含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法
2023-05-18 16:06:26 2
專利名稱：含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法
技術領域：
本發明屬於病毒蛋白技術領域，尤其涉及一種通過無機納米顆粒誘導病毒蛋白自組裝、從而構建獲得藥物輸運或造影載體的方法。
背景技術：
病毒作為地球上基因多樣性最豐富的生物體，擅長於把長基因組通過馬達分子進行摺疊，然後裝載到外殼中，形成成熟的病毒。病毒一般有兩種方式裝載基因組1、噬菌體先通過一個頭部的馬達蛋白複合物對基因進行摺疊，然後裝配成成熟的病毒；2、豇豆褪綠斑駁病毒(Cowpea Chlorotic Mottle Virus, CCMV)的裝配方式邊壓縮基因組邊進行組 裝，蛋白和基因相互作用並進行摺疊，同時其它的蛋白也裝配上去。在病毒的外殼結構蛋白中，常常會出現一段非常保守的結構，即八個反向平行的β_片層結構和連結這些結構的環，在不同的病毒之間，此八個反向平行的片層結構是非常相似的，而連結環卻變化很大，目前對於出現這種結構的機理尚不清楚。在病毒的內殼結構蛋白中，肽鏈的氨基末端會伸展出一段帶正電荷的胺基酸，研究發現，能包裝基因組的長度和該段胺基酸的電荷量成正比，可以表示為Λ = n Q (其中，Λ為基因的長度，Q為與基因相互作用的胺基酸的電荷量，n= Λ/Q，在不同的病毒中，n為一個恆定值)。利用病毒裝載外源基因的能力，使病毒從致病體變為基因治療方面有用的生物材料的應用研究很早就開始了。1989到2004年期間，75%的基因治療方面的研究都是以病毒為載體進行的。但是，病毒載體存在一些問題，如病毒本身的基因與宿主的基因組發生整合，從而引起一些潛在疾病的發生。一般認為，病毒載體的缺陷主要來自於其所包含的基因組，所以，去除基因組的病毒將會在醫學中發揮巨大作用，病毒外殼蛋白體外自組裝剛好可以解決這個問題。利用病毒蛋白自組裝的特性，人們嘗試了裝載其它的外源物質(非核酸)到VLPs的內腔中，構建藥物輸運或造影載體。目前存在三類外源物質的裝載方式I)病毒基因組去除後，在內腔中進行化學合成；2)以功能化的納米顆粒為模板，誘導外殼蛋白進行自組裝；3)在外殼蛋白的特定位點進行定點修飾，形成載藥體系。把外源性的納米顆粒裝載進入VLPs的過程中，病毒外殼蛋白與納米顆粒的靜電相互作用、納米顆粒的形貌和尺寸等性質對裝載效率影響較大。目前報導的文獻中，大多是把納米顆粒進行仿基因組的負電修飾，誘導外殼蛋白進行自組裝，形成複合的「生物-非生物」納米材料。這樣的材料在醫學應用中有許多優勢可以改善納米顆粒的生物相容性；延長體內循環時間；可使納米顆粒外面攜帶上其它化學基團，方便其它修飾等。反過來，納米材料也可以改變VLPs的性質，如打破病毒的天然組裝，使其組裝成其它形式的VLPs,如電荷、結構和粒徑的改變等,這樣的改變可能不止在癌症的診斷和治療中有著潛在應用，在病毒本身的機制方面，如組裝、感染途徑、疫苗研究等，也能帶來潛在運用。
發明內容
鑑於上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提出一種含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法。本發明的目的將通過以下技術方案得以實現
一種含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，首先對無機納米顆粒的表面進行正電修飾，然後誘導病毒外殼蛋白圍繞所述正電修飾的納米顆粒進行自組裝，從而獲得藥物輸運或造影載體成品。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述誘導病毒外殼蛋白圍繞所述正電修飾的納米顆粒進行自組裝的方法如下取摩爾比為1:20 1:60正電修飾的納米顆粒和病毒蛋白，在pH值為4 9的緩衝液中進行組裝，溫度為10°C 40°C，時間為3h 16h，組裝完成後在IOOOOrpm 30000rpm轉速條件下進行離心分離，水洗後得到藥物輸運或造影載體成品。 優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述緩衝液為碳酸鈉-碳酸緩衝液，Tris-HCl緩衝液或者PBS緩衝液中的任意一種。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述病毒蛋白為輪狀病毒外殼蛋白VP6，輪狀病毒外殼蛋白VP2，噬菌體外殼蛋白VPl，肝炎外殼病毒VP2，黃瓜花葉病毒外殼蛋白VPl，衛星稷子花葉病毒外殼蛋白VPl或者虹彩病毒科病毒外殼蛋白VPl中的任意一種。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述無機納米顆粒為金納米顆粒，二氧化矽包被的四氧化三鐵納米顆粒，銀納米顆粒，硒化鎘量子點，稀土類上轉換發光材料，二氧化矽納米球或者二氧化鈦納米顆粒中的
