雙歧桿菌和含有它們的製品的製作方法

2023-05-18 16:05:06 1

專利名稱：雙歧桿菌和含有它們的製品的製作方法
技術領域：
本發明涉及長雙歧桿菌的非致病性微生物在輔助胃腸保健且特別是在預防和/或治療胃腸道不適、尤其是腸不適中的應用。
背景技術：
長時間以來已得知被用作對食品防腐或製備如酸牛奶這樣的乳品或其它乳製品的發酵劑的許多類型細菌；這些細菌一般稱作「乳酸菌」且包括許多屬，如乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬。
近來這些細菌已經成為更為關注的對象，這是因為當吞咽下這些細菌時，它們表現出對人和動物的顯著特性；特別是有時聯合施用的乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的菌株已經通過防止其它有害微生物定居而在定居腸黏膜和輔助人體保健方面表現出功效，正如美國專利US5,494,664和US 6,241,983以及國際專利申請WO 0033854和WO0110453中所證實的。
這些微生物也稱作「益生菌」且對其有益作用的基本需求在於它們可以以一定的數量和一定的活力到達黏膜，使得它們能夠持續並定居在腸道，因此，它們必須適當耐受胃中的低pH。
在如便秘或腹瀉和使用抗生素治療後這樣的腸不適的情況下，即特別是在促使腸菌群缺乏的所有情況下且在攝取的食物中缺乏纖維、環境條件或應力降低腸菌群活力時的所有情況下推薦指定的益生菌產品。
為了恢復人體菌群中天然存在的微生物的適宜水平，使用完全定性的並提取自健康人體的菌群的細菌菌株是這類施用的目標。
外源性微生物在腸中的定居活性取決於其濃度、其定居能力和它們在腸中找到的環境條件，因為給予更大量、高定居能力和適宜的環境條件有助於它們通過定居在腸中的大部分區域而起到防護和治療作用，卻不會因為它們是天然來源的產物而產生副作用。特別必須強調的是可能存在的例如菊糖或低聚果糖類這樣的營養纖維主要輔助所述的定居，因為這些化合物是益生菌的底物且由此它們增加定居的機會。所述的寡糖類因這種與益生菌的協同作用也稱作「益生素」。

發明內容
本發明的主題是命名為W11和W11a的寄存在比利時微生物協作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心的長雙歧桿菌的兩個菌株的生物純培養物，其中BCCM LMG-保藏中心已經給上述兩個菌株登記了保藏號LMG P-21586和LMG P-21587；上述生物純培養物作為藥物或營養型製品中的益生菌的應用；和含有它們的用於輔助胃腸保健並預防和治療腸道疾病的藥物或營養型製品。
已經從健康人的腸菌群中分離出了長雙歧桿菌的兩個菌株W11和W11a且在同期分離的許多其它長雙歧桿菌菌株中篩選出了它們，因為它們已經表現出在腸菌群上的定居能力和粘著腸細胞的能力，這兩個特徵使得它們成為能夠輔助胃腸道良好健康狀態和由不同起因的胃腸炎中恢復其被改變的功能的良好益生菌。
首先在實驗室中且隨後在工業化製備中生產了本發明主題的細菌培養物且它們由已經在37℃下和適宜的培養基中生長了20小時的純菌株製成，所述的適宜培養基稱作TPY，它含有作為主要成分的胰蛋白酶酪蛋白腖、大豆腖、酵母抽提物和葡萄糖並含有鉀、鈣、鎂和鋅的鹽。
已經由這些初級培養物製備了隨後的傳代培養物，目的在於增加純菌株的數量，直到獲得被用作用於兩種益生菌長雙歧桿菌W11和W11a的細菌培養物的工業化生產的接種物的菌母為止。
所述細菌培養物的工業化生產方法包括下列步驟
