]以下對本發明的實施方式進行說明，但本發明不受本實施方式中例示的限定。
[0021]本發明的一實施方式的二氧化矽球狀體的特徵在於，(a)利用雷射式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30 μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計數法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始10%的粒徑(DlO)與90%的粒子徑(D90)之比(D10/D90)在1.50以下；(c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細孔徑在85nm~115nm的範圍內，細孔容積在1.5mL/g以上。如果採用這樣的二氧化矽球狀體，可提供一種即使在流通溶液的線流速快的情況下壓力損失也小、結合容量大的親和載體。
[0022]如果是相同體積的 柱，雖然認為使用平均粒徑更小的二氧化矽球狀體的一方由於單位二氧化矽球狀體的有效容積增加，因而單位載體的作為抗體分子(蛋白質等)結合能力的結合容量增大，但另一方面也有壓力損失變高的問題。如果採用本發明，通過使用具備特定的小平均粒徑，並且上述(D10/D90)的比例小的二氧化矽球狀體、即粒徑分布尖銳(日文:? 一彳)的二氧化矽球狀體，可提供低壓力損失且高容量的親和載體。
[0023]另一方面，作為親和載體的基材，如果使用瓊脂糖或聚甲基丙烯酸酯等樹脂類填充劑，由於其柔軟性，壓力損失容易變高，特別是高線流速下壓力損失容易變高。此外，作為親和載體的基材，如果使用粉碎狀的玻璃或陶瓷，由於其形狀的原因，壓力損失容易變高。
[0024]進一步，如果採用本實施方式的二氧化矽球狀體，由於平均粒徑以及(D10/D90)的比例小，平均細孔徑在適當的範圍內，細孔容積大，因此可提供結合容量大的親和載體。通常，認為線流速越高則結合容量降低，但如果採用本實施方式的二氧化矽球狀體，在高線流速下也可得到大的結合容量。即，本實施方式的二氧化矽球狀體在動態結合容量方面優良。進一步，由於本實施方式的二氧化娃球狀體在高線流速壓力損失也低，可進一步增大動態結合容量。
[0025]這裡，結合容量指靜態結合容量(Static Binding Capacity, SBC)和動態結合容量(Dynamic Binding Capacity, DBC)。靜態結合容量表示載體可吸附抗體分子的上限的量，動態結合容量表示在柱中流動著含有抗體分子的溶液的狀態下，抗體分子可以回收的程度。動態結合容量大的載體，在高線流速下也可有效地吸附抗體分子，可在短時間內純化抗體分子。
[0026]理想地，如果採用本實施方式的二氧化矽球狀體，可提供在滯留時間為I分鐘的高流速區域(在20cm柱中相當於1200cm/小時)下，抗體分子的動態結合容量在50mg/mL-柱床以上,更優選在60mg/mL-柱床以上,並且,壓力損失在5巴(bar)以下,更優選在3巴以下的親和載體。[0027]作為二氧化矽球狀體形狀，如果是球狀則沒有特別的限定，可以是包括正球體以及橢圓體的球狀，從對柱的填充性、抑制使用時的壓力損失的觀點考慮，優選近似於正球體的形狀。
[0028]作為二氧化矽球狀體的平均粒徑，為30 μ m~40 μ m，優選32 μ m~38 μ m，進一步優選33 μ m~37 μ m。通過使平均粒徑在30 μ m以上，可在將結合容量保持在較大值的同時防止壓力損失的上升。此外，通過使平均粒徑在40 μ m以下，可增加各粒子的單位有效容積，增大結合容量。這裡，二氧化矽球狀體的平均粒徑為使用雷射式光散射法的測定方法下的體積換算的平均粒徑。具體而言，作為二氧化矽球狀體的平均粒徑，可使用堀場製作所株式會社(堀場製作所)制「LA-950V2」等進行測定。
[0029]在庫爾特計數法中，作為粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始的10%的粒徑(DlO)和粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始的粒徑90%的粒徑(D90)的比值(D10/D90)(以下，有時稱為「均勻係數」)，為1.50以下，優選1.40以下，進一步優選1.35以下。通過使均勻係數在1.50以下，即使是平均粒徑小的二氧化矽球狀體也可防止壓力損失的增大。此外，均勻係數越接近I左右粒徑分布越均勻，因而優選。
[0030]此處，二氧化矽球狀體的均勻係數通過利用庫爾特計數法的測定方法測定。DlO為在利用庫爾特計數法的粒徑分布中，從粒徑小的一側開始累計粒徑的體積的情況下，達到合計體積的10%時的粒徑；D90為同樣地累計體積達到90%時的粒徑。由於均勻係數(D10/D90)是這些粒徑的比值，可由貝克曼庫爾特有限公司O * -一>夕一社)制「Multisizer III」等對二氧化矽球狀體測定所得的DlO以及D90求得。