任意一種。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述無機納米顆粒為金納米顆粒，所述金納米顆粒是由氯金酸經聚乙烯亞胺經原位還原製得。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述無機納米顆粒為二氧化矽包被的四氧化三鐵納米顆粒，所述二氧化矽為表面多孔二氧化矽，孔內裝載有帶有正電荷的化合物。優選地，上述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其中所述帶有正電荷的化合物為阿黴素。本發明的突出效果為本發明利用表面正電修飾的無機納米顆粒誘導病毒蛋白進行自組裝，獲得了外表面包覆病毒外殼蛋白的納米顆粒，病毒蛋白的修飾改善了納米顆粒的生物相容性、血液中的穩定性、體內循環時間等，使其更適合體內應用；另外，納米顆粒可以改變病毒蛋白的天然組裝方式，為病毒的基礎研究和疫苗開發等找到了新的策略。
圖I是本發明實施例I的原理 圖2是本發明實施例I的金納米顆粒的TEM圖片，標尺為50 nm ；圖3是本發明實施例I的誘導組裝的VP6-金納米顆粒的TEM圖片，標尺為50 nm ；
圖4是本發明實施例2的攜帶了阿黴素的Fe3O4OSiO2納米顆粒的TEM圖片，標尺為50
nm ；
圖5是本發明實施例2的誘導組裝的VP6- Fe3O4OSiO2納米顆粒的TEM圖片，標尺為200nm。
具體實施例方式下面通過具體實施例並結合附圖對本發明技術方案作進一步說明，所舉實施例僅為典型示例，本發明並不局限於此。實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實施例I :金納米顆粒誘導輪狀病毒外殼蛋白VP6自組裝
本實施例使用的金納米顆粒的合成是以氯金酸為原料，聚乙烯亞胺(PEI)為還原劑，由於PEI帶有氨基，其上帶有正電荷，這樣反應完成後所得到的金納米顆粒表面即帶有正電荷。根據還原劑PEI和反應時間的不同，可以得到不同粒徑的金納米顆粒。用TEM進行表徵，如圖2所示PEI為還原劑進行金納米顆粒的合成，經過洗滌和離心，得到粒徑為IOnm 30nm的金納米顆粒。如圖I所示，金納米顆粒誘導輪狀病毒外殼蛋白VP6自組裝的方法如下首先對金納米顆粒表面進行正電修飾，修飾的方法可以是以PEI為還原劑進行合成，以使金納米顆粒表面帶有氨基，也可以是用物理或化學方法對金納米顆粒進行氨基或其它正電荷修飾；然後取摩爾比為1:20 1:60的正電修飾的金納米顆粒和輪狀病毒外殼蛋白VP6，在pH值為4 9的碳酸鈉-碳酸緩衝液中進行組裝，溫度為10°C 40°C，時間為3h 16h，組裝完成後在轉速為IOOOOrpm 30000rpm的條件下進行離心分離，水洗後得到成品。用TEM進行表徵，如圖3所示，正電荷的金納米顆粒誘導VP6進行組裝，形成金納米顆粒-VP6的核殼結構,粒徑為10 nm 60nm。結果表明，金納米顆粒成功地對輪狀病毒外殼蛋白VP6進行了誘導組裝，這樣的組裝方式主要是靠靜電相互作用，即輪狀病毒外殼蛋白VP6上的負電荷與金納米顆粒表面的正電荷相互作用後進行組裝。實施例2 :二氧化矽包覆的四氧化三鐵納米顆粒和病毒蛋白相結合的複合載藥體系
本實施例將四氧化三鐵包被二氧化矽後，在二氧化矽表面進行致孔，使其孔內可以攜帶抗癌藥物阿黴素，同時四氧化三鐵可以起到磁靶向的作用。由於阿黴素上的正電荷的作用，可以使二氧化矽表面攜帶正電荷，從而對二氧化矽包覆的四氧化三鐵納米顆粒進行正電修飾，用TEM進行表徵，如圖4所示，四氧化三鐵納米顆粒進行二氧化矽的包覆，用致孔劑在二氧化矽層進行致孔，用物理吸附的方法把帶正電荷的阿黴素吸附到二氧化矽孔，形成帶有表面正電荷的納米顆粒，用於病毒蛋白的誘導組裝。具體方法如下取摩爾比為1:20 1:60的攜帶了阿黴素的Fe3O4OSiO2納米顆粒和輪狀病毒外殼蛋白VP6，在pH值為4 9的碳酸鈉-碳酸緩衝液中進行組裝，緩衝液還可以是pH值為4 9的Tris-HCl緩衝液或者PBS緩衝液，溫度為10°C 40°C，時間為3h 16h，組裝完成後在IOOOOrpm 30000rpm轉速條件下進行離心分離，水洗後得到成品。