一種以登革熱病毒重組複製子為載體的假病毒顆粒疫苗的製作方法

2023-05-18 01:59:51

專利名稱：一種以登革熱病毒重組複製子為載體的假病毒顆粒疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及登革熱病毒，具體來說是以特異性抗原取代登革熱病毒的結構蛋白基因的重組疫苗，及其製法和用途。
背景技術：
癌症是嚴重威脅人類生命的疾病。許多癌症的發生與病毒有關。以宮頸癌為例，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染可以導致生殖道性病及癌症已得到公認。HPV感染率及感染程度隨宮頸病變程度的加重而逐漸升高，可簡要描述為慢性宮頸炎→假性溼疣→疣樣病變→尖銳溼疣→宮頸上皮內瘤樣病變→宮頸癌。HPV具有廣泛的感染人群，我國婦女的感染率為10-40％，歐洲婦女的感染率高達40-60％。在女性中宮頸癌的發病率僅次於乳腺癌。據世界衛生組織統計，全球現有宮頸癌患者約170萬，每年約50萬新發病例，20多萬死亡病例。我國現有宮頸癌患者約14萬，每年新增病例約4萬。75％以上的宮頸癌病例與兩種類型(16和18型)的HPV感染有關。臨床上多採用放療、手術和化療治療宮頸癌，少數結合中醫中藥治療，但效果並不理想。宮頸癌患者的5年存活率是65％。宮頸癌的復發率較高，復發病例的預後差，2年存活率只有5％。在美國，每年用於宮頸癌篩查和治療的費用約為5.7億美元。
治療惡性腫瘤最常用的手術、化療和放療三大傳統療法存在著復發率高、副作用大及產生耐藥性等缺陷。腫瘤的生物治療，尤其是腫瘤免疫治療或基因治療，因其理論上的高特異性及低副作用，作為治療腫瘤新的模式，其戰略地位已逐步確立，但至今臨床應用效果與人們的期望仍有很大差距。
現有技術中的疫苗包括以下幾種死疫苗這是人類早期試驗的腫瘤疫苗，其特點是比較安全，但是因為誘導細胞免疫需要抗原在活細胞內表達及提呈，因此其不能引起有效的細胞免疫。
以病毒為載體的疫苗DNA病毒載體內保留完整的DNA複製系統，是一種活疫苗。它能有效地複製和表達癌基因片段，能不斷地刺激細胞免疫系統，產生細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cells，CTLs)對抗腫瘤。但是為了避免致癌的可能性，一般採用癌基因片段為抗原，這樣抗原性就降低。但這種DNA病毒疫苗安全性低。
Borysiewicz LK等(Lancet.1996 Jun 1；347(9014)1523-7.)公開了一種以牛痘病毒為載體的HPV疫苗，但是由於許多人都攜帶牛痘病毒的抗體，因此限制了該疫苗的適用範圍，而且這種牛痘病毒疫苗難以進行重複免疫。
WO0153467公開了一種重組黃病毒，其中包括可編碼外源胺基酸序列的外源核苷酸序列。用重組黃病毒感染宿主細胞，可在宿主細胞中提供外源核酸，並產生由外源核酸編碼的抗原性多肽，進而引發對外源多肽的免疫應答。然而，其缺點是使用了可自主複製增殖的黃熱病病毒，保留了全部的黃熱病病毒基因組序列，沒有結構蛋白基因的缺失。雖然構建疫苗時無需包裝系統，但是安全性較低。
抗原提呈細胞製備腫瘤疫苗製作的基本方法是首先從患者身上取得樹突狀細胞，進行原代細胞培養與擴增，再用腫瘤相關抗原或特異性抗原體外處理自體樹突狀細胞，再接種到宿主，使其在體內激活T淋巴細胞，起到治療和保護作用。然而這種方法費時費力，成本高，樹突狀細胞的培養、擴增與激活成功率低，難以實現質量控制。因此這種完全個體化定製腫瘤疫苗的方法無法產業化，難以推廣應用。
綜上所述，本領域迫切需要開發新的安全性好、免疫效價高、重複免疫效果好的疫苗。

發明內容
本發明的目的就是提供一種新的安全性好、免疫效價高、且重複免疫效果好、適於產業化生產的疫苗，尤其是抗腫瘤和的疫苗。
在本發明的第一方面，提供了一種登革熱病毒重組複製子，所述的複製子缺失了登革熱病毒preM蛋白的全部編碼序列，並且包括以下元件a)全部的5』端的非編碼區；b)C蛋白前20個胺基酸的編碼區；c)NS1蛋白信號肽的編碼區；d)所有的非結構蛋白編碼區；e)3』端的非編碼區；f)位於b)和c)之間的外源核酸序列。
在另一優選例中，所述的外源核酸序列的3』端具有3』端釋放元件，或者NS1蛋白信號肽的編碼區前具有5』釋放元件，所述的釋放元件選自SEQ ID NO3所示的編碼口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO44所示信號肽水解酶底物的核苷酸序列，及其組合。
在另一優選例中，所述的登革熱病毒為登革熱病毒I、II、III或IV型，或其組合。
在另一優選例中，所述的NS1蛋白信號肽的編碼區是E蛋白基因的最後72個核苷酸。
在另一優選例中，所述的外源基因編碼HPV抗原蛋白、免疫調節因子或HPV抗原與免疫調節因子複合物。
在本發明的第二方面，提供了一種假病毒顆粒，它由上述的登革熱病毒重組複製子和登革熱病毒結構蛋白包裝組成。
在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有上述的登革熱病毒重組複製子或假病毒顆粒，和藥學上可接受的載體。
在本發明的第四方面，提供了本發明的登革熱病毒重組複製子或假病毒顆粒的用途，用於製備治療和預防以下疾病的藥物腫瘤、病毒性疾病。
在本發明的第五方面，提供了一種用於包裝上述登革熱病毒重組複製子的包裝細胞，所述的包裝細胞選自下組(i)被含有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的質粒轉染的細胞，(ii)被含有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的輔助病毒載體轉染的細胞，和(iii)基因組整合有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的細胞，且所述的包裝細胞能表達包裝所述複製子所需的登革熱結構蛋白，並且缺失的登革熱結構蛋白基因在其中表達時，不影響細胞的生長特性。
在本發明的第六方面，提供了一種製備假病毒顆粒的方法，包括以下步驟(i)將權利要求1所述的登革熱病毒重組複製子，或者含有所述複製子的假病毒顆粒，導入登革熱病毒的包裝細胞；(ii)當所述的包裝細胞表達登革熱病毒結構蛋白時，培養所述的包裝細胞，從而產生登革熱病毒的假病毒顆粒；或者，當所述的包裝細胞不表達登革熱病毒結構蛋白時，將輔助病毒複製子導入該包裝細胞，其中所述輔助病毒表達登革熱病毒的結構蛋白，然後培養所述的包裝細胞，從而產生登革熱病毒的假病毒顆粒；(iii)回收含有複製子的假病毒顆粒。
在另一優選例中，所述的包裝細胞含有選自下組的登革熱病毒結構蛋白表達載體含缺失NS3的登革熱基因組序列的表達載體，受四環素調控的基因表達載體。


圖1是顯示了實施例4中方法1的製備過程示意圖。
