一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法
2023-05-18 05:31:51 1
一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法
【專利摘要】一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法，屬於固定化酶【技術領域】。包括合成磁性Fe3O4納米顆粒；製備核殼結構的Fe3O4@TiO2磁性納米複合物；製備銳鈦礦型Fe3O4@TiO2納米複合物，對該納米複合物表面進行功能化修飾從而得到Fe3O4@TiO2固定化酶載體等步驟。本發明製備的固定化酶載體綜合了磁性材料、納米材料、TiO2及表面功能基團修飾的優點，具有磁響應性、可再生利用、高生物相容性、與目標酶分子共價連結、酶荷載量高及穩定性好等優點。此外，本方法工藝簡單，反應條件易控制。本發明可為酶提供性能優異的固定化載體，能有效降低酶大規模工業化應用的成本，在固定化酶領域具有巨大的應用潛力。
【專利說明】一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於固定化酶【技術領域】，具體涉及一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法。
【背景技術】
[0002]酶是一類生物催化劑，絕大多數酶的化學本質是蛋白質。與化學催化劑相比，酶具有專一性強、催化效率高、反應條件溫和、活性可控等優點。但是酶不穩定，極易受外部壞環境影響而失去催化活性。另外，大多數酶為水溶性，導致其在催化反應後不易與底物和產物分離，不僅影響產物的純度同時也使酶不能重複利用，這增加了酶在工農業應用中的成本。
[0003]固定化酶技術的出現為克服酶的上述缺點和為酶的大規模應用提供了有效途徑，是酶工程最為活躍的研究領域之一。固定化酶技術是酶工程的一個重要分支，是指通過物理或/和化學方法，將水溶性酶固定在特定的載體上或將酶限制在一定的空間範圍內從而限制酶分子的運動，但仍然允許酶發揮其催化功能且反應後酶可重複使用的一種技術。與游離酶相比，固定化酶在保留水溶性酶優點的同時，獲得了可重複利用、穩定性好、活性提高、工藝簡單、可規模化應用等優點。
[0004]固定化酶載體及酶與載體的固定化工藝是固定化酶的兩個關鍵技術。載體材料的結構和性能對固定化酶的性能有著巨大的影響。設計和開發性能優異、符合特定需求的載體材料是目前固定化酶研究領域的一個重點和熱點。隨著材料科學和酶固定化技術的發展，固定化酶載體材料已從起初的天然高分子材料向無機材料、合成高分子材料及複合材料等方向發展。近年來，磁 性納米材料由於其自身的優點，在生物醫學、環境科學、催化等領域的應用潛力越來越受到人們的關注。作為固定化酶載體，磁性納米材料不僅具有納米材料所特有的小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應而且還具有磁響應性，使固定化酶在外部磁場的作用下易從反應體系中分離和回收；另外，也可以通過外磁場控制固定化酶在反應體系中的運動方向，這可以用來提高酶的催化效率。目前，已有文獻和專利報導了磁性納米顆粒用作固定化酶的載體。相關酶包括乙醇脫氫酶、葡萄糖氧化酶、氯過氧化物酶等。酶與磁性納米粒子組裝構建的固定化酶實現了反應後，在外部磁場下酶從反應體系中的快速分離，以及酶的循環利用。此外，相對於微米級的酶載體，納米材料由於其比表面積的增加具有更高的酶負載能力，從而有利於催化效率的提高。另一方面，以物理吸附方式固定化的酶，親和性不高，容易導致催化反應或者循環催化過程中酶從載體上脫離，這樣就大大降低了酶的循環利用次數。另外，將酶通過共價方式直接與磁性納米粒子連接，容易導致酶的活性和穩定性降低，同時在這種情況下磁性納米粒子之間很容易聚集，分散性差。
[0005]通過磁性納米粒子表面功能化修飾或構建磁性納米複合材料(如具有半導體外殼的複合磁性納米顆粒、各種功能基團修飾的納米複合微球等）可以提高固定化酶在溶液中的分散性，同時有效提高共價固定化酶的穩定性。Xin Gao等製備了二氧化矽包被的磁性納米粒子，共價連接內醯胺酶後，發現其穩定性有了很大提高（Chem.Commun.，2003, 24，2998-2999) ;ffen Wang等合成了具有高分子外殼的磁性納米粒子作為過氧化物酶的載體，這種磁性酶載體在酶的活性和多次循環利用方面都有很大的優越性(J. Am. Chem. Soc.，2009, 131，12892 - 12893)。於洪巍等發明了一種磁性共價固定化酶載體的製備方法（專利號：201110201473)，通過對磁性納米粒子表面的修飾，實現了載體與酶分子間的共價偶氮連接。
[0006]以上磁性納米複合材料載體具有顯著的優點，但其不足也十分明顯，如這些載體的生物相容性有待進一步提高，而載體的生物相容性與固定化酶的活性直接相關；另一方面，當荷載的酶經過多次循環催化反應後活性會逐漸降低甚至失活，最終導致這些載體的棄用，而新載體的合成必然提高生產成本。
[0007]二氧化鈦（TiO2)是一種無毒、壞境友好的生物相容性材料，在生物醫學領域具有廣泛的應用前景。2012年，Wan Fu Ma等人利用磁性TiO2納米顆粒（Fe3O4OTiO2NPs)的TiO2能和磷酸化多肽的磷酸根基團非共價作用的特性，從生物樣本中富集和分離磷酸化多肽(ACS Nano, 2012, 6，3179-3188.)。另外，TiO2因具有優異的光催化活性，被廣泛用於有機汙染物和微生物的光降解（Chemical Reviews, 1995, 95, 735-758. ) 0因光催化引起的自清潔特性為TiO2載體材料的再生利用提供了一條非常簡單而有效的途徑。
