輔助鑑定棉花曲葉病毒的引物組合物及其應用的製作方法
2023-05-18 03:08:01 1
輔助鑑定棉花曲葉病毒的引物組合物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種輔助鑑定棉花曲葉病毒的引物組合物及其應用。本發明提供的引物組合物，由DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ、DNA片段-Ⅳ、DNA片段-Ⅴ和所述DNA片段-Ⅴ組成，均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示，所述DNA片段-Ⅴ如序列表的序列5所示。本發明為動態監測棉花曲葉病毒在我國的情況、控制其在我國境內大規模爆發、避免我國棉花產業的經濟損失提供有力的保障。同時也可在國內的植保植檢站、科研院所、進出口棉花生產企業及農戶中大範圍推廣應用。
【專利說明】輔助鑑定棉花曲葉病毒的弓I物組合物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種輔助鑑定棉花曲葉病毒的引物組合物及其應用。
【背景技術】
[0002]棉花曲葉病毒屬於雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，為單鏈環狀DNA植物病毒，具有典型的雙聯體顆粒形態，其基因組由單一組分組成。棉花曲葉病毒無性繁殖可以誘導產生輕微的非典型症狀。侵染性分析表明，CLCuV DNAβ與CLCuV共同接種棉花後可誘導產生葉片捲縮、葉脈膨大、增厚、暗化、曲葉及耳突等CLCuV的田間典型症狀。棉花曲葉病毒主要危害棉花、扶桑、菜豆、番茄和菸草等，在棉區普遍發生，疫區田間病株率在80%以上(甚至100%)，棉花病株生長嚴重衰退，造成減產，甚至絕收，危害十分嚴重。棉花曲葉病毒可經粉蝨(Bemisia tabaci)以持久性方式傳播，也可以通過嫁接傳播。
[0003]目前，棉花曲葉病毒的檢測較常用的方法有兩種。一種是血清學檢測方法，常見的有DAS-ELISA，血清學檢測方法除了在靈敏度上存在不足外，其檢測的特異性也受到限制(同屬成員間的檢測往往有交叉反應)。另一種是分子生物學檢測方法，其中以RT-PCR最為常見，但是PCR需要特殊的儀器(PCR儀)。同時以上兩種方法均需要較長的時間，血清學方法大約需要2天，分子生物學方法大約需要5小時，無法滿足口岸快速檢疫的要求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種輔助鑑定棉花曲葉病毒的引物組合物及其應用。
[0005]本發明首先保護引物組合物甲，由DNA片段-1、DNA片段-1I ,DNA片段-1I1、DNA片段-1V和DNA片段-V組成；所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所
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[0006]本發明還保護引物組合物乙，由DNA片段-V1、DNA片段-VI1、DNA片段-珊、DNA片段-1X和DNA片段-X組成；所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示，所述DNA片段-X如序列表的序列5的反向互補序列所示。
[0007]本發明還保護所述引物組合物甲或所述引物組合物乙在製備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b):(a)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。所述植物具體可為扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生煙(Nicotiana benthamiana)或豐帛花(Chenopodiumquinoa)。所述植物材料具體可為植物葉片
[0008]本發明還保護一種試劑盒，包括所述引物組合物甲或所述引物組合物乙；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。所述植物具體可為扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersiconesculentum)、本生煙(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具體可為植物葉片。