圖2是顯示了實施例4中方法4的製備過程示意圖。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，建立了以登革熱病毒為載體的假病毒顆粒疫苗技術，並成功地構建了安全性好、免疫效價高、可重複免疫的抗HPV的登革熱病毒疫苗，在此基礎上完成了本發明。
如本文所用，「nt」為核苷酸。
如本文所用，「釋放元件」指位於抗原多肽編碼序列元件3』端或NS1信號肽編碼區5端的核酸序列，當翻譯成蛋白質後，用於釋放完整的、不含無關序列的抗原性多肽。優選的釋放元件選自SEQ ID NO3所示的編碼口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO44所示信號肽水解酶底物的核苷酸序列，及其組合。釋放元件通常為一個，但也可以是多個。
術語「免疫活性」或「免疫原性」指由天然、重組或合成的肽誘導哺乳動物體內的特異性體液和/或細胞免疫應答的能力。本文所用的術語「抗原性多肽」或「抗原性肽」指可引發哺乳動物免疫應答的胺基酸序列，無論是單獨或與輔助分子結合(如I或II類主要組織相容性抗原分子)。
本文所用的術語「免疫應答」包括細胞性和/或體液性免疫應答，它們足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)導致的疾病的發作。
如本文所用，術語「對象」或「個體」或「患者」指需要進行診斷或治療的任何目標，尤其是哺乳動物對象，特別是人，其它對象包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。
首先，本發明人經過大量試驗首次證實了登革熱病毒重組複製子的構建必須滿足下列條件1.必須保留完整的非結構蛋白基因序列。任何對結構蛋白基因的切除，必須保證不影響原病毒非結構蛋白的表達，也不能造成非結構蛋白及其信號肽發生移碼變異。
2.必須保留C蛋白基因的前60nt(即C蛋白前20個胺基酸的編碼序列)，因為這段序列與5』-UTR和3』-UTR互補形成環形，是登革熱病毒基因複製和病毒包裝所必需的結構。當小於60nt，形成假病毒顆粒的效率會明顯下降。雖然大於60nt時(如81，99，120，150，180nt)仍可形成假顆粒，但是所容納外源基因的長度會相應下降，因此優選的範圍是保留C蛋白基因的前60-150nt，更佳地前60-120nt。
3.必須保留完整的非結構蛋白NS1的信號肽，即E蛋白最後的24個胺基酸。相應的編碼序列是E蛋白基因的後72nt。當小於72nt，形成假病毒顆粒的效率會明顯下降，甚至不能形成假顆粒。雖然大於72nt時(如81，99，120，150nt)仍可形成假顆粒，但是所容納外源基因的長度會相應下降，因此優選的範圍是保留72-150nt，更佳地60-120nt。
4.結構蛋白基因的切除，以及在切除位點外源基因的插入，均不能影響NS1信號肽的功能。登革熱病毒結構蛋白編碼區包括CpreME。通常可缺失CpreME蛋白的部分編碼序列(通常約100-2000bp，較佳地500-2000bp)，當然，儘可能地刪去CpreME的編碼區域是優選的。另一種優選方式是完全缺失preM，以提高安全性。
可用於本發明的登革熱病毒沒有特別限制，可以是任何一種亞型登革熱病毒。4種亞型的基因組序列可見如下登錄號I型 M87512II型M29095III型 M93130IV型AF289029。
登革熱病毒具有嗜樹突細胞特性，可更有效地提高疫苗療效，療效更好。此外，登革熱病毒特有ADE(antibody dependent enhancement of infection，抗體依賴性感染增強)現象，即第一次用登革熱病毒免疫後，再次用不同亞型登革熱病毒免疫時，抗體依賴性感染增強，從而可非常有效地進行重複免疫。ADE現象用於外源蛋白表達系統，不但可以避免重複免疫時機體對載體的中和作用，而且能提高載體進入細胞的效率，提高外源蛋白的投遞效率。由於登革熱病毒有4種亞型，以其作為外源基因的表達載體，可以通過接種不同亞型的重組登革熱病毒複製子加強免疫。
可適用於本發明的外源基因沒有特別限制，可以是任何腫瘤抗原基因、病毒抗原基因和免疫調節因子基因。代表性的抗原例子包括(但並不限於)人HPV抗原(如16亞型和18亞型的E6-E7片段)、HIV抗原、HBV抗原、HCV抗原、EBV抗原、HTLV-I抗原、MAGE、BAGE、CAGE等。通常外源基因的長度沒有特別限制，通常約為100-2000bp，較佳地為150-1200bp。此外，為了便於將表達的抗原切下，可以在外源基因的3』端側接釋放元件(如2A序列)。當插入的抗原基因是腫瘤抗原基因或病毒抗原基因，本發明疫苗可以預防和治療腫瘤及病毒性疾病。
以抗人乳頭狀瘤病毒疫苗為例，本發明提供了針對HPV感染所致疾病的預防性疫苗及治療型疫苗，所述的疫苗包含由登革熱病毒重組複製子和登革熱病毒結構蛋白包裝組成的假病毒顆粒，所述的登革熱病毒重組複製子的外源核酸序列編碼一種或多種HPV亞型的抗原蛋白，免疫調節因子或HPV抗原與免疫調節因子複合物，所述的HPV亞型的抗原蛋白可以為HPV 16亞型或HPV 18亞型的E6、E7、E7-E6癌蛋白或者為HPV主要衣殼蛋白L1、次要衣殼蛋白L2，所述的免疫調節因子可以為IL2、IL12、IL18、GM-CSF等。本發明提供的疫苗特別顯示了治療性疫苗的優勢。抗人乳頭狀瘤病毒(HPV)的疫苗可以預防與治療由乳頭瘤病毒感染所致的疾病，如慢性宮頸炎、假性溼疣、疣樣病變、尖銳溼疣、宮頸上皮內瘤樣病變及子宮頸癌等。
在製備本發明的複製子時，通常可按以下步驟進行(1)構建全長的登革熱病毒的基因組序列這可用常規的PCR和連接技術實現。
(2)缺失登革熱病毒的部分結構基因這可以用同源重組實現，也可用人工全合成等方法實現。一種特別優選的方法在酵母中進行同源重組缺失。
(3)插入外源基因雖然可用一些常規方法將外源基因插入已缺失部分結構基因的區域，但是優選方法仍然是在酵母進行同源重組在外源基因的兩端添加與待插入位點兩側序列同源的同源臂，然後將外源基因和缺失結構基因的登革熱病毒基因組DNA同時引入酵母細胞，通過同源重組獲得插入外源基因的複製子。這種方法的重組發生率接近100％，構建過程相對簡單、可控、穩定。
在獲得複製子後，可將其引入包裝細胞，從而產生假病毒顆粒。一種常規方法是在將登革熱病毒複製子引入細胞後，再引入表達結構蛋白的輔助病毒。另一種優選的方法採用了誘導表達的質粒或組成型表達的質粒作為登革熱病毒結構蛋白基因的載體，構建誘導表達的包裝細胞，然後將複製子(或假病毒顆粒)直接引入該該細胞，從而產生假病毒顆粒。例如，尤其是使用不表達NS3基因的組成型表達的包裝細胞。NS3基因具有特殊的包裝信號序列，不能將缺失NS3基因的登革熱基因組包裝入假病毒顆粒，因此當包裝細胞沒有登革熱病毒的NS3基因，不能自我包裝形成假病毒顆粒。用這種包裝細胞得到的假病毒顆粒僅含有登革熱病毒重組複製子，無需篩選。
具體地，優選的方法包括(a)當包裝細胞含有受四環素調控的(或其它可調控表達方法)從而表達登革熱病毒結構蛋白的基因表達盒時，將重組的登革熱病毒RNA複製子導入包裝細胞內，從而產生包括登革熱病毒複製子的假病毒顆粒。