[0008]本專利結合了磁性納米材料和TiO2的優點，構建了表面功能化的具核殼結構的Fe3O4OTiO2納米複合物，該複合物載體具有磁響應性、分散效果好、可再生利用、生物相同性好、及與酶共價連接、對酶荷載能力強等優點，是一種理想的固定化酶載體，在固定化酶領域具有巨大的應用潛力。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種可再生的磁性固定化酶載體及其製備方法。本發明通過合成銳鈦礦型磁性Fe3O4OTiO2納米材料並對其進行功能化修飾，從而使該固定化酶載體具有磁響應性、分散效果好、可再生性利用、高生物相容性、與酶共價連接、對酶荷載量高、穩定性好等優點，是一種理想的固定化酶載體，在固定化酶領域具有巨大的應用潛力。
[0010]為了實現上述發明目標，本發明採取以下技術方案：
[0011](a)製備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0012]Fe3O4磁性納米顆粒通過溶劑熱或水熱方法合成。
[0013]溶劑熱方法JfFeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20和乙酸鈉按摩爾比1:9~1:11混合後分散於乙二醇中，FeCl3 · 6H20*Fe(N03)3 · 9H20在乙二醇溶液中的濃度範圍為O. I~
O.15mol/L ;然後將得到的黃色溶液在200~220°C條件下反應8~12h ;
[0014]水熱方法:向O. I~O. 2mol/L的FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調至7. O~8. 0，加熱至60~80°C，過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，凝膠經洗滌後重新分散於水中，再用NaOH溶液將pH值調至10.0~11. 0，然後將得到的溶液在200~220°C條件下水熱反應6~8h ;
[0015]上面步驟中所述在溶劑中分散的方法為磁力攪拌、機械攪拌或超聲波方法。
[0016]將溶劑熱方法或水熱方法得到的溶液轉移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒（Fe3O4NPsX (b)製備核殼結構的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2NPs)：
[0017]將步驟（a)製備的100~200mg Fe3O4NPs採用機械攪拌或超聲波方法分散到200~300mL的乙醇、乙晴和NH3 -H2O的混合溶液中，乙醇、乙晴和NH3 -H2O的體積比160~200:40:1，再加入2~3mL鈦酸四丁酯並攪拌I~2h ;然後用外磁場分離收集得到磁性的Fe3O4OTiO2膠體納米粒子，將膠體納米粒子用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而得到核殼結構的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子(Fe3O4OTiO2NPs)；
[0018](c)製備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物：
[0019]將步驟（b)製得的IOOmg Fe3O4OTiO2NPs採用機械攪拌或超聲波方法分散於100~200mL、60~70%(v/v)乙醇的水溶液中，然後加入2~3mL的NH3 · H2O,然後將得到的懸浮液在160~180°C條件下水熱反應18~24h，棕色的反應產物用外磁場分離收集後用無水乙醇清洗3~5次，再用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而製備得到銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物；
[0020](d)製備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：
[0021]將步驟（c)製備的銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物採用機械攪拌或超聲波方法分散於I~2% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基矽烷（APTMS)水溶液中，並攪拌2~5h ;利用外磁場分離收集得到APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物，然後將其再分散於含2~3% (v/v)戊二醛的水溶液中，經室溫孵育I~3h後獲得本發明所述的乙醛化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體，乙醒化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體可直接用於酶的固定化。
[0022]載體對酶的荷載及荷載量的計算：
[0023]將需固定化的酶配製成溶液，並與載體按一定比例充分混合；酶與載體的固定化反應介質為pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩衝液，反應條件為室溫下I~2h或4°C下18~24h。
[0024]載體對酶的荷載量按下述方法計算：將步驟（d)製備獲得的固定化酶載體加入到一定濃度的酶溶液中，在室溫下孵育4~6h ;每隔30~60min用紫外分光光度法或考馬斯亮藍法測酶蛋白濃度，根據加入固定化酶載體後酶蛋白溶液濃度的改變值計算出載體對酶的荷載量。