[0031]作為二氧化矽球狀體的平均細孔徑，在水銀壓入法中，為85nm~115nm，優選90nm~IlOnm,更優選95nm~ 105nm。通過使平均細孔徑在85nm以上，可提高吸附抗體分子的能力，提供大容量的載體。此外，通過使平均細孔徑在115nm以下，可在將抗體分子的吸附量保持在較大值的同時防止二氧化矽球狀體的強度的下降。
[0032]作為二氧化矽球狀體的細孔容積，在水銀壓入法中，為1.5mL/g以上，優選1.55mL/g以上，更優選1.6mL/g以上。通過使細孔容積在1.5mL/g以上，可提高吸附抗體分子的能力，提供大容量的載體。此外，從二氧化矽球狀體強度的觀點考慮，細孔容積優選
1.8mL/g 以下。
[0033]作為二氧化矽球狀體的比表面積，在水銀壓入法中，優選55m2/g~75m2/g，更優選60m2/g~75m2/g。作為比表面積，可與上述的平均細孔徑以及細孔容積一起根據目的進行合理化。由於通過增大比表面積將提高吸附抗體分子的能力，因而是理想的，但如果增大則會降低二氧化矽球狀體的強度，因此設定在上述範圍內即可。
[0034]這些基於水銀壓入法的細孔物性可使用島津製作所株式會社(島津製作所社)制「萊孔度計Autopore IV9510」等測定。
[0035]作為上述二氧化矽球狀體，可作為親和載體使用。作為親和載體，可使用將上述二氧化矽球狀體包含在內作為基材並在該二氧化矽球狀體上固定配體而得的親和載體。作為配體，可使用A蛋白、G蛋白、伴刀豆球蛋白A、抗原、抗體等。
[0036]使用A蛋白作為配體的情況下，親和載體通過使用上述二氧化矽球狀體作為基材，可使A蛋白的固定化量達到10.0g/L-柱床以上，更理想的為11.0g/L-柱床以上，進一步理想的為11.5g/L-柱床以上。[0037]這裡，作為A蛋白的固定化量的測定方法，可乾燥固定了 A蛋白的載體，對該載體進行元素分析求得。
[0038]如果採用這樣的親和載體，可使滯留時間為I分鐘的高線流速區域中(在20cm柱中相當於1200cm/小時)的抗體分子的動態結合容量在50mg/mL-柱床以上,進一步可使其在60mg/mL-柱床以上，並且，壓力損失在5巴以下，進一步可使其在3巴以下。此外，作為這樣的親和載體的靜態結合容量在80mg/mL-柱床以上,進一步可使其在85mg/mL_柱床以上。
[0039]作為壓力損失的測定方法，是在柱內填充親和載體，將該柱裝填在色譜裝置中，使蒸餾水以各種線流速通過，求出運轉壓力。接著，將空柱裝填在色譜裝置中，同樣地使蒸餾水以各種線流速通過，通過將求得的運轉壓力從之前的填充了親和載體的柱的運轉壓力中扣除來測定壓力損失。
[0040]作為動態結合容量，可在柱內填充親和載體，將該柱裝填在色譜裝置中，使含有抗體分子的樣品溶液以規定的線流速在柱內通過，測定溶出液的吸光度，由測定到所添加的樣品溶液的吸光度的規定比例(例如10% )的穿透(日文:O 4夕幻1 —)時的添加抗體分子的質量求得。吸光度可使用島津製作所株式會社制「UV-1800」等測定。
[0041]此外，作為靜態結合容量，可在親和載體中加入含有規定濃度的抗體分子的溶液，在適當的混合以及攪拌之後，離心分離，通過測定吸光度使上清液的抗體分子的量少量化，使用朗繆爾曲線法(日文:9 > 7 S 二 7:/ 口 〃卜法)求得。吸光度可使用島津製作所株式會社制「UV-1800」等測定。
[0042]接著，對二氧化矽球狀體以及親和載體的製造方法進行說明。以下，作為一例，說明上述物性的二氧化矽球狀體的製作、在該二氧化矽球狀體上固定A蛋白的方法。
[0043]作為上述物性的二氧化矽球狀體的製造方法，沒有特別的限定，作為一例，可乳化含有二氧化矽前體的分散相和連續相，使所得的乳液凝膠化以獲得二氧化矽球狀體。如果有必要，可適當進行用於增大二氧化矽球狀體的平均細孔徑以及細孔容積的處理。
[0044]作為乳化工序，理想的是介由微孔或多孔質膜向連續相供給含有二氧化矽前體的分散相以製作乳液的方法。據此製作均勻的液滴徑的乳液，作為結果可獲得均勻係數在1.5以下的均勻粒徑的二氧化矽球狀體。作為這樣的乳化工序，作為一例可使用微混合器法或膜乳化法。
[0045]以下，對使用含有二氧化矽前體的水性液體作為含有二氧化矽前體的分散相、使用有機液體作為連續相來製作W/0型乳液的例子進行說明。另外，也可將有機液體作為含有二氧化矽前體的分散相、將水性液體作為連續相來製作0/W型乳液。
[0046]作為含有二氧化矽前體的水性液體，如果可通過凝固形成沉澱物，則均可採用。具體而言，可例舉溶解了水溶性二氧化矽的水溶液、水解有機矽化合物所得的矽溶膠以及市售的矽溶膠等將固體二氧化矽分散了的水性分散液。尤其優選使用鹼金屬矽酸鹽的水溶液。作為鹼金屬可例舉鋰、鈉、鉀、銣等，其中根據獲得的容易度、經濟的理由最優選鈉。鈉和矽酸的比例以Si02/Na20(摩爾比)計優選2.0~3.8，進一步優選2.0~3.5。此外，鹼金屬矽酸鹽水溶液的濃度以SiO2濃度計優選5~30質量％，進一步優選5~25質量％。
[0047]作為有機液體沒有特別的限定，可使用在水性液體中為不溶性的物質，例如，可將以下所例舉的物質中的I種或2種以上組合使用。[0048]正己烷、異己烷、正庚烷、異庚烷、正辛烷、異辛烷、壬烷、癸烷等脂肪族烴類，環戊烷、環己烷、環己烯等的脂環族烴類，苯、甲苯、二甲苯、乙苯、丙苯、異丙苯、均三甲苯、四氫化萘、苯乙烯等芳香族烴類，丙醚、異丙醚等醚類，乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯、乙酸正戊酯、乙酸異戊酯、乳酸丁酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯等酯類等。