(b)將重組的登革熱病毒複製子導入細胞內，培養一段時間(如24小時)後，將可表達所需登革熱結構蛋白的甲病毒複製子(或其它表達載體)導入同一細胞，從而產生包括登革熱病毒複製子的假病毒顆粒。
(c)當包裝細胞表達切除部分NS3基因後的登革熱基因組時，將重組的登革熱病毒複製子導入包裝細胞內，從而產生包括登革熱病毒複製子的假病毒顆粒。
(d)用假病毒顆粒感染細胞，培養一段時間後，將可表達所需登革熱結構蛋白的甲病毒複製子顆粒(或其它非複製型病毒載體)感染同一細胞。從而產生包括登革熱病毒複製子的假病毒顆粒。
藥物組合物本發明還提供了包含本發明的重組登革熱病毒複製子和/或假病毒顆粒的各種組合物，包括藥用組合物，尤其是疫苗組合物。
包含本發明的重組登革熱病毒的各種組合物可以包含按實際用途所選用的緩衝劑；還可包含適用於預定用途的其它物質。本領域技術人員都善於選擇的緩衝劑，本領域已知有多種緩衝劑適用於預定用途。在有些實例中，該組合物可含有藥學上可接受的賦形劑，本領域已知有多種而無需在此詳細討論。藥學上可接受的各種賦形劑在多種出版物已有詳述，包括如「Remington藥學和藥學實踐」，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可將藥用組合物製備成各種劑型，如注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑等。適用於口服或局部使用的藥用級別的有機或無機載體和/或稀釋劑，可用於配製包含治療活性化合物的各種組合物。本領域已知的稀釋劑包括水性介質、植物性和動物性油和脂肪。還可用穩定劑、潤溼劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類或維持合適pH值的各種緩衝劑、和皮膚滲透增強劑等作為輔助性材料。
當用作疫苗時，本發明的重組登革熱病毒可採用各種方法進行配製。通常，按本領域熟知的各種方法，用合適的藥用載體和/或運載體(vehicle)配製本發明的疫苗。合適的載體是無菌鹽水。為此也可使用其它水性和非水性等滲無菌注射液以及水性和非水性無菌懸浮液(已知都是藥學上可接受的載體，也是本領域技術人員所熟知的)。
另外，本發明的疫苗組合物的配製還可含有其它成分，包括如佐劑、穩定劑、pH調節劑、防腐劑等。這些成分是疫苗領域技術人員所熟知的。佐劑類包括(但不限制於)鋁鹽佐劑；皂苷佐劑；Ribi佐劑(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐劑(Seppic，Paris，France)；Hunter’sTiterMax佐劑(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐劑(Gerbu BiotechnikGmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在製劑中也可包含調節免疫應答的其它成分。
給藥途徑和劑量當用作疫苗時，可用已知的方法將本發明的重組登革熱病毒複製子和/或假病毒顆粒施用於個體。通常採用與常規疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫苗。可以採用疫苗組合物的形式時，除有重組Dengue病毒以外，還可包括藥學上可接受的載體。此外，這種組合物還可包括佐劑、矯味劑或穩定劑等。
給藥的常規和藥學上可接受的途徑包括鼻內、肌內、氣管內、皮下、皮內、陰道內、肺內、靜脈內、經鼻、經口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要可以組合給藥途徑，或按抗原肽或疾病情況進行調節。疫苗組合物可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強劑量以引發和/或維持免疫力。
應以「有效量」給予登革熱病毒重組複製子和/或假病毒顆粒的量在所選用的給藥路徑中足以引發免疫應答，能有效地促使保護宿主抵抗病毒感染、腫瘤等症狀。
在各疫苗劑份中所選用的登革熱病毒複製子和/或假病毒顆粒的量，是按可引發免疫保護性應答而無明顯的副作用的量而定。通常，在感染宿主細胞後，各劑份的疫苗足以產生約1-1000μg，較佳地為1-200μg，更佳地10-100μg抗原蛋白質。以重組登革熱病毒核酸為基礎計算的疫苗有效劑量，通常包括給予約1-1000μg核酸。另外，疫苗的有效劑量的一般範圍為約102-109，103-107或104-105空斑形成單位(PFU)。可用包括觀察對象中的抗體滴定度和其它反應的標準研究方法來確定具體疫苗的最佳用量可通過監控疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強劑量。在評估了血清中的抗體滴定度後，可能需要選用增強劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對本發明的蛋白質的免疫應答。
和已有技術相比，本發明具有以下主要優點1.提高了免疫的有效性(1)樹突狀細胞是最有效的抗原提呈細胞。在本發明利用登革熱病毒具有嗜樹突狀細胞的特性，以登革熱病毒重組複製子為載體，在上述被感染的細胞內高效率地表達並提呈抗原，從而激發機體針對抗原的有效免疫。
(2)利用不同型的登革熱病毒可以重複感染的特性和ADE現象進行重複免疫，提高免疫效果。
(3)既是腫瘤抗原又是病毒抗原的基因E6、E7重組的登革熱病毒複製子可以在細胞內較長時間地表達E6、E7抗原，有效地刺激免疫系統對抗原的免疫反應。
2.提高疫苗的安全性(1)登革熱病毒複製子是從RNA病毒重組而來，複製子的複製和表達完全在細胞質內進行，難以把癌基因重組到人體細胞的染色體內。
(2)重組的登革熱病毒複製子是去掉結構蛋白基因的重組登革熱病毒RNA。只能在人體細胞中複製和表達，不能形成侵染性的病毒顆粒，不會對周圍細胞進行二次感染。
(3)免疫系統具有對重組複製子的識別和清除的能力，複製子不會在體內長期存在，安全性好。
3.治療痛苦小(1)給藥次數少(2～3次)，減少治療過程帶給患者的痛苦。
(2)見效快，縮短了治療療程；4.生產成本低(1)以登革熱病毒重組複製子轉染可表達登革熱結構蛋白的包裝細胞產生假病毒顆粒，用假病毒顆粒再次感染包裝細胞即可生產出大量假病毒顆粒，使假病毒顆粒的製備效率大大提高，同時避免了需要重複大量構建複製子，從而縮短了疫苗生產流程，提高了疫苗的生產效率，產品生產成本降低。
(2)以登革熱病毒重組複製子轉染不表達NS3基因的組成型表達的包裝細胞，生產出假病毒顆粒。NS3基因具有特殊的包裝信號序列，不能將缺失NS3基因的登革熱基因組包裝入假病毒顆粒，因此當包裝細胞不能自我包裝形成假病毒顆粒。用這種包裝細胞得到的假病毒顆粒均含有登革熱病毒重組複製子，無需篩選，提高了假病毒顆粒的製備效率。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1全長的登革熱病毒cDNA克隆的製備過程1.把全長的登革熱病毒cDNA整合到pRS424質粒(Plasmid)內，製備全長的登革熱病毒cDNA克隆。所述的登革熱病毒II型NGC(ATCC#VR-1255)和pRS424質粒(ATCC#77105)，購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。