[0009]本發明還保護所述引物組合物甲或所述引物組合物乙的應用，為如下(a)或(b):Ca)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。所述植物具體可為扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、番爺(Lycopersicon esculentum)、本生煙(Nicotiana benthamiana)或棉花(Chenopodium quinoa)。所述植物材料具體可為植物葉片
[0010]本發明還保護一種輔助鑑定棉花曲葉病毒的方法，包括如下步驟:(1)以待測病毒的基因組DNA為模板，用所述引物組合物甲或所述引物組合物乙進行環介導等溫擴增；
(2)通過檢測步驟(I)的擴增產物輔助鑑定待測病毒是否為棉花曲葉病毒。
[0011]本發明還保護一種輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒的方法，包括如下步驟:(I)以待測植物材料的總DNA為模板，用所述引物組合物甲或所述引物組合物乙進行環介導等溫擴增；(2)通過檢測步驟(I)的擴增產物輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。
[0012]基於濁度或沉澱判斷結果的原理如下:DNA複製過程中，當一個dNTP分子結合到DNA鏈上的同時會解離下一個焦磷酸根離子(PPi )，PPi與反應液中的鎂離子結合產生白色沉澱Mg2P2O7,由於DNA產物量巨大，隨之而來`的副產物Mg2P2O7量很大，因此反應體系會發生濁度變化並可觀察到白色沉澱。基於該原理，可在環介導等溫擴增的過程中通過實時濁度儀進行結果判斷，如果觀察到典型的擴增曲線、待測樣本為候選的棉花曲葉病毒或被棉花曲葉病毒侵染的植物組織，如果沒有觀察到典型的擴增曲線、待測樣本為候選的非棉花曲葉病毒或沒有被棉花曲葉病毒侵染的植物組織。基於該原理，可以根據是否產生白色沉澱進行結果判斷，自然光下，如果反應液生成白色渾濁/白色沉澱、待測樣本為候選的棉花曲葉病毒或被棉花曲葉病毒侵染的植物組織，如果反應液沒有生成白色渾濁/白色沉澱、待測樣本為候選的非棉花曲葉病毒或沒有被棉花曲葉病毒侵染的植物組織。
[0013]基於螢光染料的顏色變化判斷結果的原理如下:鈣黃綠素(鰲合劑)與試劑中的錳離子結合處於淬滅狀態，擴增反應的副產物焦磷酸離子與錳離子結合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態解除，發出黃綠色螢光。基於該原理，可以根據反應液的顏色變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列。自然光下，如果反應液由透明橙色變為微濁的黃綠色、待測樣本為候選的棉花曲葉病毒或被棉花曲葉病毒侵染的植物組織，如果沒有發生上述顏色變化、待測樣本為候選的非棉花曲葉病毒或沒有被棉花曲葉病毒侵染的植物組織。
[0014]以上任一所述的環介導等溫擴增的反應體系中，F3和B3的濃度具體可為
0.2pmol/y L, FIP和BIP的濃度具體可為1.6pmol/y L, LF的濃度具體可為為0.8pmol/μ L0
[0015]以上任一所述的環介導等溫擴增的反應程序具體可為:63°C反應60min。
[0016]環介導恆溫核酸擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP),是由Notomi T等在2000年發明的一種新穎的恆溫核酸擴增方法，它是一種高靈敏的鏈置換技術。LAMP特點是針對靶基因的6個區域設計4-6條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶-BstDNA polymerase在恆溫(60°C _65°C )的條件下反應0.5-1小時即可完成核酸擴增反應,通過目測或濁度儀就可以得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR儀等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。
[0017]本發明採用環介導恆溫核酸擴增技術鑑定棉花曲葉病毒或鑑定待測植物樣本是否侵染了棉花曲葉病毒，具有反應時間短、無需特殊儀器、操作簡便、靈敏度高及特異性好的優點，很好的克服了當前所用DAS-ELISA及RT-PCR兩類方法的不足，非常適用於進出境檢驗檢疫。本發明為動態監測棉花曲葉病毒在我國的情況、控制其在我國境內大規模爆發、避免我國棉花產業的經濟損失提供有力的保障。同時也可在國內的植保植檢站、科研院所、進出口棉花生產企業及農戶中大範圍推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】[0018]
[0019]
[0020][0021][0022][0023]
圖1為實施例2中LAMP反應體系甲的結果。
圖2為實施例2中LAMP反應體系乙的結果。