[0049]作為有機液體，優選碳數9~12的飽和烴，綜合考慮操作性、火災安全性、凝固粒子與有機液體的分離性、二氧化矽球狀體的形狀特性、有機液體在水中的溶解性等進行選擇。可單獨使用碳數9~12的飽和烴，也可將其中二種以上混合使用。此外，如果碳數9~12的飽和烴的化學穩定性良好，可以是直鏈狀烴，也可以是有側鏈的烴。
[0050]作為碳數9~12的飽和烴的閃點，優選20~80°C，更優選30~60°C。在以閃點不足20°C的飽和烴作為有機液體的情況下，由於閃點過低，需要在防火上、操作環境上的應對。此外，閃點超過80°C的飽和烴則由於揮發性小，有附著在得到的二氧化矽球狀體上的烴的量變多的可能性。
[0051]本實施方式中，乳液凝固之後的二氧化矽球狀體和有機液體通常固液分離。分離後的二氧化矽球狀體上附著或者吸附的有機液體優選通過過濾操作、清洗操作、乾燥操作等進行分離。
[0052]本實施方式中，優選在形成W/0型乳液時，使用表面活性劑。作為表面活性劑，例如，可使用以下所例舉的物質中的I種、或者將2種以上組合使用。
[0053]可例舉失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、失水山梨糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇三油酸酯等失水山梨糖醇脂肪酸酯類；
[0054]聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯類；
[0055]聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯壬基酚醚等聚氧乙烯高級醇醚類；
[0056]聚氧乙烯乙二醇單月桂酸酯、聚氧乙烯乙二醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯乙二醇單油酸酯等聚氧乙烯脂肪族酯類；
[0057]硬脂酸單甘油酯、油酸單甘油酯等甘油脂肪酸酯類等。
[0058]進一步，也可使用聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯類、蔗糖脂肪酸酯類、聚甘油脂肪酸酯類聚氧乙烯氫化蓖麻油類等。
[0059]表面活性劑的使用量，根據表面活性劑種類、表示表面活性劑的親水性或疏水性程度的指標HLB (Hydrophile-lipophile balance:親水親油平衡)、目標二氧化娃球狀體的粒徑等條件而不同，但優選在上述有機液體中含有500~20000ppm，更優選含有1000~lOOOOppm。如果不足500ppm,乳液有變得不穩定的可能性。另外,如果超過20000ppm,作為製品的二氧化矽球狀體上附著的表面活性劑量將變多，因此不優選。 [0060]理想的是將含有二氧化矽前體的水性液體和有機液體在室溫(20~23°C )下的體積比值，作為得到的乳液中的W/0比值設為I~100左右。
[0061]作為乳化工序一個實施方式，將含有二氧化矽前體的水性液體通過微孔擠出至以層流流動的有機液體中，可形成以有機液體為連續相、其中的含有二氧化矽前體的水性液體的液滴為分散相構成的乳液，即w/0型乳液(例如可使用日本專利第4193626號公報記載的方法)。
[0062]本實施方式中，通過使有機液體的流速在0.001~5m/s，形成液滴徑分布狹窄的乳液液滴，可使得到的二氧化矽球狀體的液滴徑分布也狹窄。進一步優選有機液體的流速為0.1~4m/s的情況。
[0063]優選使流道中流動的有機液體的雷諾數(日文:X V > <數)在2100以下。此處，在流道的截面為圓形的情況下雷諾數以式2計算，流道的內徑D使用流道的截面中的最小徑。這裡，D (流道的內徑:m)，u (平均流速:m/秒)，P (流體密度:kg/m3)，μ (流體粘度:帕?秒)。
[0064]雷諾數(一)=D·u·p/y···式2
[0065]另外，在流道的截面不是圓形的情況下雷諾數以式3計算。這裡，r為流道水力半徑(m)=流道的截面積(m2)/流道截面的與流體接觸的周長(m)，U、P、μ與式2相同。
[0066]雷諾數(一)=4×r·U·ρ/μ···式3
[0067]在雷諾數為2100以下的情況下，由於有機液體流動為層流狀態，有機液體流動穩定。其結果是，由於通過微孔供給的含有二氧化矽前體的水性液體總是構成具有一定的液滴徑的W/0型乳液，因此實質上液滴徑均勻的二氧化矽球狀體易於製造。相反地，在雷諾數超過2100的情況下，由於有機液體流動為紊流，與以往一樣構成液滴徑不規則的W/0型乳液，其結果是，二氧化矽球狀體的粒徑也不規則。此外，對於該有機液體的流道的形狀沒有特別的限定。