1.在控制在5.5-7.5的pH下發酵；2.通過離心從培養物肉湯中分離細菌生物質；3.在添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫保護劑後凍幹所述的細菌生物質以便在冷凍和凍幹步驟中保護細胞的活力，可能還需要在增加菌株耐受酶降解和酸性pH條件的能力範圍內添加蛋白沉澱劑；4.磨碎凍幹的培養物並使之成粒。
按照本領域技術人員所公知的細菌計數的微生物學方法進行的分析，例如在Ison A.P.和Matthew G.B.的應用微生物生理學(Applied Microbial Physiology)中的「一種實施手段」(apractical approach)，Rhodes P.M.和Stanbury P.F.Editors-IRL Press Oxford，103-130，1997中所報導的，如此製備的產物含有約1×1010-約1×1012個長雙歧桿菌W11或W11a的活細胞的平均值/克終產物。
已經在帶有陽性結果的小鼠腸中的定居試驗中檢驗了所述的細菌培養物，此時，長雙歧桿菌LMG P-21586或LMG P-21587的細菌加載量的計數已經顯示出高於1×106個活細胞/克小鼠糞便的值。
確切地說作為主要目的，本發明的另一個目的是獲自長雙歧桿菌W11或W11a菌株的生物純培養物作為輔助胃腸保健並預防和治療腸疾病的藥物或營養型製品中的益生菌的用途，其中所述的腸疾病如腹瀉、不同起因的胃腸炎、便秘、腸過敏、憩室病和腸的慢性炎症性疾病。
可以通過向含有長雙歧桿菌W11或W11a的細菌培養物的藥物或營養型製品中添加難消化的寡糖類形式的營養纖維來提高含有長雙歧桿菌W11或W11a的細菌培養物在輔助腸道保健中的功效，所述的難消化的寡糖類例如有低聚果糖類或菊糖，它們在腸道上部既不會被吸收也不會被水解並可強化所述的活性且刺激長雙歧桿菌LMG P-21586和LMG P-21587菌株的代謝至對致病菌不利。在實施本發明過程中優選的寡糖類是由存在於葡萄糖分子(G)中的基本單元構成的具有2-20的聚合度、即一定數量的單糖單位的低聚果糖的混合物，其中所述的葡萄糖分子(G)與通式GFn的果糖分子(F)鏈結合，其中，n≤4。用作與本發明主題的兩種類型益生菌混合的益生素的低聚果糖類具有2-10、優選3-6的聚合度。
本發明主題的製品可以含有維生素、優選E、B1、B2、B6和B12族維生素以及各種賦形劑，如增甜劑，例如天冬甜素、甘露糖醇或山梨醇；調味劑；和著色物質；這些製品具有通過恢復在腸道疾病過程中顯著減少的維生素成分而進一步提高健康的能力。
本發明的目的是含有稱作W11和W11a且LMG P-21586或LMGP-21587保藏號登記的長雙歧桿菌的細菌培養物的藥物製劑和營養產品，它們可選地含有益生素，優選低聚果糖類或菊糖和/或維生素、優選E、B1、B2、B6和B12族維生素。
所述的藥物製劑優選由可通過口服途徑給藥的組合物製成，其劑型有膠囊、片劑、袋裝製劑、錠劑、液體混懸劑、幹口服補劑、液體口服補劑、瓶裝製劑等，它們含有穩定期結束時1×107-1×1011個長雙歧桿菌W11或W11a的活細胞的細菌加載物。
所述的藥物製劑還可以含有益生素，如低聚果糖或菊糖，優選每個劑量含有0.5-5g的低聚果糖、更優選1-3g；和/或維生素，優選E、B1、B2、B6和B12族維生素。
還可以在許多類型的營養產品的生產過程中混入1×107-1×1011個活細胞量的長雙歧桿菌益生菌，所述的營養產品如乳品；酸奶；新鮮乾酪，如乳清乾酪、斯特拉希諾乾酪和莫澤雷勒乾酪(義大利乾酪類)；冰淇淋；由發酵乳品製成的產品；由發酵穀物製成的產品；奶粉；兒童產品和家養動物產品。
對細菌計數檢驗的測試已經證實作為本發明目的的長雙歧桿菌的兩個菌株是耐受性的，因此它們在藥物或營養製品生產的工藝過程中或在其儲存的整個正常期限中不會發生大量死亡。實際上，已經將這些細菌製品提交進行穩定性試驗，該試驗顯示兩個細菌菌株在室溫下具有極佳的耐受性，使得它們在製成後的銷售期不少於2年。