a)用RT-PCR的方法把登革熱病毒RNA轉化成三段登革熱病毒cDNA片段(5′端cDNA，3′端cDNA和中間段cDNA)，在5′端cDNA片段的5′端加上Xba I酶切位點和Sp6增強子序列；在3′端片段的3′端加上Sac I酶位點；中間片段的兩頭包括部分與5′端cDNA片段的3′端和3′端cDNA片段的5′端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下

獲得三個登革熱病毒cDNA片段，長度分別為5484bp，2530bp和2922bp。
b)先把5′端片段，然後把3′端片段用傳統連接的方法連接到pRS424質粒內。
c)利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，把中間片段插到上述克隆中，產生全長的登革熱病毒cDNA克隆pRS/FLD2。
2.製備去除了登革熱病毒結構蛋白的序列的登革熱病毒複製子的cDNA克隆a)用BamH I內切酶在登革熱病毒cDNA序列(Gene Bank登錄號AF038403)的1696或者2203的位置上(登革熱病毒基因上固有的BamH I酶切位點)把上述步驟1的c)中產生的全長的登革熱病毒cDNA克隆pRS/FLD2切割成線性。
b)用Fusing PCR的方法，製備一段96鹼基長的DNA片段，這個片段的5′端含有45個鹼基對來源於結構蛋白的第六到第二十密碼子；片段的3′端含有45個鹼基對來源於結構蛋白的第751到第766密碼子；這個片段的中間部位包括一個BamH I的酶切位點。所述的DNA片段的序列如SEQ ID NO5所示。
c)把線性的pRS/FLD2、96鹼基長的cDNA片段和活化的酵母菌一起加入酵母菌轉化液(PEG緩衝液)內，在攝氏30度保溫一小時，線性的pRS/FLD2和96鹼基長的cDNA片段能夠自動轉化到酵母菌內。在酵母菌培養基上培養兩天以後，可以得到轉化的酵母菌菌落。利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，96個鹼基長的cDNA片段能夠自動取代登革熱病毒結構蛋白的序列(序列表SEQ ID NO4)，產生大量去除了登革熱病毒結構蛋白的序列的登革熱病毒複製子的cDNA克隆。(去除了登革熱病毒結構蛋白的序列的登革熱病毒RNA複製子和實施例3中產生的重組HPV登革熱病毒RNA複製子一樣，可用實施例4中的所有四種包裝方法製備成登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒，用作動物實驗的對照。)實施例2製備HPV E7-E6-2A DNA片段(i)其中E7-E6序列是HPV的癌基因(Gene Bank登錄號AF486352；AF469197；AF472508)，如SEQ ID NO1所示，編碼256個胺基酸的抗原(SEQ IDNO2)。
(ii)所述的2A是口蹄疫病毒的基因片段，由六十個鹼基組成，其基因序列如序列表SEQ ID NO3所示。
(iii)以HPV-16質粒(ATCC#45113D)為模板，分別以GCGAGAAATACGCCTTTCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACATGCATGGAGATACACCTACA(SEQID NO12)和TGCAGTTCTCTTTTGGTGCATTGGTTTCTGAGAACAGATGGG(SEQ ID NO13)為一對引物；並以ATGCACCAAAAGAGAACTGCA(SEQ ID NO14)和AAGGTCAAAATTCAACAGCTGGGTTTCTCTACGTGT(SEQ ID NO15)為另一對引物，用PCR方法製備E6和E7 cDNA片段。E6 cDNA片段的5』端21nt與E7 cDNA片段的3』端的部分序列相同，E6 cDNA片段的3』端21nt與含2A的片斷的5』端的部分序列相同，E7 cDNA片段的5』端部分序列與登革熱II型病毒cDNA nt 108-124序列相同。以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCC(SEQID NO3)和ATACAGCGTCACGACTCCCACCAATACTAGTGACACAGACAGTGAGGTGCTGGGGCCAGGGTTGGACTCGAC(SEQ ID NO16)為引物，用融合PCR的方法製備一個111bp的含2A的片段其3』端部分序列與登革熱II型病毒cDNA nt 2275-2325序列相同。
4.把E6 cDNA片段、E7 cDNA片段及含2A的111bp片段同時放在PCR反應管內為模板，以GCGAGAAATACGCCTTTCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACATGCATGGAGATACACCTACA(SEQ ID NO17)作為E7 cDNA片段的5』端引物，以ATACAGCGTCACGACTCCCACCAATACTAGTGACACAGACAGTGAGGTGCTGGGGCCAGGGTTGGACTCGAC(SEQ ID NO18)作為含2A的片段的3』端引物，用PCR的方法得到全長的E7-E6-2A cDNA片段，此片斷的兩端分別包含部分與登革熱病毒cDNA基因相同的序列。
實施例3整合HPV病毒基因到登革熱病毒RNA複製子的過程1.將實施例1的第1步驟c)製備的全長的登革熱病毒cDNA克隆(簡稱pRS/FLD2)。用BamH I內切酶切開成線性。
2.將線性的登革熱病毒cDNA克隆(pRS/FLD2)和HPV E7-E6-2A cDNA片段一同轉化酵母菌(yeast)，在酵母菌的DNA複製的過程中，HPV E7-E6-2A cDNA片段能夠自動整合到登革熱病毒cDNA克隆中，並取代登革熱病毒結構蛋白的基因序列(包括C編碼區序列、M編碼區序列和E編碼區序列)，產生大量的環狀的HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆(即pRS/D2-HPV16)。
3.將步驟2中產生的HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆用Qiagencolumn(QIAGEN Inc.)從酵母菌內純化出來。