[0025]固定化酶活力的檢測：
[0026]採用游離酶常規活力檢測方法，測定各種固定化酶的活力。
[0027]載體的再生方法：
[0028]固定化酶經過多輪催化反應後，酶的活性必然會下降或喪失。荷載低活性或無活性固定化酶的Fe3O4OTiO2納米複合物在紫外燈下照射3~5h ;然後利用外磁場分離、收集，並用乙醇清洗，將殘留的乙醇在20~60°C條件下揮發完全後可再次用於酶的固定化。
[0029]載體及固定化酶的保存方法：
[0030]空載體貯存在在4°C，含30~40%(v/v)的乙醇溶液中；使用前用pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩衝液清洗3~5次，每次利用外磁場分離收集，最後以pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩衝液置換原來的保存液。
[0031]與載體相連的固定化酶貯存在4°C，含0.05%~O. l%(w/v)NaN3、pH=7. 2~7· 4磷酸鹽緩衝液中；使用ρΗ=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩衝液清洗3~5次，每次利用外磁場分離收集，最後以ρΗ=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩衝液置換原來的保存液。[0032]本發明由於採取了以上技術方案，使製備的固定化酶載體具有以下顯著的優點：
[0033]步驟（a)所述述技術合成的Fe3O4納米顆粒核心為載體提供了磁性，為後續的分離、純化、收集提供了極大的便利。
[0034]步驟（b)所述技術合成的TiO2外殼為載體提供了高生物相容性以及可再生性。
[0035]步驟（C)所述技術合成的銳鈦礦型TiO2多孔外殼結構為載體提供了更大的比表面積，從而可有效提聞載體荷載酶的能力。
[0036]步驟（d)所述技術可實現酶與載體的共價連結，從而獲得穩定的固定化酶；提高了載體對酶的荷載能力；也是實現載體再生的前提。
[0037]步驟（g)所述技術可實現載體的再生利用。
【專利附圖】
【附圖說明】[0038]圖I :實施例I製備的磁性Fe3O4納米粒子的透射電鏡圖。如圖所示，所製備的Fe3O4為球形，納米粒子平均直徑大約200nm。
[0039]圖2 :實施例I製備的磁性Fe3O4OTiO2納米複合物的透射電鏡圖。如圖所示，球狀Fe3O4納米粒子被多孔狀的外殼包圍，外殼與磁性核之間連接緊密而且連續。
[0040]圖3 :實施例5製備的磁性Fe3O4納米粒子的透射電鏡圖。如圖所示，所製備的Fe3O4為球形，納米粒子平均直徑大約170nm。
[0041]圖4 :實施例5製備的磁性Fe3O4OTiO2納米複合物的透射電鏡圖。如圖所示，球狀Fe3O4納米粒子被多孔狀的外殼包圍，外殼與磁性核之間連接緊密而且連續。
[0042]圖：5 :實施例I製備的磁性Fe3O4OTiO2納米複合物的拉曼光譜。如圖所示，在633nm激發線下，銳鈦礦型TiO2的三個特徵振動模式清晰可見，表明多孔外殼是銳鈦礦型的Ti02。
[0043]圖6 :實施例I製備的磁性Fe3O4OTiO2固定化辣根過氧化物酶的拉曼光譜。如圖所示，在413nm激發線下，出現了辣根過氧化物酶的特徵拉曼譜線，證明該酶已經成功負載到Fe3O4OTiO2納米複合物上。
【具體實施方式】
[0044]實施例I :一種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0045](a)製備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0046]Fe3O4磁性納米顆粒通過以下溶劑熱方法合成。在機械攪拌下將3. 24gFeCl3 ·6Η20、
10.44g乙酸鈉、溶解在120mL乙二醇溶液中；將得到的黃色溶液轉移到有聚四氟乙烯內襯的不鏽鋼反應釜中，在200°C反應12h ;利用外磁場分離收集黑色的磁性顆粒；分離產物用無水乙醇清洗4次後再分離收集，並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0047](b)製備核殼結構Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2NPs)：
[0048]將200mg步驟（a)製備的Fe3O4NPs加入到含180mL乙醇、40mL乙晴和ImL NH3 ·Η20的混合溶液中；通過超聲處理將Fe3O4NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL鈦酸四丁酯並機械攪拌2h ;用外磁場分離收集出磁性的合成產物Fe3O4OTiO2NPs膠體納米粒子；Fe304@TiO2NPs用無水乙醇清洗4次後再分離收集並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0049](c)製備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物：[0050]銳鈦礦型TiO2外殼是通過一種水熱方法合成。將200mg步驟（b )製備獲得的Fe3O4OTiO2NPs納米複合物通過超聲的方法分散在含67%(v/v)乙醇的水溶液中，然後加入2mLNH3 · H2O ;將上述懸浮液轉移到有聚四氟乙烯內襯的不鏽鋼反應釜中，在160°C反應24h ?』然後將得到的棕色反應產物(銳鈦礦型Fe3O4OTiO2)用外磁場收集；銳鈦礦型Fe3O4OTiO2用無水乙醇清洗4次後再分離收集，並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0051]Cd)製備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：
