一種雙氨基peg-抗菌肽的製備方法
2023-05-18 04:03:36 1
專利名稱：一種雙氨基peg-抗菌肽的製備方法
技術領域：
本發明屬於藥物製劑領域，特別涉及一種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，具體是提供了一種經過了雙氨基PEG枝接處理的 組合物，本發明提高了抗菌肽對胃液的穩定性，對其推廣使用帶來了極大的便利。
背景技術：
抗菌妝(antibactericalpeptides),又稱抗微生物妝(antimicrobialpeptides)或肽類抗生素(peptide antibiotics),是指存在於生物體內具有抵抗外源微生物侵害、消除體內突變細胞的一類具有生物活性的小分子多肽，是生物體先天免疫的重要組成部分，廣泛分布於細菌、病毒等微生物和各種動植物體內。抗菌肽作為防禦外界微生物的第一道防線，具有抗菌效率高、抗菌譜廣、熱穩定性高、作用機制獨特等特點。更為重要的是，抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，一般只作用於原核細胞和發生病變的真核細胞，並且不會像傳統抗生素那樣使致病菌產生耐藥性。「無毒、無殘留、無耐藥性」是新一代抗菌製劑的發展趨勢和要求，因此，抗菌肽受到了人們的廣泛關注，國內外學者在研究其一級結構的基礎上，採用分子生物學和基因工程技術大批量表達抗菌肽，已經成為臨床新一代抗菌藥的來源。蛋白質或多肽的穩定化處理方法主要有生物法(基因工程法)、化學法(側鏈修飾法和骨架改造)、物理法(緩釋法)等。不同的方法適應範圍不同，效果不同，給藥方法不同，安全性也不同。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾即 PEG 化(pegylation),是將活化的PEG通過化學方法以共價鍵偶聯到蛋白質或多肽分子上，活化的PEG與PEG有顯著的不同，很多直接用PEG枝接並不能得到理想的結果，因此選擇合適的活化PEG在蛋白修飾中很關鍵。活化PEG修飾具有半衰期延長、免疫原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學和生物穩定性增強等。由於多肽通過口服使用容易在消化道中受到蛋白酶的降解而失去活性，抗菌肽的注射效果遠高於口服效果，在畜禽動物疾病防控方面，注射劑使用非常不方便，為了開發口服抗菌肽，發明人經過了長期有效的研究，獲得了耐酸和蛋白酶、口服穩定性大大提升的雙氨基PEG修飾抗菌肽製劑。
發明內容
本發明提供了一種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法。其中抗菌肽經過了雙氨基PEG穩定化處理。經過雙氨基PEG處理後的抗菌肽具有如下結構特徵
PEG-0-C-NH-CH2-C-NH- antibacterial peptides 0其中抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)可以是基因工程方法獲得的，也可以天然提取的。
其中雙氨基聚乙二醇的分子量在1000-20000之間。雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，包括以下關鍵步驟第一步，將抗菌肽用pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩衝液溶解，配製成濃度為l-10mg/ml的溶液；第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 0.5-10的重量比例，在第一步的溶液中加入雙氨基PEG ；第三步，把上述混合液在15_75°C條件下反應0. 5-4小時；第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應；第五步，採用色譜柱法分離產物。所述雙氨基PEG-抗菌肽在製備抗菌藥物中的應用。本發明的技術優勢本發明提供的雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，很好的解決了抗菌肽給藥後的胃液對其快速降解的問題，口服製劑性質穩定、容易到達機體腸道，發揮抗菌活性，有望提升抗菌肽在臨床使用的效果和範圍。
具體實施例方式結合以下實施例可以觀察到本發明的有益性質，這些實施例是說明性的，不會對本發明構成限制。實施例I酵母細胞表達的抗菌肽LL37凍乾粉雙氨基PGE4000，pH6. 0的磷酸鹽緩衝液參藥典方法進行配製。配製操作規程、環境和器材要求均要完全符合獸藥GMP生產要求。組合物的配製方法是第一步，將抗菌肽用pH6. 5的磷酸鹽緩衝液溶解，配製成濃度為5mg/ml的溶液；第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 2的重量比例，在第一步的溶液中加入雙氨基 PEG ；第三步，把上述混合液在室溫條件下反應4小時；第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應；第五步，以葡聚糖G-25為填充材料的分子排阻色譜對雙氨基PEG-抗菌肽進行一步純化，洗脫液為PH6. 5磷酸鹽緩衝液，用280nm波長進行紫外光吸收檢測，分別收集含雙氨基PEG-抗菌肽的洗脫液和未修飾的抗菌肽部分。實施例2酵母細胞表達的抗菌肽Fowlicidin-3凍乾粉雙氨基PGE10000pH7. 0的磷酸鹽緩衝液參藥典方法進行配製。配製操作規程、環境和器材要求均要完全符合獸藥GMP生產要求。組合物的配製方法是