4.用酵母菌製備的HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆轉化Stabl2TM細菌(購自美國Invitrogen公司)，大量的HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆可以用這個系統來製備。
5.用Sac I內切酶將HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆的3′末端切開成線性。
6.用DNA依賴性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)把修飾後的HPV-登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆轉錄成RNA，即得到重組HPV登革熱病毒RNA複製子。
7.用電擊的方法(electroporation)，將重組HPV登革熱病毒RNA複製子轉染至宿主細胞BHK-21(Baby hamster kidney)(ATCC#CCL-10)內，重組HPV登革熱病毒RNA複製子可在宿主細胞內複製並表達HPV的E7-E6蛋白。
實施例4HPV病毒疫苗的四套製備方法方法一利用四環素調控的基因表達系統製備疫苗方法概述利用四環素調控的基因表達系統，轉化BHK-21(Baby hamsterkidney)(ATCC#CCL-10)，開發出一個能夠被調控表達登革熱病毒結構蛋白的細胞系。四環素調控的基因表達系統(Tet-Off Gene Expression systems購自美國Clontech公司)。這種質粒能夠表達一種調控蛋白質，稱為「四環素控制的逆激活蛋白」，該蛋白參與基因表達質粒轉錄的調控。這個基因表達系統包括pTet-Off調節載體(regulator vectors)，pTRE2反應載體(response vector)，pTK-Hyg選擇載體(selection vector)。
1.將登革熱病毒結構蛋白基因(完整的2328bp的登革熱病毒結構蛋白基因)(序列表SEQ ID NO4)插入到四環素調控的基因表達系統的pTRE2反應載體。具體地說以全長的登革熱病毒cDNA克隆(即pRS/FLD2質粒)為模板，以ATATCCCCGCGGATGAATAACCAACGAAAAAAGGCG(SEQ ID NO19)和ATATATCTAGACTAGGCCTGCACCATAACTCCCAA(SEQ ID NO20)為一對引物，用PCR方法製備CpreME cDNA片段。將CpreME cDNA片段和pTRE2(Clontech公司)用Xba I and Sac II進行消化。用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)對酶切產物進行純化。將上述兩個DNA片段用T4連接酶(New England Biolab公司)連接，並轉化至大腸桿菌內，從而克隆產生登革熱病毒結構蛋白基因重組的pTRE2質粒。
2.用電擊的方法把pTet-Off調節載體(regulator vector)轉化到BHK-21細胞內，然後篩選得到BHK-21 Tet-off細胞株。
3.將步驟1中產生的插入登革熱病毒結構蛋白基因的四環素調控的基因表達系統，用電擊的方法轉化至BHK-21 Tet-off(Baby hamster kidney)，得到可調節和高表達登革熱病毒結構蛋白的BHK-21細胞株。
4.將實施例3中產生的重組HPV登革熱病毒RNA複製子用電擊的方法轉化上述細胞株。一天後，四環素調控的基因表達系統誘導該細胞株高表達登革熱病毒結構蛋白。十天以後，收集培養液上清，即可得到每毫升104包裝過的重組HPV登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒。
方法二利用Sindbis RNA複製子製備疫苗1.製備登革熱病毒的結構蛋白基因片段a)以實施例1的第1步驟c)製備的pRS/FLD2為模板，以CCTCTAGCTAGAGCTTACCATGAATAACCAACGAAAAAAG(SEQ ID NO21)和GATTAGAGCTCTTATCTGCGTCTCCTGTTCAAGAT(SEQID NO22)為引物，用PCR的方法製備登革熱病毒結構蛋白基因的C編碼區DNA片段。
b)以實施例1的第1步驟c)製備的pRS/FLD2為模板，以GCGCTCTAGAATGACTGCAGGCATGATCATTATG(SEQ ID NO23)和ATGCCAGTAGGACAGGTGTAATCTAGGCCTGCACCATAACTCCCAA(SEQ ID NO24)為引物，用PCR的方法製備登革熱病毒結構蛋白基因的preM-E編碼區DNA片段。
c)以SindbisRNA複製子cDNA克隆(STRATAGENE公司)為模板，以ATTACACCTGTCCTACTGGCA(SEQ ID NO25)和CATGGTAAGCTCTAGCTAGAG(SEQ ID NO26)為引物，用PCR的方法製備Sindbis 26S DNA片段。
d)preM-E編碼區DNA片段的3′端的21nt序列與Sindbis 26S DNA片段的5′端的部分基因序列相同。Sindbis 26S DNA片段的3′端22nt序列與C編碼區DNA片段的5′端的部分基因序列相同。
e)以C編碼區DNA片段、preM-E編碼區DNA片段和Sindbis 26S DNA片段為模板，以GCGCTCTAGAATGACTGCAGGCATGATCATTATG(SEQ ID NO27)和GTATAGAGCTCTTATCTGCGTCTCCTGTTCAAGAT(SEQ ID NO28)為引物，用fusing PCR的方法製備preME-26S-C片段。
2.建立登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子。
a)將步驟1中製備的preME-26S-C片段和SindbisRNA複製子cDNA克隆(STRATAGENE公司)用Xba I和Sac I進行消化。用Qiagen spincolumn(QIAGEN Inc.)對消化產物進行純化。將上述兩個DNA片段用T4連接酶(New England Bio lab)連接，並轉化至大腸桿菌內，克隆產生登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子cDNA克隆，並用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)進行純化。
b)用Xho I內切酶將步驟a)中產生的登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子cDNA克隆線性化；c)用DNA依賴性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNApolymerase)將線性化的登革熱病毒結構蛋白基因重組的SindbisRNA複製子cDNA克隆轉錄成RNA，即得到登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子。