[0068]圖1是表示用於進行乳化工序的乳化裝置的一例的簡要剖視圖。圖1中，I以及2是丙烯酸樹脂制部件，3是在蝕刻處理下形成了流道3a的不鏽鋼板，4是對形成了多個微孔4a的表面進行了疏水化處理的不鏽鋼板。於是，有機液體以從連續相供給部5供給、從連續層排出部6排出的方式在流道3a以層流狀態流動，含有二氧化矽前體的水性液體從分散相供給部7供給，介由微孔4a被壓入有機液體中。不鏽鋼板3的流道3a，可沿著液體流動方向形成多條流道3a。
[0069]圖1所示的例子中，有機液體的流道以間隔壁劃分形成，通過沿間隔壁的厚度方向貫通的微孔壓入水性液體。藉此，由於水性液體與有機液體以直角交流(日文:直交流)方式混合，通過有機液體的流動易於得到乳液液滴被切離的效果，因此容易穩定得到粒徑小的二氧化矽球狀體。
[0070]此外，優選在每個流道設置多個微孔。在該情況下，在有機液體的流道上，優選以與微孔的截面形狀外切的圓的直徑的1/2以上為間隔設置多個微孔。進一步優選以與微孔的截面形狀外切的圓的直徑以上為間隔設置。如果將微孔的間隔僅僅設置為短於外切圓的直徑的1/2，則乳液的液滴合併，其結果是，液滴徑有變得不均勻的可能性，因而不優選。但是，在不發生合併的範圍內儘可能密集地設置則可提高生產性，因而優選。
[0071 ] 本實施方式中，作為設有微孔的間隔壁的材料，優選使用對含有二氧化矽前體的水性液體以及有機液體具有耐受性的材料。以金屬為主體的材料由於加工性以及強度優良因而優選，但也可優選使用其它以樹脂為主體的材料。作為樹脂，如果使用選自聚苯硫醚、聚醚醚酮、聚醯亞胺、聚醯胺醯亞胺、芳香族聚酯以及氟樹脂的I種以上，則因加工性、尺寸穩定性優良而優選。
[0072]此外，作為設置微孔的間隔壁的材料，優選為親連續相(該情況下為親有機液體)性的材料。因此，在金屬材質的情況下，希望通過燒上油(日文:油&焼務付#3 )、或者與疏水化處理劑進行反應、用疏水性聚合物進行塗覆等方法，實施使其具有親有機液體性的處理。這是為了促使含有二氧化矽前體的水性液體通過微孔之後自間隔壁發生液體分離，使用高速相機的觀察表明，在間隔壁為親水性的情況下，通過微孔後，水性液體沿著間隔壁流動，容易形成大的乳液。
[0073]作為乳化工序的其它實施方式，也可以使用多孔質膜來代替上述微孔。介由多孔質膜向有機液體供給含有二氧化矽前體的水性液體，從而可與微孔同樣地製作均勻的液滴徑的乳液。多孔質膜優選表面為疏分散相(該情況下為疏水性)的多孔質膜。藉此，使含有二氧化娃前體的水性液體成為均勻的液滴分散在有機液體中。
[0074]作為多孔質膜的一例，可例舉多孔質玻璃、高分子材料過濾器、金屬燒結過濾器等。
[0075]作為在乳液中添加膠凝劑獲得二氧化矽球狀體的工序，有從I滴乳液分散相製造I粒二氧化矽球狀體的方法。
[0076]通過將乳液凝膠化，球狀的水溶液的分散液滴在保持該球狀的狀態下被凝膠化，得到球狀的二氧化矽水凝膠。凝膠化優選在乳液中導入膠凝劑的方法。作為膠凝劑，可使用無機酸或有機酸等酸，特別地，優選作為無機酸的硫酸、鹽酸、硝酸、碳酸等。從操作的容易性等方面看，最簡便且優選的是使用二氧化碳的方法。關於二氧化碳，可導入100%濃度的純二氧化碳，也可導入空氣或用惰性氣體稀釋了的二氧化碳。凝膠化所需的時間通常優選4~30分鐘，凝膠化時的溫度優選5~30°C。
[0077]凝膠化結束後，優選靜置反應體系，使有機液體的相和含有二氧化矽水凝膠的水性相2相分離來分離矽膠。在使用飽和烴有機液體的情況下，由於在上層的有機液體的相和在下部的含有二氧化矽水凝膠的水性液體相發生分離，因此通過公知的方法分離兩者。
[0078]對二氧化矽水凝膠的水漿料，根據需要添加硫酸等酸將pH調整為I~5左右完成凝膠化，過濾水漿料，水洗得到二氧化矽水凝膠，通過將其在100~150°C左右的溫度下乾燥I~30小時左右，得到二氧化矽球狀體。
[0079]此外，在使用矽酸鹼水溶液作為含有二氧化矽前體的水性液體、使用酸作為膠凝劑的情況下，由於生成副產物鹼金屬鹽(例如膠凝劑為二氧化碳時則是碳酸鈉等)，為了防止該鹽混入二氧化矽球狀體，優選在過濾的時候充分水洗二氧化矽水凝膠(溼濾餅)。根據情況，可在水洗後的溼濾餅中再次添加水使之成為漿料，再次過濾，反覆水洗。此外此時，根據需要可將該漿料的PH調整到I~5左右進行再次熟化操作。
[0080]通過上述乳化工序以及凝膠化工序得到的二氧化矽球狀體(以下，有時稱為「乳化後的二氧化矽球狀體」)具有均勻的粒徑，通過適當調整乳化以及凝膠化的條件，可提供平均粒徑、均勻係數(D10/D90)、平均細孔徑以及細孔容積在上述範圍內的二氧化矽球狀體。
[0081]上述得到的二氧化矽球狀體，在乳化工序以及凝膠化工序之後，根據需要，為了增大平均細孔徑以及細孔容積，可進一步進行以下處理。
[0082]可通過採用以下任一種方法，增大二氧化矽球狀體的平均細孔徑，例如:將乳化後的二氧化矽球狀體含浸在2~50%磷酸中、於100~700°C加熱處理的方法(磷酸浸潰一加熱處理法，例如日本專利特開平3-23211號公報記載的方法);於270~350°C水熱處理的方法(水熱處理法，例如日本專利特公昭和61-20487號公報記載的方法)；WNaCl等無機鹽水溶液填充於矽膠的細孔內，乾燥後，於350~1500°C燒成的方法(無機鹽填充一燒成法，例如日本專利特開昭47-5817號公報記載的方法)。