第一步先將抗菌肽用pH7. 0的磷酸鹽緩衝液溶解，配製成濃度為lmg/ml的溶液；第二步按抗菌肽雙氨基PEG為I : 5的物質的量的比例，在第一步的溶液中加入雙氣基PEG ；第三步把上述混合液在室溫條件下反應2小時後，第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應；第五步，反應中止後，以葡聚糖G-25為填充材料的分子排阻色譜對雙氨基PEG-抗菌肽進行一步純化，洗脫液為PH7. 0磷酸鹽緩衝液，用280nm波長進行紫外光吸收檢測，分別收集含雙氨基PEG-抗菌肽的洗脫液和未修飾的抗菌肽部分，即得目標產品。實施例3雙氨基PEG-抗菌肽製劑耐酸和蛋白酶的穩定性考察評價方法、考察結果除非有另外說明，否則都採用以下的步驟進行耐胃液破壞性評價。3. I 原理根據豬胃消化液的主要成分及消化環境，在體外建立模擬胃消化體系，將抗菌肽、雙氨基PEG-抗菌肽在該體系中進行消化，對60min消化樣品進行蛋白含量測定，確定該蛋白在模擬胃液中被消化的穩定性。3. 2試劑和材料3. 2. I測試蛋白抗菌肽為市場購買的酵母菌發酵的LL37蛋白，雙氨基PEG-抗菌肽為實施例I、實施例2產品，分別稱取50mg樣品蛋白，定容於ImL重蒸懼水中，混勻。3. 2. 2不穩定對照蛋白溶液模擬胃液消化不穩定對照蛋白溶液選用酪蛋白(a -casein)作為模擬胃液消化不穩定對照，配製方法為稱取50mg樣品蛋白，定容於ImL重蒸懼水中，混勻。模擬胃液消化穩定對照蛋白溶液選用大豆胰蛋白酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor, STI)作為模擬胃液消化穩定對照,稱取50mg樣品蛋白，定容於ImL重蒸餾水中，混勻。。3. 2. 3模擬胃消化液(SGF):本測定中採用的胃蛋白酶(p印sin)活力為2100U/
mg o稱取0. 2g氯化鈉(NaCl)和150mg胃蛋白酶，加入70mL重蒸餾水，加入730 y L鹽酸，再用鹽酸調pH至I. 2，加水定容至100mL。現用現配。3. 2. 30. 2mol/L氫氧化鈉溶液稱取0. 8g氫氧化鈉(NaOH)，溶於重蒸餾水中，定容至 IOOmL。3. 3模擬胃腸液外源蛋白質試驗方法消化反應時間為2min、60min的模擬胃液消化試驗。3. 3. I在7mL離心管中加入I. 9mL模擬胃消化液(SGF)，37°C恆溫水浴5min。力口A 100 u L樣品蛋白溶液或對照蛋白溶液(50mg/mL)，迅速漩渦振蕩並快速置於37°C水浴，準確記錄時間，反應結束後迅速加入I. OmL lmol/L碳酸氫鈉溶液，冰浴，備用。3. 3. 2胃蛋白酶對照
在I. 5mL離心管中加入190 y L模擬胃消化液(SGF)，再加入IOOy LI. 0mol/L碳酸氣納溶液，遊潤振湯後，備用。3. 3. 3試樣蛋白對照
在1.5mL離心管中加入190 ii L不含胃蛋白酶的模擬胃緩衝液，再加入100111對照蛋白(50mg/mL),同時加入IOOiiL I. Omol/L碳酸氫鈉溶液,鏇潤振蕩後備用。3. 3. 4各樣品蛋白含量測定採用福林酚測定法測定各反應結束後樣品中的蛋白質含量，記錄並比較。 3. 4結果分析與表述3. 4. I對照樣品結果分析在模擬胃消化試驗中，不穩定對照蛋白可以2min內被完全消化,而穩定對照蛋白 在60min內不能被消化，表明模擬胃/腸消化試驗體系工作正常；否則需要查找原因重新進行試驗。3. 4. 2試樣蛋白結果分析與表述在試驗體系工作正常的情況下，根據試樣蛋白含量來判斷蛋白的可消化性。表I消化不同時間後，測定樣品的蛋白質濃度
權利要求
1.一種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，其特徵在於，所述抗菌肽經過了雙氨基PEG穩定化處理。
2.根據權利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，其特徵在幹，抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)選自基因工程方法獲得、天然提取中的ー種。
3.根據權利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，其特徵在於，雙氨基PEG的分子量為1000-20000。
4.根據權利要求I所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，其特徵在於製備包括以下關鍵步驟 第一歩，將抗菌肽用PH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩衝液溶解，配製成濃度為l-10mg/ml的溶液； 第二步，按抗菌肽雙氨基PEG為I : 0.5-10的重量比例，在第一歩的溶液中加入雙氨基 PEG ； 第三步，上述混合液在15-75°C條件下反應0. 5-4小時； 第四步，在上述溶液中加入IM甘氨酸溶液終止反應； 第五步，採用色譜柱法分離產物。
5.根據權利要求1-4所述的ー種雙氨基PEG-抗菌肽，其特徵在幹，所述的雙氨基PEG-抗菌肽在製備抗菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種雙氨基PEG-抗菌肽的製備方法，經過雙氨基PEG枝接穩定化處理後，抗菌肽對胃液的耐受性得到了大幅度提升。
文檔編號C07K1/113GK102649809SQ20111004459
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月23日 優先權日2011年2月23日
發明者劉桂蘭, 王偉穎, 閆亮亮 申請人:瑞普(天津)生物藥業有限公司