用TEM進行表徵，如圖5所示，病毒蛋白包被的四氧化三鐵納米顆粒，粒徑為20nm 60nm。結果表明，輪狀病毒外殼蛋白VP6在二氧化矽的表面進行了自組裝，這樣的組裝方式改善了無機納米體系的性質，解決了 Fe3O4OSiO2體系在藥物體內輸運中面臨的許多問題，如生物相容性、分散性、水溶性等得到改善，並使該體系所載的藥物不容易滲漏。另外，蛋白外表面豐富的氨基、羧基和巰基等基團，可以為該載體的進一步修飾提供位點。除上述兩個實施例外，可選地，病毒蛋白還可以為輪狀病毒外殼蛋白VP2，噬菌體外殼蛋白VP1，肝炎外殼病毒VP2，黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)外殼蛋白VP1，衛星稷子花葉病毒(Satellite panicum mosaic virus, SPMV)外殼蛋白VPl,或者虹彩病毒科(Iridoviridae family)病毒外殼蛋白VPl等；無機納米顆粒還可以為銀納米顆粒，硒化鎘量子點，稀土類上轉換發光材料，二氧化矽納米球，或者二氧化鈦納米顆粒等。 由此，本發明可以有多種實施方式，凡採用等同變換或者等效變換而形成的所有技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於首先對無機納米顆粒的表面進行正電修飾，然後誘導病毒外殼蛋白圍繞所述正電修飾的納米顆粒進行自組裝，從而獲得藥物輸運或造影載體成品。
2.根據權利要求I所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述誘導病毒外殼蛋白圍繞所述正電修飾的納米顆粒進行自組裝的方法如下取摩爾比為1:2(Tl:60的正電修飾的納米顆粒和病毒蛋白，在pH值為4 9的緩衝液中進行組裝，溫度為10°C 40°C，時間為3h 16h，組裝完成後在IOOOOrpm 30000rpm轉速條件下進行離心分離，水洗後得到藥物輸運或造影載體成品。
3.根據權利要求2所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述緩衝液為碳酸鈉-碳酸緩衝液，Tris-HCl緩衝液或者PBS緩衝液中的任意一種。
4.根據權利要求I所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述病毒蛋白為輪狀病毒外殼蛋白VP6,輪狀病毒外殼蛋白VP2,曬菌體外殼蛋白VPl，肝炎外殼病毒VP2，黃瓜花葉病毒外殼蛋白VPl，衛星稷子花葉病毒外殼蛋白VPl或者虹彩病毒科病毒外殼蛋白VPl中的任意一種。
5.根據權利要求I所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述無機納米顆粒為金納米顆粒，二氧化矽包被的四氧化三鐵納米顆粒，銀納米顆粒，硒化鎘量子點，稀土類上轉換發光材料，二氧化矽納米球或者二氧化鈦納米顆粒中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述無機納米顆粒為金納米顆粒，所述金納米顆粒是由氯金酸經聚乙烯亞胺經原位還原製得。
7.根據權利要求5所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述無機納米顆粒為二氧化矽包被的四氧化三鐵納米顆粒，所述二氧化矽為表面多孔二氧化矽，孔內裝載有帶有正電荷的化合物。
8.根據權利要求7所述的含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，其特徵在於所述帶有正電荷的化合物為阿黴素。
全文摘要
本發明揭示了一種含病毒外殼蛋白及無機納米顆粒的藥物輸運或造影載體的構建方法，首先對無機納米顆粒的表面進行正電修飾，然後誘導病毒蛋白圍繞所述正電修飾的納米顆粒進行自組裝。本發明利用表面正電修飾的無機納米顆粒誘導病毒蛋白進行自組裝，獲得了外表面包覆病毒外殼蛋白的納米顆粒，病毒蛋白的修飾改善了納米顆粒的生物相容性、血液中的穩定性、體內循環時間等，使其更適合體內應用；另外，納米顆粒可以改變病毒蛋白的天然組裝方式，為病毒的基礎研究和疫苗開發等，找到了新的策略。
文檔編號A61K49/14GK102886048SQ20121040103
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者趙慶歡, 劉紅海, 樂曉桐, 李詠梅, 顧莉娟 申請人:蘇州百拓生物技術服務有限公司