[0083]進一步，對於乳化後的二氧化矽球狀體或者乳化後進一步增大了細孔徑的二氧化矽球狀體，通過使其與鹼水溶液或者氟水溶液進行接觸，可在保持均勻係數的狀態下，增加其平均細孔徑以及細孔容積(例如可使用日本專利特開2007-238426號記載的方法)。
[0084]在鹼水溶液的處理中，作為鹼，可使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銣、氫氧化銫等鹼金屬的氫氧化物，氫氧化鎂、氫氧化鈣、氫氧化鍶、氫氧化鋇等鹼土金屬的氫氧化物等強鹼。優選氫氧化鈉及/或氫氧化鉀。
[0085]使用的鹼與矽膠球狀體的質量比(鹼(OH)質量/矽膠原體質量)為0.02/1~
0.2/1，優選0.05/1~0.15/1左右。如果鹼的比例不到以上範圍則不能充分進行調整矽膠原體細孔物性的反應，比例超過以上範圍則難以在控制細孔物性的同時進行調整。
[0086]鹼水溶液的濃度為0.1~40質量％，優選0.5~30質量％，進一步優選I~20質量％。如果濃度不到以上範圍則不能充分獲得鹼的使矽膠原體細孔物性增加的作用，此外如果濃度超過以上範圍則反應過度，難以控制細孔物性。此外，鹼水溶液中的矽膠原體的漿料濃度例如為I~60質量％，優選2~50質量％，進一步優選3~40質量％。
[0087]反應溫度為5~100°C，優選10~80°C，進一步優選20~50°C左右。此外，可不用特地進行加溫或冷卻，以室溫進行反應。
[0088]處理時間(反應時間)可根據鹼水溶液的濃度、反應溫度、鹼質量和矽膠原體質量t匕、漿料濃度等因素變化，但通常在I分鐘~50小時，優選10分鐘~40小時，進一步優選30分鐘~30小時，最優選I~24小時左右。
[0089]將處理工序結束後的漿料通過過濾或離心分離進行固液分離，將分離後的矽膠餅置於攪拌槽中，使之再次分散於水中，添加硫酸、鹽酸、硝酸等適當的酸使PH達到I~3左右，在漿料狀態下攪拌0.1~2小時，充分清洗鹼。根據需要，進一步通過將其過濾、清洗、乾燥，得到調整了細孔物性的二氧化矽球狀體。
[0090]可使用氟化氫水溶液代替上述鹼水溶液。使用氟化氫水溶液的情況下，可與上述使用鹼水溶液的情況同樣處理。
[0091]使用的氟化氫與矽膠原體的質量比(氟化氫質量/矽膠原體質量)為0.1/1~
1.8/1，優選0.2/1~1.6/1左右。此外，氟化氫水溶液的濃度為0.01~20質量％，優選0.5~15質量％，進一步優選I~10質量％。在氟化氫水溶液的濃度在上述範圍中的情況下，可適度控制細孔物性。
[0092]作為將A蛋白固定於上述二氧化矽球狀體的工序，可通過使稱為連接物的結構介於二氧化矽球狀體和配體之間，使連接物的一端與二氧化矽球狀體結合，並且使連接物的另一端與配體結合，以此將配體固定在二氧化矽球狀體上。
[0093]以下，作為一例，對使二氧化矽球狀體和含有環氧基的化合物進行反應，進一步與A蛋白反應的方法進行說明。
[0094]通過使二氧化矽球狀體與含有環氧基的化合物進行反應，可在二氧化矽球狀體表面固定含有環氧基的化合物，形成連接物。連接物在末端具有環氧基。
[0095]作為含有環氧基的化合物，優選使用具有環氧基的矽烷偶聯劑。作為含有環氧基的矽烷偶聯劑，可使用Y-環氧丙氧基丙基三甲氧基矽烷、Y-環氧丙氧基丙基甲基二乙氧基矽烷、β _(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧基矽烷等。
[0096]作為使二氧化矽球狀體與含有環氧基的化合物進行反應的方法，沒有特別的限定，例如，可使用在溶劑中加熱二氧化矽球狀體和含有環氧基的化合物的方法。反應溫度例如為30~400°C左右，優選100~300°C。反應時間例如為0.5~40小時左右，優選3~20小時。
[0097]作為溶劑，只要是不與含有環氧基的化合物發生反應，且在反應溫度下穩定的物質，就沒有特別的限定。從含有環氧基的化合物的溶解性、沸點，進一步與其它溶劑的親和性(即清洗時的除去性)等觀點考慮，通常，可使用苯、甲苯、二甲苯、辛烷、異辛烷、四氯乙烯、氯苯、溴苯等。此外，反應操作可在溶劑的回流下進行。
[0098]含有環氧基的化合物的固定化量，通常越多，即達到緻密覆蓋二氧化矽球狀體表面整體的量，可提高二氧化矽球狀體的耐鹼性，從該觀點考慮是優選的。具體而言，優選以使每Ig 二氧化矽球狀體上的含有環氧基的化合物的量(含有環氧基的化合物的固定化量除以二氧化矽球狀體的質量而得的值)達到220 μ mol/g以上的條件進行反應。含有環氧基的化合物的固定化量更優選220~320 μ mol/g，特別優選240~300 μ mol/g。
[0099]此外，含有環氧基的化合物的固定化量可基於公知的方法求出。例如，對於將含有環氧基的化合物固定後的矽膠，利用元素分析法測得碳含有率，基於該測得的碳含有率，使用I分子含有環氧基的 化合物所含的碳的量以及二氧化矽球狀體質量，可算出含有環氧基的化合物的固定化量。
[0100]在二氧化矽球狀體和含有環氧基的化合物的反應體系中，進一步，可混合三乙胺、吡啶、二異丙基乙胺等胺化合物。藉此，通過胺的催化作用，促進二氧化矽球狀體和含有環氧基的化合物的反應。
[0101]接著，將A蛋白固定在導入了連接物的二氧化矽球狀體上。作為A蛋白，可使用具有賴氨酸氨基的A蛋白。其中,可優選使用重組蛋白A。