3.用實施例3中產生的重組HPV登革熱病毒RNA複製子轉染BHK-21細胞(ATCC#CCL-10)，24小時之後，用上述步驟2的c)中產生的登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子再次轉染該細胞。兩次轉染都是用電擊的方法，0.4cm Gene Pulser Cuvette，200 V/950uF。一到兩天後，收集培養基上清，可得到每毫升104-105重組HPV登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒。
方法三利用Sindbis RNA複製子的假病毒顆粒製備疫苗
1.用方法二步驟2的c)中產生的登革熱病毒結構蛋白基因重組的SindbisRNA複製子和DH-BB RNA(購自STRATAGENE)同時用電擊的方法轉染BHK-21細胞(ATCC#CCL-10)，三到五天後，收集培養基上清，可得到登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子的假病毒顆粒。
2.用方法二步驟3中產生的重組HPV登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒感染BHK-21細胞(ATCC#CCL-10)。24小時之後，用上述步驟1中產生的登革熱病毒結構蛋白基因重組的Sindbis RNA複製子的假病毒顆粒再次感染該細胞。24-48小時後，收集培養基上清，可得到每毫升105-106重組HPV登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒。
方法四建立被NS3缺失的登革熱病毒cDNA轉化的BHK-21包裝細胞系1.以pCI(購自PROMEGA，USA)作為模板，以5』CMV和3』CMV作為引物，用PCR的方法製備CMV(cytomegalovirus，巨細胞病毒)的DNA片段(簡稱CMV)，CMV的DNA片段作為早期增強子和啟動子，其長度為631bp(SEQ IDNO29)。以實施例1的第1步驟c)製備的pRS/FLD2為模板，以5』DEN5』end和3』DEN5』end作為引物，用PCR的方法製備登革熱病毒cDNA的5』端片段(簡稱DEN5』end)。以上述連個DNA片段作為模板，以5』CMV和3』DEN5』end作為引物，用fusing PCR的方法製備CMV-DEN5』end的DNA片段(簡稱CMV-DEN5』end)。
2.將步驟1產生的CMV-DEN5』end的DNA片段與pRS424質粒(ATCC#77105)用Kpn I and Apa I進行酶切。用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)對消化產物進行純化。將上述兩個DNA片段用T4連接酶(購自New England Biolab)連接，並轉化至大腸桿菌內。篩選產生CMV-DEN5』end克隆(簡稱pRS/CMV-DEN5』end)。
3.以實施例1的第1步驟c)製備的pRS/FLD2為模板，以5』DEN3』end and3』DEN3』end作為引物，用PCR的方法製備登革熱病毒cDNA的3』端片段(簡稱DEN3』end)。以5』HDVr和3』HDVr作為引物，用PCR的方法製備肝炎delta病毒抗原血症核酶(hepatitis delta virus antigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(簡稱HDVr，SEQ ID NO30)。以pcDNA3(購自INVITROGEN，USA)作為模板，以5』pA和3』pA作為引物，用PCR的方法製備牛生長激素polyA(bovine growth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(簡稱pA)。以上述三個片段為模板，以5』DEN3』end和3』pA作為引物，用fusing PCR的方法製備DEN3』end-HDVr-pA的DNA片段。
所使用的DNA引物的序列如下

4.將上述步驟2生成的pRS/CMV-DEN5』end與步驟3生成的DEN3』end-HDVr-pA的DNA片段用Apa I and Sac II進行酶切，用Qiagen spin column(QIAGENInc.)對消化產物進行純化。將上述兩個DNA片段用T4連接酶(購自NewEngland Bio lab)連接，並轉化至大腸桿菌內。篩選產生pRS/CMV-DEN5』end-DEN3』end-HDVr-pA的克隆。
5.將上述步驟4生成的pRS/CMV-DEN5』end-DEN3』end-HDVr-pA的克隆用Apa1進行酶切，將實施例1的第1步驟c)製備的pRS/FLD2用Xba1 and Sac I進行酶切。將上述酶切產物進行純化，並將純化產物轉化至酵母菌，利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，生成了全長的登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆(簡稱pRS/CMV/D2)。
6.將步驟5產生的全長的登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆(pRS/CMV/D2)用Xho I進行酶切，得到線性化的全長的登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆。以CAGACTGAAAAAAGTATTGAAGACAATCCAGAGATCGAAGGAATTAAGAACAACCAAATC(SEQ ID NO41)和CTCCACATTTTCCAAGATTTGGTTGTTCTTAATTCC(SEQ ID NO42)為引物，用PCR的方法生成一個75bp長的DNA片段，其序列為CAGACTGAAAAAAGTATTGAAGACAATCCAGAGATCGAAGGAATTAAGAACAACCAAATCTTGGAAAATGTGGAG(SEQ ID NO43)。將上述線性化的全長的登革熱病毒RNA複製子的cDNA克隆和75bp長的DNA片段一同轉化至酵母菌，利用在酵母菌中相同序列的DNA重組，線性化的全長的登革熱病毒RNA複製子的部分NS3編碼區基因序列(nt5059-6215)被切除，而得到了NS3缺失的登革熱病毒的cDNA克隆。
7.將上述步驟6中產生的NS3缺失的登革熱病毒的cDNA克隆DNA和pcDNA3(購自INVITROGEN，USA)同時轉染BHK-21 cell(ATCC#CCL-10)。該細胞培養一天後，轉換為含有G418(購自SIGMA，USA)的細胞培養液。用實施例3中產生的重組HPV登革熱病毒RNA複製子轉化抗G418的細胞株，挑選出包裝細胞系。該細胞系的產量可以達到106重組HPV登革熱病毒RNA複製子假病毒顆粒。