下文報導的實施例用於進一步解釋本發明但不應看作是對本發明的限定。
實施例1長雙歧桿菌W11菌株的細菌培養物的生產方法用作工業化發酵中的接種物的長雙歧桿菌W11菌株的「初級培養物」確實與寄存在比利時微生物協作保藏中心(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voor Microbiologie，Universiteit Gent的菌株相同，BCCM LMG-保藏中心在接受送達的該菌株時已經確認了該菌株的純度和活力並已經登記了其保藏號為LMG P-21586。
為了得到這種「初級培養物」，將所述的菌株培養在稱作TPY的含有下列組成的培養基中，以1升為準酪蛋白的胰蛋白酶腖 10g大豆腖 5g酵母抽提物 5g葡萄糖 10g無水K2HPO42gMgCl2·6H2O 0.5gZnSO4·7H2O 0.25gCaCl2·2H2O 0.15gTween 80 1ml鹽酸半胱氨酸 0.5g雙蒸水 適量至1000ml在37℃下使培養進行20小時且然後將該培養物分裝入管形瓶，向其中添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫防護劑，然後將管形瓶冷凍並儲存在-196℃下的液氮中。
由接種物百分率為3％的該「初級培養物」作為原料製備3種傳代培養物，目的是為了增加所述細菌菌株的細胞數量。
將稱作「菌母」的約10升最後傳代培養物用於給具有約300升容量的「即刻培養物」反應器接種。
隨後的長雙歧桿菌W11的生物純培養物的工業化生產過程包括下列步驟1.在控制在6.5-7.0的pH下發酵；2.從培養物肉湯中分離細菌生物質；3.通過添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫防護劑溶液保護所述的細菌生物質以便在以後的冷凍和凍幹步驟中保護細胞的活力，且可能還需要包括添加蛋白沉澱劑，目的在於使所述菌株耐受酶降解和酸性pH條件；4.凍幹；5.磨碎凍幹的培養物並使之成粒；6.摻合凍幹的培養物；7.包裝。
所得的產物含有約8-10×1010個活細胞/克。
實施例2長雙歧桿菌W11a菌株的細菌培養物的生產方法按照實施例1中所述的方法、通過以確實對應於寄存在比利時微生物協作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voorMicrobiologie，Universiteit Gent的長雙歧桿菌菌株的「初級培養物」作為原料製備了長雙歧桿菌W11a的生物純的細菌培養物，BCCM LMG-保藏中心在接受送達的該菌株時已經確認了該菌株的純度和活力並已經登記了其保藏號為LMG P-21587。
實施例3體內定居試驗對各含2隻小鼠的4組小鼠進行試驗，每隻小鼠接受2次劑量的含有濃度等於1.6×109CFU/60μl的長雙歧桿菌LMG P-21586的葡萄糖溶液，第一次劑量後16小時給予第二次劑量。
通過計算存在於糞便中的長雙歧桿菌的量檢驗了所述菌株在這些小鼠腸中定居的能力在開始給藥前進行第一次取樣，而在第二次給藥後的2、4、8、24、48小時分別進行隨後的取樣。在糞便中發現的長雙歧桿菌菌株的量在106CFU/g左右，由此表明定居發生。特別發現相對於在糞便中發現的雙歧桿菌的所有菌株而言長雙歧桿菌是得到的菌群中的主要成分。
實施例4裝有低聚果糖類和維生素的袋裝製品將袋裝製品作為實施例報導，它們各自重3g、可以在水或奶中溶解且含有相當於約2×1010個長雙歧桿菌W11的活細胞、2500mg的低聚果糖類和B1、B2、B6和B12族維生素的250mg生物純的細菌培養物。