[0102]作為使配體結合在上述二氧化矽球狀體的連接物結構上的方法，此處沒有特別的限定，可將二氧化矽球狀體和含有A蛋白的溶液混合，使用適當催化劑和反應試劑等在適當的溶劑下進行反應。在連接物結構和配體的反應中，例如，反應溫度可為20~30°C，反應時間可為I~24小時。反應體系的pH優選8~9.5，可通過緩衝液調整。
[0103]作為A蛋白的摻合量，單位填充容積優選相當於10.0mg/mL-柱床以上的量，更優選11.5mg/mL-柱床以上。
[0104]此外，為了使連接物結構中殘留的環氧基失活，在配體結合了二氧化矽球狀體之後，優選使用乙醇胺和三羥甲基氨基甲烷(日文:卜U 7 )進行反應，或者以酸性水溶液進行處理。
[0105]作為反應後的後處理，沒有特別的限制，可通過過濾以及清洗等通常採用的方法進行。
[0106]此外，固定化配體的載體，優選以pH5~6於4~8 °C冷藏保存，進一步作為防腐劑
可添加丙二醇等。[0107]作為A蛋白的固定化量，優選使單位填充容量的A蛋白的量(A蛋白的固定化量除去填充容量後的值)在10mg/mL-柱床以上進行反應。A蛋白的固定化量更優選為11.5mg/mL-柱床以上。
[0108]A蛋白的固定化量可基於公知的方法求出。例如，由摻合了的A蛋白溶液的濃度，和使該溶液與二氧化矽球狀體混合、結合了 A蛋白後、分離二氧化矽球狀體所得的A蛋白溶液的濃度的差，可計算在二氧化矽球狀體上固定化了的量。溶液濃度可通過光學方法測定。
[0109]在用上述親和載體實施色譜法的情況下，將親和載體填充於柱中使用。作為柱可適當使用玻璃制、不鏽鋼製、樹脂制等的柱。
[0110]實施例
[0111]以下，通過實施例對進行本發明詳細說明，但本發明並不限定於此。在以下的說明中，共通成分使用相同物質。此外，關於沒有特別描述的成分，使用關東化學株式會社(関東化學社)制的產品。
[0112](製造例I)實施例的親和載體的製作
[0113](1)分散相以及連續相的製備
[0114]作為分散相，將3號矽酸鈉(AGC S1-Tech株式會社(AGC工^ 4 f 夕社)制)用水稀釋，製備SiO2濃度為16.9質量％、Na2O濃度為6.13質量％ (Si02/Na20摩爾比=
2.85)、比重1.222的矽酸鈉溶液。
[0115]作為連續相，製備在比重0.73的直鏈飽和烴癸烷(CltlH22,東曹株式會社(東乂一社)制)中溶解有作為表面活性劑的1.0質量％的失水山梨糖醇單油酸酯(三洋化成工業株式會社(三洋化成工業社)制)而得的溶液。
[0116](2)乳化裝置的製作
[0117]用於乳化分散相和連續相的乳化裝置示於圖1。
[0118]圖1所示的乳化裝置中，I以及2是丙烯酸樹脂制部件，3是在蝕刻處理下形成了流道(微通道)3a的不鏽鋼板，4是形成了多個微孔4a的不鏽鋼板。於是，連續相以從連續相供給部5供給、從連續相排出部6排出的方式在流道3a以層流狀態流動，矽酸鈉溶液構成的分散相從分散相供給部7供給，介由微孔4a被壓入連續相中。
[0119]通過蝕刻以並列配置2條流道3a的方式對不鏽鋼板3進行加工。2條流道3a分別為 3.0mm(寬)X0.15mm(厚)X63mm(長)。
[0120]對於不鏽鋼板4，通過雷射加工，以每I條流道3a上有橫向26個X縱向510個=總計13260個從排出口側的面可見的孔直徑14 μ m的微孔4a的方式進行加工。不鏽鋼板4上，為了使其表面具有拒水性，使用溶劑可溶型氟樹脂(旭硝子株式會社(旭硝子社)制:CYTOP CTL-102AE)塗覆表面。
[0121](3)乳化後的二氧化矽球狀體的製作
[0122]將上述(2)所製作的乳化裝置水平放置進行使用，從連續相供給部5供給上述1)所製備的連續相，從分散相供給部7通過微孔4a供給上述(1)所製備的由矽酸鈉溶液構成的分散相，從而連續製造將矽酸鈉溶液分散於連續相中的W/0型乳液。此時，連續相的供給量在每I流道3a中為642mL/小時，流道中流動方向的流速為3m/秒。實驗於常溫下進行，此時,分散相的供給量在每一個微孔4a中為10.4 μ L/小時。
[0123]接著，在攪拌得到的乳液的同時供給15分鐘二氧化碳，使二氧化矽球狀體析出。進一步，加水與連續相分離後，添加20質量％的硫酸，除去CO2後，水洗乾燥，得到乳化後的二氧化矽球狀體。
[0124]得到的乳化後的二氧化矽球狀體的物性如下所示，具有均勻的粒徑。
[0125]平均粒徑:40.6μπι
[0126]均勻係數(D10/90):L 31
[0127]平均細孔徑:15.6nm
[0128]細孔容積:1.16mL/g
[0129]比表面積:298m2/g
[0130]此處，作為測定方法，利用雷射式光散射法使用LA-950V2 (堀場製作所株式會社(堀場製作所社)制)測定平均粒徑。此外，使用Multisizer III (貝克曼庫爾特有限公司制)利用庫爾特計數法測定DlO粒徑以及D90粒徑，由其比值(D10/D90)求得均勻係數。
[0131]此外，平均細孔徑、細孔容積以及比表面積通過使用Autopore IV9510(島津製作所株式會社制)利用水銀壓入法測定。以下相同。