實施例5HPV病毒疫苗的動物實驗報告為了證實HPV病毒疫苗的免疫療效，我們測試了HPV病毒疫苗對C57BL/6小鼠腫瘤模型的影響。
用JHU-1 HPV腫瘤細胞接種C57BL/6小鼠作為腫瘤模型JHU-1 HPV腫瘤細胞含有HPV病毒的E6/E7癌基因。用1×105的JHU-1 HPV腫瘤細胞在500微升的PBS緩衝液，注入到八個星期大的C57BL/6小鼠的臍腹部(FLANK)。JHU-1HPV腫瘤細胞能夠100％誘導出實質性的腫瘤。在注入JHU-1 HPV腫瘤細胞七天後，能觸摸到腫瘤快。並在十四天後，誘導出來的腫瘤能在6mm以上。
HPV病毒疫苗的治療方案整個實驗分成四組，每組八隻C57BL/6小鼠。

PFU＝Infectious Particle of HPV replion-containing VLP在腫瘤對照組和疫苗治療組裡的每隻小鼠臍腹部注射1×105JHU-1CELLS，在注入JHU-1細胞後的的十四天，疫苗治療組和疫苗對照組的小鼠分別皮下注入107的有效疫苗顆粒。並在七天以後，再次皮下注入107PFU的有效疫苗顆粒作為追加治療。
1.HPV病毒疫苗免疫療效的觀測a.當小鼠接種了JHU-1 HPV腫瘤細胞後，每兩天觀測和測量腫瘤的生長情況和腫瘤大小。
b.用細胞內染色和流式細胞測定(FLOW CYTOMETRY)的方法對HPV E6/E7-特異性CD8+T-細胞的分析。當疫苗對照組的小鼠在第二次皮下注射HPV-VAC後的第十四天，把脾臟細胞分離出來，然後用螢光標記的IFN-γ和TNF-α抗體染色。染色後的細胞表面的IFN-和TNF用流式細胞儀檢測。
2.實驗結果a)HPV病毒疫苗對腫瘤生長的影響腫瘤對照組

*如果小鼠體內的腫瘤大於25毫米以後，該小鼠就不再保留。
疫苗治療組

我們觀察到，在疫苗治療組，當1×105JHU-1 CELLS注入到C57BL/6小鼠的臍腹部14天後，能夠誘導出6mm以上的腫瘤實塊。在這個時候，我們給這些小鼠皮下注射107PFU HPV-Vac。在注射的兩天後，能夠觀察到大部份腫瘤開始縮小。七天以後，我們再追加一次疫苗(107PFU HPV-Vac)。在完成兩次疫苗注射後一周，50％的小鼠體內的腫瘤基本消失。有兩隻小鼠的腫瘤有明顯縮小，但是有兩隻小鼠的腫瘤有緩慢增長的趨勢。在腫瘤對照組，當1×105JHU-1CELLS注入到C57BL/6小鼠的臍腹部35天後，75％的小鼠體內的腫瘤大於25。
b)HPV病毒疫苗對HPV E6/E7-特異性CD8+T-細胞的的影響

我們用細胞內染色的方法來測定HPV病毒疫苗對HPV E6/E7-特異性CD8+T-細胞的影響，並且觀察到HPV病毒疫苗可以激活CD8+T-細胞分泌IFN-γ和TNF-α。
實施例6構建不同的II型登革熱病毒疫苗在本實施例中，按實施例1、2和3所述的相同的方法構建了下列II型登革熱病毒重組複製子，不同點僅在於C蛋白基因5』序列和NS1蛋白信號肽長度不同。並用實施例4中的方法4製備假病毒顆粒。結果如下

實施例7構建I型登革熱病毒疫苗在本實施例中，按實施例1、2和3所述的相同的方法構建了下列登革熱病毒重組複製子，不同點僅在於用I型登革熱病毒替換實施例1-3中的II型登革熱病毒，然後用實施例4中的方法4製備假病毒顆粒。然後，按實施例5中治療組的相同方案給藥，實驗動物是實施例5中腫瘤未消失的4隻小鼠。
結果，4隻中有3隻小鼠的腫瘤明顯縮小。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海天甲生物醫藥有限公司美國天甲生物醫藥有限公司北京東方天甲科技發展有限公司120一種以登革熱病毒重組複製子為載體的假病毒顆粒疫苗130040521150CN 03115272.41512003-01-3016044170PatentIn version 3.12101211768212DNA213人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus)4001atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ctgttgcaag180tgtgactcta cgcttcggct gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tacgttggaa240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accaatgcac300caaaagagaa ctgcaatgtt tcaggaccca caggagcgac ccagaaagtt accacagtta360tgcacagagc tgcaaacaac tatacatgat ataatattgg aatgtgtgta ctgcaagcaa420cagttactgc gacgtgaggt atatgacttt gcttttcggg atttatgcat agtatataga480gatgggaatc catatgctgt atgtgataaa tgtttaaagt tttattctaa aattagtgag540tatagacatt attgttatag tttgtatgga acaacattag aacagcaata caacaaaccg600ttgtgtgatt tgttaattag gtgtattaac tgtcaaaagc cactgtgtcc tgaagaaaag660caaagacatc tggacaaaaa gcaaagattc cataatataa ggggtcggtg gaccggtcga720tgtatgtctt gttgcagatc atcaagaaca cgtagagaaa cccagctg 7682102211256212PRT213人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus)4002Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 75 80Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln85 90 95Lys Pro Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu100 105 110Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile115 120 125His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg130 135 140Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg145 150 155 160Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser165 170 175Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr
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212DNA213巨細胞病毒(cytomegalovirus)40029cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca60tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac120gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact180ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa240gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg300cattatgccc agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta360gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg420tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg480caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg540ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaacc 5952103021184212DNA213肝炎病毒(Hepatitis virus)40030gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgca60cgtccactcg gatggctaag ggag 842103121136212DNA213人工序列40031gcgcgcggta ccttgacatt gattattgac tagtta 362103221142212DNA213人工序列40032ggtccacgta gactaacaac tcggttcact aaacgagctc tg 422103321121212DNA213人工序列40033agttgttagt ctacgtggac c 212103421121212DNA213人工序列40034ccctgcagca ttccaagtga g 212103521142212DNA213人工序列40035ctcacttgga atgctgcagg gcccaaggtg agatgaagct gt 422103621142
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213人工序列220
221misc_feature222(1)..(5)223信號肽水解酶底物40044Pro Gln Ala Gln Ala1 權利要求
1.一種登革熱病毒重組複製子，其特徵在於，所述的複製子缺失了登革熱病毒preM蛋白的全部編碼序列，並且包括以下元件a)全部的5』端的非編碼區；b)C蛋白前20個胺基酸的編碼區；c)NS1蛋白信號肽的編碼區；d)所有的非結構蛋白編碼區；e)3』端的非編碼區；f)位於b)和c)之間的外源核酸序列。
2.如權利要求1所述的複製子，其特徵在於所述的外源核酸序列的3』端具有3』端釋放元件，或者NS1蛋白信號肽的編碼區前具有5』釋放元件，所述的釋放元件選自SEQ ID NO4所示的編碼口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO44所示信號肽水解酶底物的核苷酸序列，及其組合。
3.如權利要求1所述的複製子，其特徵在於所述的登革熱病毒為登革熱病毒I、II、III或IV型。
4.如權利要求1所述的複製子，其特徵在於，所述的外源基因編碼HPV抗原蛋白、免疫調節因子或HPV抗原與免疫調節因子複合物。
5.一種假病毒顆粒，其特徵在於，由權利要求1所述的登革熱病毒重組複製子和登革熱病毒結構蛋白包裝組成。
6.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有權利要求5所述的假病毒顆粒和藥學上可接受的載體。
7.如權利要求1所述的登革熱病毒重組複製子的用途，其特徵在於，用於製備治療和預防以下疾病的藥物腫瘤、病毒性疾病。
8.一種用於包裝權利要求1所述的登革熱病毒重組複製子的包裝細胞，其特徵在於，所述的包裝細胞選自下組(i)被含有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的質粒轉染的細胞，(ii)被含有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的輔助病毒載體轉染的細胞，和(iii)基因組整合有登革熱病毒重組複製子缺失的結構蛋白基因的細胞，且所述的包裝細胞能表達包裝所述複製子所需的登革熱結構蛋白，並且缺失的登革熱結構蛋白基因在其中表達時，不影響細胞的生長特性。
9.一種製備假病毒顆粒的方法，其特徵在於，包括步驟(i)將權利要求1所述的登革熱病毒重組複製子，或者含有所述複製子的假病毒顆粒，導入登革熱病毒的包裝細胞；(ii)當所述的包裝細胞表達登革熱病毒結構蛋白時，培養所述的包裝細胞，從而產生登革熱病毒的假病毒顆粒；或者，當所述的包裝細胞不表達登革熱病毒結構蛋白時，將輔助病毒複製子導入該包裝細胞，其中所述輔助病毒表達登革熱病毒的結構蛋白，然後培養所述的包裝細胞，從而產生登革熱病毒的假病毒顆粒；(iii)回收含有複製子的假病毒顆粒。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的包裝細胞含有選自下組的登革熱病毒結構蛋白表達載體含缺失NS3的登革熱基因組序列的表達載體，受四環素調控的基因表達載體。
全文摘要
本發明提供了一種以登革熱病毒重組複製子為核心的假病毒顆粒疫苗及其製備方法。所述的疫苗可在被感染的細胞內高效率地表達抗原，由於登革熱病毒具有感染樹突狀細胞的特點，能有效提呈抗原，免疫效果好。此外利用不同型的登革熱病毒可以進行有效重複免疫，從而強化機體針對帶有這種抗原的病原的免疫。該疫苗可以預防和治療腫瘤及病毒性疾病。
文檔編號C12N15/55GK1524952SQ20041000339
公開日2004年9月1日 申請日期2004年1月30日 優先權日2003年1月30日
發明者龐小伍 申請人:上海天甲生物醫藥有限公司, 美國天甲生物醫藥有限公司, 北京東方天甲科技發展有限公司