[0052]將步驟（C)製備的IOOmg銳鈦礦型Fe3O4OTiO2複合物用超聲的方法分散在200mL、1% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基矽烷（APTMS)水溶液中，並機械攪拌2h ;利用外磁場分離收集APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物；將APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物分散在lmL、2. 5%(v/v)戊二醛的水溶液中，並在室溫孵育Ih後獲得乙醛化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體。
[0053](e)載體對辣根過氧化物酶的荷載：
[0054]將80mg乙醒化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體與5mL、2mg/mL辣根過氧化物酶(EC1. 11. I. 7，Sigma)溶液充分混勻，室溫孵育4h ;每隔30min用紫外分光光度法測定不同時間點溶液的辣根過氧化物酶濃度，根據加入固定化酶載體後溶液酶蛋白濃度隨時間的變化曲線，計算載體對酶的最大荷載量，結果發現室溫孵育I. 5h，載體對酶的荷載量達到最大值，裝載量為21±5mg/g，保留了 93±6%游離酶的活性。
[0055](f)載體的再生方法：
[0056]荷載辣根過氧 化物酶的Fe3O4OTiO2納米複合物在紫外燈下照射4h ;然後利用外磁場分離、收集，並用乙醇清洗，將殘留的乙醇在60°C下揮發完全；隨後的拉曼光譜和酶活力檢測顯示紫外線照射處理能有效的去除載體表面的辣根過氧化物酶；將紫外線處理後的載體再次進行步驟（d)和步驟（e)，載體對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變；對載體連續進行了 10次的再生處理，載體對對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變。
[0057](g)載體和固定化酶的保存：
[0058]將空載體在30%的乙醇溶液中，4°C條件下貯存12個月後載體對酶的荷載量沒有顯著改變，保留了 99%以上的荷載效率；將固定化酶在含0.05%(w/v)NaN3的磷酸鹽緩衝液(pH=7. 4)中，4°C條件下貯存6個月，固定化酶的活性沒有顯著改變，保留了 96%以上的酶活力。
[0059]實施例2 : —種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0060]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將製備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例2是將按實施例I步驟（a)~（d)製備的載體與漆酶相連來檢測載體對漆酶（EC1. 10. 3. 2，Fluka)的荷載量和對酶活力的影響。結果顯示Fe3O4OTiO2納米複合物載體對漆酶的裝載量為98±9mg/g,保留了 96 ±4%游離酶的活性。
[0061]實施例3 :—種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0062]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將製備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例3是將按實施例I步驟（a)~（d)製備的載體與乙醇脫氫酶（EC1. I. I. 1，Sigma)相連來檢測載體對乙醇脫氫酶的荷載量和對酶活力的影響。結果顯示Fe3O4OTiO2納米複合物載體對乙醇脫氫酶的裝載量為105±6mg/g，保留了 93 ±5%游離酶的活性。
[0063]實施例4 :一種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0064]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將製備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對辣根過氧化物酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例4是將按實施例I步驟（a)~（d)製備的載體與β -葡萄糖苷酶（EC3. 2. I. 21，Sigma)相連來檢測載體對β_葡萄糖苷酶的荷載量和對酶活力的影響。結果顯示Fe3O4OTiO2納米複合物載體對葡萄糖苷酶的裝載量為125±10mg/g，保留了 92±7%游離酶的活性。