[0132](4) 二氧化矽球狀體的製作
[0133]在上述乳化工序所得的乳化後的二氧化矽球狀體34.5g中，以相對於SiO2達到0.7質量％的條件添加1.5質量％的氯化鈉(NaCl)水溶液，於180°C乾燥一晝夜。將其投入坩鍋，於180°C保持6.5小時後，於730°C進行13小時的燒成。為了除去多餘的鈉成分，用18%的鹽酸水溶液進行2小時的回流處理。過濾、清洗後，在規定量的0.85M的氫氧化鈉(NaOH)水溶液中以25°C浸潰24小時。過濾後，以pHl.5的硫酸水溶液清洗，得到二氧化矽球狀體的最終產品。
[0134]得到的二氧化矽球狀體的物性如下。
[0135]平均粒徑:34.4μηι
[0136]均勻係數(D10/90):L 31
[0137]平均細孔徑:105.0nm
[0138]細孔容積:1.64mL/g
[0139]比表面積:60m2/g
[0140](5)連接物的導入
[0141]在得到的二氧化矽球狀體IOg中加入80mL甲苯、4.62mL 二異丙基乙胺、6.0OmL的Y _環氧丙氧基丙基二甲氧基矽烷，回流4.5小時。放直冷卻後，過濾，以200mL甲苯、IOOmL四氫呋喃(THF)、130mL甲醇清洗，於70°C乾燥。
[0142]對於得到的二氧化矽球狀體每Ig中的連接物固定化量，使用全自動元素分析裝置(CHNS/0) 240011(珀金埃爾默股份有限公司(Perkin Elmer社)制)進行元素分析，結果如下所示。
[0143]連接物固定化量:260 μ mol/g
[0144](6)配體的導 入
[0145]在得到的導入連接物的二氧化矽球狀體4g中加入0.2M碳酸氫鹽緩衝液、以及相當於單位填充容積12mg/mL-柱床的重組蛋白A(利用U.S.5084559號公報中記載的方法製作)，於室溫攪拌3小時。過濾、水洗後，在16mL的0.5質量％的鹽酸水溶液中於室溫下浸潰一晝夜，使殘留的環氧基失活。過濾後，以130mL磷酸緩衝生理食鹽水(PBS，pH7.4)、130mL檸檬酸緩衝液(pH2.2)清洗，再以130mL的PBS、60mL的50mM NaOH水溶液、130mL蒸餾水清洗。在含有1%苄醇的0.1M乙酸緩衝液(pH5.2)中冷藏保存。
[0146]將得到的親和載體乾燥，對A蛋白的配體固定化量使用全自動元素分析裝置(CHNS/0) 2400II (珀金埃爾默股份有限公司制)進行元素分析，結果單位填充容積如下所
/Jn ο
[0147]配體固定化量:11.5mg/mL_柱床
[0148]此外，靜態結合容量(SBC)如下所示。作為靜態結合容量，在A蛋白固定化載體
0.1mL-柱床中加入初始濃度為O~1.82mg/mL的多克隆human IgG溶液(西格瑪奧德裡奇公司( '> 夕''7 7 A K -j ^ f社)制)，在室溫下用旋轉混合器(日文:口一夕〗J 一$今寸一)攪拌一晝夜，離心分離後，通過上清液的280nm吸光度測定(UV-1800 (島津製作所社制))定量殘留的IgG濃度，使用朗繆爾曲線法算出。
[0149]靜態結合容量(SBC):88mg/mL-柱床 [0150](製造例2)比較例的親和載體的製作
[0151]在根據上述製造例I的實施例的親和載體的製作中，除了作為二氧化矽球狀體的最終產品使用AGC S1-Tech公司制「M.S.GEL.SIL D-50-1000AW」以外，進行同樣的操作，製作親和載體。
[0152]使用的二氧化矽球狀體「M.S.GEL.SIL D-50-1000AW」的物性如下所示。
[0153]平均粒徑:45.7μπι
[0154]均勻係數(D10/90):1.93
[0155]平均細孔徑:99.0nm
[0156]細孔容積:1.78mL/g
[0157]比表面積:71m2/g
[0158]此外，親和載體的物性如下所示。
[0159]配體固定化量:11.6mg/mL-柱床
[0160]靜態結合容量(SBC):74mg/mL-柱床
[0161](實施例1)
[0162]作為實施例1，將以上述製造例I製作的親和載體填充於內徑5mmX長200mm的玻璃制柱中，製作親和色譜法用柱。
[0163](比較例I~3)
[0164]作為比較例1，除了使用以製造例2製作的比較例的親和載體以外，其它與上述實施例I 一樣，製作親和色譜法用柱。
[0165]作為比較例2，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe, GE醫療公司(GEHealthcare社)制)以外，其它與上述實施例1 一樣，製作親和色譜法用柱。
[0166]作為比較例3，除了使用市售的CPG(受控微孔玻璃(日文>卜π— ;7 — 7 ^ ))類載體(Prosep Ultra Plus，密理博有限公司(Millipore社)制)以外，其它與
上述實施例1 一樣，製作親和色譜法用柱。
[0167]〈評價〉
[0168]測定在實施例1以及比較例I~3的柱中流通水的情況下的線流速和壓力損失的關係。結果示於圖2中。[0169]將親和載體填充於內徑5mmX長200mm的玻璃制柱中，將柱裝填於色譜裝置「AKTAexplorerlOS^GE醫療公司制)，在各種線流速下流通蒸餾水，求出運轉壓力A。接著，除了不在柱內填充親和載體外進行同樣的操作，求出運轉壓力B。在各線流速下從運轉壓力A減去運轉壓力B，求出壓力損失。