圖3為實施例3的結果。
圖4為實施例4的結果。
圖5為實施例5中LAMP反應的靈敏度的結果。圖6為實施例5中PCR反應的靈敏度的結果。
【具體實施方式】
[0024]以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。
[0025]植物基因組DNA提取試劑盒:天根生化有限公司，產品目錄號:DP305_03。Loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒:日本榮研公司，CodeNo:LMP204。Fluorescent DetectionReagent:日本榮研公司，CodeNo: slp221。
[0026]棉花曲葉病毒(Cottonleaf curl virus, CLCuV):參考文獻:R.W.Briddon, S.Mansoor, et al.1dentification of DNA Components Required for Induction of CottonLeaf Curl Disease.Virology285, 234±243 (2001)。
[0027]花椰菜花葉病毒(CaMV):參考文獻:孫敏、梁成珠等，花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子LAMP檢測方法的建立。食品科技，2010.04。
[0028]馬鈴薯卷葉病毒(PLRV):參考文獻:張磊，董家紅，張仲凱，馬鈴薯卷葉病毒RT-PCR-RFLP的檢測分析，雲南大學學報(自然科學版)，2008年SI期。
[0029]菸草花葉病毒(TMV):參考文獻:黃金光；鄧叢良；範在豐；田國忠；李懷方；菸草花葉病毒丁香分離物的分離與鑑定，植物病理學報，2004年03期。
[0030]煙粉風(genusBegomovirus):參考文獻:Shahid Mansoor, Rob ff.Briddon, etal.Geminivirus dis ease complexes:an emerging threat.TRENDS in Plant ScienceVol.8N0.3March2003。
[0031 ] 感染了棉花曲葉病毒的番茄葉片:是通過煙粉蝨將棉花曲葉病毒接種番茄植株後得到的。感染了棉花曲葉病毒的本生菸葉片:是通過煙粉蝨將棉花曲葉病毒接種本生煙植株後得到的。感染了棉花曲葉病毒的棉花葉片:是通過煙粉蝨將棉花曲葉病毒接種棉花植株後得到的。感染了棉花曲葉病毒的扶桑葉片:是通過煙粉蝨將棉花曲葉病毒接種扶桑植株後得到的。
[0032]實施例1、引物組合物的製備
[0033]設計並分別合成以下五條引物:
[0034]F3 (序列表的序列 I):5』 -TGGATGGATGAAAATATAAAGACC-3』 ；
[0035]B3 (序列表的序列 2):5』 -ACTCGCATATTGACCACC-3』 ；
[0036]FIP (序列表的序列 3):5』 -AGGITTGTCAACAGGTCGTCGGGAATCACACGAATTCGGT-3』 ；
[0037]BIP (序列表的序列 4):5』 -ACGAACCCAGTACAGCAACTTAACGGTTGCATGCCATT-3』 ；
[0038]LB (序列表的序列 5):5』 -AGTCATAGGGACCGTTATCAGG-3』。
[0039]實施例2、引物組合物的應用
[0040]1、採用植物基因組DNA提取試劑盒提取感染了棉花曲葉病毒的扶桑葉片的總DNA,得到總DNA溶液(DNA濃度約為300.9ng/ μ L)。
[0041]2、以步驟I提取的總DNA為模板，用實施例1設計的引物組合物進行LAMP。
[0042]LAMP 反應體系甲(25 μ L):步驟一獲得的總 DNA 溶液 2 μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L，BIPl μ L，LFl μ L，2 X 反應緩衝液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去離子水(DW)5.5 μ L ;即反應體系中，F3和Β3的初始濃度均為0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始濃度均為
1.6pmol/ μ L, LF 的初始濃度為 0.8pmol/ μ L。
[0043]LAMP 反應體系乙(25 μ L):步驟一獲得的總 DNA 溶液 2 μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L, BIPl μ L, LFl μ L, Fluorecent Detection Reagentl μ I (含I丐黃綠素和 Mn2+), 2 X反應緩衝液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去離子水(DW)4.5 μ L ;即反應體系中，F3和Β3的初始濃度均為0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始濃度均為1.6pmol/μ L，LF的初始濃度為