[0065]實施例5 :—種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0066](a)製備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0067]Fe3O4磁性納米顆粒通過水熱方法合成。向O. 15mol/L Fe (NO3) 3 ·9Η20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調至8. 0，加熱至70°C，經過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，經洗滌後採用機械攪拌的方法重新充分分散於水溶液中，再用NaOH溶液將pH值調至11.0，然後將以上溶液轉移到有聚四氟乙烯內襯的不鏽鋼反應釜中，在200°C反應6h;將反應完成後的溶液轉移到玻璃容器中，利用外磁場收集黑色的磁性顆粒；分離產物用無水乙醇清洗5次後再分離收集，並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0068](b)製備核殼結構Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2)：
[0069]將200mg步驟（a)製備的Fe3O4NPs加入到含180mT,乙醇、40mL乙晴和ImL NH3 ·3Η20的混合溶液中；通過超聲處理將Fe3O4NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL鈦酸四丁酯並機械攪拌2h ;用外磁場分離出磁性的合成產物Fe3O4OTiO2膠體納米粒子；Fe304@Ti02NPS用無水乙醇清洗5次後再分離收集，並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0070](c)製備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物：
[0071]銳鈦礦型TiO2外殼是通過一種水熱方法合成。將200mg步驟（b)製備獲得的Fe3O4OTiO2納米複合物通過超聲的方法分散在含60%(v/v)乙醇的水溶液中，然後加入2mLNH3 · H2O ;將上述懸浮液轉移到有聚四氟乙烯內襯的不鏽鋼反應釜中，在160°C反應24h ?』然後棕色的反應產物(銳鈦礦型Fe3O4OTiO2)用外磁場收集；銳鈦礦型Fe3O4OTiO2用無水乙醇清洗5次後再分離收集，並放置在60°C條件下揮發完全以備用。
[0072](d)製備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：：
[0073]將步驟（C)製備的IOOmg銳鈦礦型Fe3O4OTiO2複合物用超聲的方法分散在200mL、l%(w/w) 3-氨基丙基-三甲氧基矽烷（APTMS)水溶液中，並機械攪拌2h ;利用外磁場分離、收集APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物；將APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物分散在lmL、2. 5% (v/v)戊二醛的水溶液中，並在室溫孵育Ih後獲得乙醛化的固定化酶載體。
[0074](e)載體對辣根過氧化物酶的荷載：
[0075]將70mg乙醛化Fe3O4OTiO2固定化酶載體與5mL的2mg/mL辣根過氧化物酶(EC1. 11. I. 7，Sigma)溶液充分混勻，室溫孵育4h ;每隔30min用紫外分光光度法測定不同時間點溶液的辣根過氧化物酶濃度，根據加入固定化酶載體後溶液酶蛋白濃度隨時間的變化曲線，計算載體對酶的最大荷載量，結果發現室溫孵育I. 5h，載體對酶的荷載量達到最大值，裝載量為22±4mg/g，保留了 94±5%游離酶的活性。
[0076](f)載體的再生方法：[0077]荷載辣根過氧化物酶的Fe3O4OTiO2納米複合物在紫外燈下照射5h ;然後利用外磁場分離、收集，並用乙醇清洗，將殘留的乙醇在室溫下揮發完全；隨後的拉曼光譜和酶活力檢測顯示紫外線照射處理能有效的去除載體表面的辣根過氧化物酶；將紫外線處理後的載體再次進行步驟（d)和步驟（e)，載體對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變；對載體連續進行了 10次的再生處理，載體對對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變。
[0078](g)載體和固定化酶的保存：
[0079]將空載體在30% (v/v)的乙醇溶液中，4°C條件下貯存10個月後載體對酶的荷載量沒有顯著改變，保留了 97%以上的荷載效率；將固定化酶在含O. l%(w/v)NaN3的磷酸鹽緩衝液（pH=7.4)中，4°C條件下貯存6個月，固定化酶的活性沒有顯著改變，保留了 96%以上的酶活力。
[0080]實施例6 : —種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0081]如同實例5的各步驟操作，不同的是實施例5的步驟（e)是將製備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例6是將按實施例I步驟（a)~（d)製備的載體與漆酶（EC1. 10. 3. 2，Fluka)相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響。結果顯示Fe3O4OTiO2納米複合物載體對漆酶的裝載量為87±6mg/g,保留了95 ±7%游離酶的活性。
[0082]實施例7 : —種可再生磁性固定化酶載體的製備方法，
[0083]如同實例5的各步驟操作，不同的是實施例5的步驟（e)是將製備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對 酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例7是將按實施例I步驟（a)~（d)製備的載體與β -葡萄糖苷酶（EC3. 2. I. 21，Sigma)相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響。結果顯示Fe3O4OTiO2納米複合物載體對β-葡萄糖苷酶的裝載量為141±9mg/g，保留了 90 ±5%游離酶的活性。