將商購稱作Actilight950P的由通過與n≤4並具有2-10的聚合度的通式GFn的一個葡萄糖分子連接的果糖分子鏈形成的低聚果糖類混合物構成的產品特別被用作低聚果糖。
該袋裝組分的具體成分-含量如下

製備方法第一步將維生素與等份的Actilight950P進行混合，隨後在淨孔徑為0.5mm的篩上過篩。將這第一步的混合物加入到第二個等份的Actilight950P中並進行第二個混合步驟。最後加入長雙歧桿菌W11的細菌培養物、剩餘等份的Actilight950P和製品中的其它成分，同時進行進一步的混合，隨後在0.8mm的篩上進行最終的過篩。
然後將產品分裝入重3g的鋁袋中。該鋁袋的製備工藝過程不會對所述菌株的活力產生任何損害。
穩定性試驗通過在0時且分別在22℃下儲存1、2和3個月後測定細菌加載量對所述袋進行穩定性試驗，由此確定半衰期。在1、2和3個月後的數據分析表明在這些期限中死亡率極低，從而使2年後就每個劑量而言上述袋裝製品中活細胞的數量不低於5×109個細胞。所述的結果表明該製品足以達到本發明需要達到的水平。
實施例5裝有維生素的軟膠囊製劑已經通過以下步驟製備了具有下列成分-含量的軟膠囊

製備長雙歧桿菌W11的細菌培養物、維生素、大豆卵磷脂和脂肪酸的單和二甘油酯溶於大豆油的均勻混懸液；將所述的混懸液分裝入由營養明膠、甘油、二氧化鈦和黃色氧化鐵製成的7.5號大小的橢圓形膠囊中且隨後在約21℃的溫度和約20％的溼度下的氣流中乾燥。
權利要求
1.由長雙歧桿菌的菌株LMG P-21586製成的生物純培養物。
2.由長雙歧桿菌的LMG P-21587菌株製成的生物純培養物。
3.權利要求1和2中之一的生物純培養物作為用於輔助胃腸保健並預防和治療腸道疾病的藥物或營養型製品中的益生菌的用途。
4.含有來源於由長雙歧桿菌菌株LMG P-21586製成的生物純培養物的1×107-1×1011個活細胞的細菌加載物的藥物或營養型製品。
5.含有來源於由長雙歧桿菌菌株LMG P-21587製成的生物純培養物的1×107-1×1011個活細胞的細菌加載物的藥物或營養型製品。
6.權利要求4和5中之一的製品，其特徵在於它們含有寡糖形式的益生素。
7.權利要求6的製品，其特徵在於所述的寡糖是具有2-10聚合度的低聚果糖或菊糖。
8.權利要求4-7中之一的製品，其特徵在於它們含有維生素。
9.權利要求8的製品，其特徵在於所述的維生素是維生素E、B1、B2、B6和B12。
10.權利要求4-9中之一的製品，其特徵在於它們選自膠囊、片劑、袋裝製劑、錠劑、液體混懸劑、幹口服補劑、液體口服補劑、瓶裝製劑、乳品、酸牛奶、新鮮乾酪、冰淇淋、由發酵穀物製成的產品、奶粉、兒童產品和家養動物產品。
全文摘要
本發明涉及命名為W11和W11a並寄存在比利時微生物協作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)(BCCM)的長雙歧桿菌的兩個菌株的生物純培養物，其中BCCM已經給上述兩個菌株登記了保藏號LMG P－21586和LMG P－21587；本發明涉及上述生物純培養物作為藥物或營養型製品中的益生菌的用途並涉及含有它們的用於輔助胃腸保健並預防和治療腸道疾病的藥物或營養型製品。
文檔編號A23K1/18GK1480528SQ0317840
公開日2004年3月10日 申請日期2003年7月15日 優先權日2002年9月6日
發明者G·C·威斯科米, G C 威斯科米, L·G·羅蒂尼, 羅蒂尼, ＠, L·莫埃裡, P·費拉裡, 潘塔裡奧, M·R·潘塔裡奧 申請人:阿爾法·瓦瑟曼公司, 阿爾法 瓦瑟曼公司