0.8pmol/μ L0
[0044]2 X反應緩衝液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去離子水(DW)均為Loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒的組分。2X反應緩衝液(RM)中含有Mg2+。
[0045]LAMP 反應程序:63°C 反應 60min。
[0046]設置未感染棉花曲葉病毒的扶桑葉片作為陰性對照，設置水作為空白對照。
[0047]LAMP反應體系甲63°C反應60min後的照片見圖la。Ib和Ic分別為空白對照和陰性對照，反應後溶液仍然透明，判定為陰性。反應過程中，持續目測觀察，第ISmin時反應管內有白色渾濁開始出現，60min時白色沉澱更加明顯。
[0048]LAMP反應體系乙63 V反應60min後的照片見圖2a。2b和2c分別為空白對照和陰性對照，反應後溶液仍然為透明橙色，判定為陰性。加入感染了棉花曲葉病毒的扶桑葉片的總DNA並反應60min後，溶液變為微濁的黃綠色。
[0049]實施例3、特異性分析
[0050]病毒樣本分別為:棉花曲葉病毒、花椰菜花葉病毒、馬鈴薯卷葉病毒和菸草花葉病毒。[0051]1、分別提取各個病毒樣本的基因組DNA。
[0052]2、以步驟I提取的總DNA為模板，用實施例1設計的引物組合物進行LAMP。
[0053]LAMP 反應體系(25 μ L):步驟 I 獲得的基因組 DNA2 μ L，F30.5 μ L, Β30.5 μ L,FIPl μ L，BIPl μ L，LFl μ L，2 X 反應緩衝液(RM) 12.5 μ L，酶溶液(EM) I μ L，去離子水(DW)
5.5μ L ;即反應體系中，即反應體系中，F3和Β3的初始濃度均為0.2pmol/yL, FIP和BIP的初始濃度均為1.6pmol/ μ L，LF的初始濃度為0.8pmol/ μ L。
[0054]將LAMP反應體系置於LA320C實時濁度儀，63°C反應60min。
[0055]實時濁度儀擴增曲線見圖3。結果表明，只有棉花曲葉病毒出現擴增曲線，其它病毒均未出現擴增曲線，即實施例1設計的引物組合物具有良好的特異性。
[0056]實施例4、普適性分析
[0057]待測植物葉片分別為:感染了棉花曲葉病毒的番茄葉片、感染了棉花曲葉病毒的本生菸葉片、感染了棉花曲葉病毒的棉花葉片和感染了棉花曲葉病毒的扶桑葉片、未感染棉花曲葉病毒的番茄葉片、未感染棉花曲葉病毒的本生菸葉片、未感染棉花曲葉病毒的棉花葉片和未感染棉花曲葉病毒的扶桑葉片。
[0058]1、採用植物基因組DNA提取試劑盒提取感染了待測的總DNA，得到總DNA溶液。
[0059]2、以步驟I提取的總DNA為模板，用實施例1設計的引物組合物進行LAMP。
[0060]LAMP反應體系同實施例2的LAMP反應體系甲。
[0061]將LAMP反應體系置於LA320C實`時濁度儀，63°C反應60min。
[0062]實時濁度儀擴增曲線見圖4。感染了棉花曲葉病毒的番茄葉片、感染了棉花曲葉病毒的本生菸葉片、感染了棉花曲葉病毒的棉花葉片和感染了棉花曲葉病毒的扶桑葉片均顯示擴增曲線。未感染棉花曲葉病毒的番茄葉片、未感染棉花曲葉病毒的本生菸葉片、未感染棉花曲葉病毒的棉花葉片和未感染棉花曲葉病毒的扶桑葉片均未顯示擴增曲線。
[0063]實施例5、靈敏度分析
[0064]1、將序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子插入克隆載體PMD-18T (TAKARA)，得到
重組質粒。
[0065]2、用無菌水作為溶劑，得到步驟I得到的重組質粒的濃度為128.7ng/ μ L的質粒溶液(PO溶液)；用無菌水10倍梯度稀釋PO溶液，依次得到Pl溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6溶液、Ρ7溶液、Ρ8溶液、Ρ9溶液和PlO溶液。
[0066]3、LAMP反應的靈敏度
[0067]LAMP反應體系(25 μ L):質粒溶液(PO溶液、Pl溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6 溶液、Ρ7 溶液、Ρ8 溶液、Ρ9 溶液或 PlO 溶液)I μ L，F30.5 μ L，Β30.5 μ L，FIPl μ L，BIPl μ L，LF1 μ L，2X 反應緩衝液(RM)12.5 μ L，酶溶液(EM)I μ L，去離子水(DW)6.5 μ L ;即反應體系中，F3和Β3的初始濃度均為0.2pmol/μ L，FIP和BIP的初始濃度均為1.6pmol/μ L, LF的初始濃度為0.8pmol/ μ L。