[0170]如圖2所示，實施例1 (以實線表示近似直線)與比較例I (以點虛線表示近似直線)顯示出相同的壓力損失，在相當於滯留時間為I分鐘的1200cm/小時的高線流速下顯示出3巴以下的低壓力損失。雖然實施例1的二氧化矽球狀體與比較例I相比平均粒徑更小，但由於均勻係數小，可將壓力損失抑制在低水平。另一方面，瓊脂糖類載體的比較例
2(以雙點劃線表示近似直線)在同樣的線流速下有10巴以上的高壓力損失，CPG類載體的比較例3(以長虛線表示近似直線)在同樣的線流速下有3巴以上壓力損失。
[0171](實施例2)
[0172]作為實施例2，將上述製造例I的親和載體填充於內徑5mmX長50mm的玻璃制柱中，製作親和色譜法用柱。
[0173](比較例4~8)
[0174]作為比較例4，除了使用以製造例2製作的親和載體以外，其它與上述實施例2 —樣，製作親和色譜法用柱。
[0175]作為比較例5，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect Xtra, GE醫療公司制)以外，其它與上述實施例2 —樣，製作親和色譜法用柱。 [0176]作為比較例6，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe, GE醫療公司制)以外，其它與上述實施例2 —樣，製作親和色譜法用柱。
[0177]作為比較例7，除了使用市售的瓊脂糖類載體(MabSelect SuRe XL，GE醫療公司制)以外，其它與上述實施例2 —樣，製作親和色譜法用柱。
[0178]作為比較例8，除了使用市售的CPG(受控微孔玻璃)類載體(Pros印Ultra Plus,密理博有限公司制)以外，其它與上述實施例2 —樣，製作親和色譜法用柱。
[0179]
[0180]按照以下順序測定動態結合容量(DBC)，結果示於圖3中。將實施例2以及比較例5~8的柱裝填於色譜裝置「AKTA explorerlOS" (GE醫療公司制)，在各柱中以各種線流速流通含有0.5mg/mL多克隆human IgG的PBS(pH7.4)。對流通的含有0.5mg/mL多克隆human I gG的PBS (pH7.4)，在溶出液的吸光度穿透IO %的時刻，求出添加的多克隆humanIgG的質量，算出動態結合容量。
[0181]如圖3所示，實施例2的柱與比較例4~8相比，顯示出高動態結合容量。在滯留時間為I分鐘的高線流速區域中，瓊脂糖類載體的比較例5~7為20~30mg/mL-柱床，CPG類載體的比較例8以及製造例2的柱的比較例4為約40mg/mL-柱床，相對於此，實施例
2的柱顯示出約60mg/mL-柱床的高性能。
[0182]產業上利用的可能性
[0183]本發明的二氧化矽球狀體，可用於前述的在二氧化矽球狀體上固定有配體的結合容量大的親和載體的製造。
[0184]這裡引用2011年10月28日提出申請的日本專利申請2011-237204號的說明書、權利要求書、附圖和摘要的全部內容作為本發明的說明書的揭示。[0185]符號說明
[0186]I丙烯酸樹脂制板
[0187]2丙烯酸樹脂制板
[0188]3不鏽鋼板
[0189]3a流道
[0190]4不鏽鋼板
[0191]4a微孔
[0192]5連續相供給部
[0193]6連續相排出部
[0194]7分散相供給部
【權利要求】
1.一種二氧化矽球狀體，其特徵在於， (a)利用雷射式光散射法的測定方法中，平均粒徑為30μ m~40 μ m ; (b)利用庫爾特計數法的測定方法中，粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始為10%的粒徑DlO與90%的粒徑D90之比、即D10/D90在1.50以下； (c)利用水銀壓入法的測定方法中，平均細孔徑在85nm~115nm的範圍內，細孔容積在1.5mL/g 以上。
2.如權利要求1所述的二氧化矽球狀體，其特徵在於，所述的粒徑分布的體積換算的累積量從較小側開始為10%的粒徑DlO與90%的粒子徑D90之比、即D10/D90在1.35以下。
3.如權利要求1或2所述的二氧化矽球狀體，其特徵在於，所述的平均粒徑為33μ m~37 μ m0
4.如權利要求1~3中任一項所述的二氧化娃球狀體,其特徵在於,具有55m2/g~75m2/g的比表面積。
5.一種親和載體，其特徵在於，含有權利要求1~4中任一項所述的二氧化娃球狀體，且在所述的二氧化矽球狀體上固定有配體。
6.如權利要求5所述的親和載體，其特徵在於，配體為A蛋白，該A蛋白的固定化量在I Omg/mL-柱床以上 。
7.如權利要求5所述的親和載體，其特徵在於，具有50mg/mL-柱床以上的動態結合容量。
【文檔編號】G01N30/88GK103906708SQ201280052688
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年10月26日 優先權日:2011年10月28日
【發明者】宮原浩嘉, 中島亮, 東賢志 申請人:旭硝子矽素技術株式會社