【權利要求】
1.一種可再生的磁性固定化酶載體的製備方法，其步驟如下： (a)製備Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs； (b)製備核殼結構的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子Fe3O4OTiO2NPs： 將步驟（a)製備的100~200mg Fe3O4NPs分散於200~300mL的乙醇、乙晴和NH3 ·Η20的混合溶液中，乙醇、乙晴和NH3 · H2O的體積比160~200:40:1，再加入2~3mL鈦酸四丁酯並攪拌I~2h ;然後用外磁場分離收集得到磁性的Fe3O4OTiO2膠體納米粒子，將膠體納米粒子用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而得到核殼結構的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子Fe3O4OTiO2NPs ； (c)製備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物： 將步驟（b)製得的IOOmg Fe3O4OTiO2NPs分散於100~200mL、60~70%(v/v)乙醇的水溶液中，加入2~3mL的NH3 · H2O,然後將得到的懸浮液在160~180°C條件下水熱反應18~24h，棕色的反應產物用外磁場分離收集後用無水乙醇清洗3~5次，再用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而製備得到銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物； (d)製備Fe3O4OTiO2固定化酶載體： 將步驟（c)製備的銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米複合物分散於I~2% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基矽烷APTMS水溶液中，並攪拌2~5h ;利用外磁場分離收集得到APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米複合物，然後將其再分散於含2~3% (v/v)戊二醛的水溶液中，經室溫孵育I~3h後獲得Fe3O4OTiO2可再生磁性固定化酶載體。
2.如權利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的製備方法，其特徵在於：Fe3O4磁性納米顆粒通過溶劑熱方法合成，是將FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20和乙酸鈉按摩爾比1:9~1:11混合後分散於乙二醇中，FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20在乙二醇溶液中的濃度範圍為O. I~O. 15mol/L ;然後將得到的黃色溶液在200~220°C條件下反應8~12h，再將得到的溶液轉移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs15
3.如權利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的製備方法，其特徵在於=Fe3O4磁性納米顆粒通過水熱方法合成，是向O. I~O. 2mol/L的FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調至7. O~8. 0，加熱至60~.80°C，過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，凝膠經洗滌後重新分散於水中，再用NaOH溶液將pH值調至10.0~11. 0，然後將得到的溶液在200~220°C條件下水熱反應6~8h ;再將得到的溶液轉移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗.3~5次，再利用外磁場分離收集並放置在20~60°C條件下揮發完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs15
4.如權利要求2或3所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的製備方法，其特徵在於：分散的方法為磁力攪拌、超聲波方法或機械攪拌分散。
5.如權利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的製備方法，其特徵在於：分散的方法為機械攪拌或超聲波方法。
6.一種可再生的磁性固定化酶載體，其特徵在於：由權利要求1、2、3或5所述的方法製備得到。
7. —種可再生的磁性固定化酶載體，其特徵在於：由權利要求4所述的方法製備得到。
【文檔編號】C12N11/14GK103525805SQ201310544114
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】蔡林君, 陳雷, 趙冰 申請人:吉林大學