[0068]實時濁度儀擴增曲線見圖5。PO溶液、Pl溶液、P2溶液、P3溶液、P4溶液、P5溶液、P6溶液和P7溶液均顯示擴增曲線。
[0069]4、PCR反應的靈敏度
[0070]PCR鑑定引物如下:
[0071]CLCuV-2F: 5』 -GTCGCAGGATTATTCACCG-3 』 ；[0072]CLCuV-2R: 5，-TTGCTAGCGTGGGTACAA-3，。
[0073]PCR 反應體系(25μ I):2.5μ 110XPCR 緩衝液(含 Mg2+)，2y I dNTP Mix(IOmM)，
0.5μ I CLCuV F(10yM),0.5μ I CLCuV R(10 μ Μ)，0.5 μ I Taq DNA 酶(TAKARA, 5U/L)，18 μ I ddH20，Ι.Ομ I質粒溶液(PO溶液、PI溶液、Ρ2溶液、Ρ3溶液、Ρ4溶液、Ρ5溶液、Ρ6溶液、Ρ7溶液、Ρ8溶液、Ρ9溶液或PlO溶液)。
[0074]PCR反應程序:94°C5min ；30X (94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 40sec) ；72°C IOmin0
[0075]PCR擴增產物的電泳圖見圖6。PO溶液、Pl溶液、P2溶液、P3溶液、P4溶液和P5
溶液均顯示目的條帶。.
【權利要求】
1.引物組合物甲，由DNA片段-1、DNA片段-1I,DNA片段-1I1、DNA片段-1V和DNA片段-V組成；所述DNA片段-1、所述DNA片段-11、所述DNA片段-1I1、所述DNA片段-1V和所述DNA片段-V均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-1如序列表的序列I所示，所述DNA片段-1I如序列表的序列2所示，所述DNA片段-1II如序列表的序列3所示，所述DNA片段-1V如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所示。
2.引物組合物乙，由DNA片段-V1、DNA片段-VI1、DNA片段-珊、DNA片段-1X和DNA片段-X組成；所述DNA片段-VKDNA片段-VI1、所述DNA片段-珊、所述DNA片段-1X和所述DNA片段-X均為單鏈DNA片段；所述DNA片段-VI如序列表的序列I的反向互補序列所示，所述DNA片段-VII如序列表的序列2的反向互補序列所示，所述DNA片段-珊如序列表的序列3的反向互補序列所示，所述DNA片段-1X如序列表的序列4的反向互補序列所示，所述DNA片段-X如序列表的序列5的反向互補序列所示。
3.權利要求1所述引物組合物甲或權利要求2所述引物組合物乙在製備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。
4.一種試劑盒，包括權利要求1所述引物組合物甲或權利要求2所述引物組合物乙；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b):(a)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。
5.權利要求1所述引物組合物甲或權利要求2所述引物組合物乙的應用，為如下(a)或(b): (a)輔助鑑定棉花曲葉病毒；(b)輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。
6.一種輔助鑑定棉花曲葉病毒的方法，包括如下步驟:(1)以待測病毒的基因組DNA為模板，用權利要求1所述引物組合物甲或權利要求2所述引物組合物乙進行環介導等溫擴增；(2)通過檢測步驟(I)的擴增產物輔助鑑定待測病毒是否為棉花曲葉病毒。
7.一種輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒的方法，包括如下步驟:(1)以待測植物材料的總DNA為模板，用權利要求1所述引物組合物甲或權利要求2所述引物組合物乙進行環介導等溫擴增；(2)通過檢測步驟(I)的擴增產物輔助鑑定植物材料中是否含有棉花曲葉病毒。
【文檔編號】C12Q1/70GK103436532SQ201310367183
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】趙竹, 李明福, 張永江, 宋雲, 許瑾, 丁小蘭, 何增磊 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院