Pcl/pga止血泡沫的製作方法

2023-05-18 05:52:06 2

專利名稱：Pcl/pga止血泡沫的製作方法
技術領域：
本發明涉及在N端和C端具有疏水胺基酸基團的膠原相關肽(CRP)並涉及膠原模擬三聚體及其原纖，及它們的合成、使用方法和組合物；以及止血泡沫基材、此類基材的製造方法和刺激止血的方法。
背景技術：
膠原是哺乳動物體內最豐富的蛋白質，其廣泛分布在身體內，並且其繩狀三螺旋和組裝的原纖的剛度使其可以起到基本的結構作用，有助於為組織提供機械強度。最豐富的纖維膠原(I型、II型和III型)出現在皮膚、骨骼、軟骨、腱、韌帶、血管和眼睛的玻璃狀液內。更複雜的非纖維膠原(例如IV型和VI型)形成二維和三維網絡，用來支撐身體的間質組織，並且是可以附接上皮細胞層和內皮細胞層的基膜的基本組分。通常，纖維膠原含有三條獨立的肽鏈，它們彼此纏繞在一起，形成三螺旋(Rich A and Crick FHC, J. Mol. Biol.，1961，3，483-506 (Rich A 和 CrickFHC，《分子生物學雜誌》， 1961年第3卷第483-506頁))。膠原三螺旋的幾何約束和穩定性要求每三個胺基酸中有一個甘氨酸(Gly或G)，從而形成重複的-GXY-序列，其中X和Y通常分別表示脯氨酸(Pro 或P)和羥脯氨酸(Hyp或0)。膠原三螺旋的長度通常在300nm以上，並且具有1000個以上的胺基酸。通過此類膠原三螺旋的組裝所得到的原纖長度超過1 μ m。在未受損的健康組織內，膠原支撐血管壁及其周圍組織，並且被內皮細胞層隱蔽， 不能與在血流內流動的調節血小板凝聚過程的血小板接觸。然而，由於病變血管壁內的機械創傷或動脈粥樣硬化斑塊破裂而對血管壁造成的損傷會去除內皮細胞層，讓膠原與血小板和其他血漿蛋白相互作用，從而活化血小板，使其聚集和附著。這些過程對於血小板凝聚響應是必需的，並且為本領域所熟知。三螺旋構型因為膠原具有奇特的結構特徵和生物重要性，所以這類蛋白質長期以來都讓科學家們著迷。通過使用合成的膠原相關肽已經促進了對膠原三螺旋的結構、穩定性和功能的石開胃(Feng Y, Melacini G, Taulane JP and Goodman Μ, J.Am. Chem. Soc. ,1996,118, 10351-10358 (Feng Y、Melacini G、Taulane JP 和 Goodman M，《美國化學會志》，1996 年第 118卷第 10351-10358 頁)；Fields GB and Prockop DJ, Biopolymers 1996，40，345_357and references cited therein (Fields GB 和 Prockop DJ，《生物聚合物》，1996 年第 40 卷第 345-357 頁及其中引用的參考文獻)；Holmgren SK，Taylor KM, Bretscher LE and Raines RT, Nature 1998，392，666—667(Holmgren SK、Taylor KM^Bretscher LE 禾口 Raines RT，《自然》，1998 年第 392 卷第 666-667 頁)Jenkins CL and Raines RT, Nat. Prod. Rep. 2002, 19，49-59 (Jenkins CL和felines RT，《天然產物報告》，2002年第19卷第49-59頁)；以及 Shah NK, Ramshaw JAM, Kirkpatrick A, Shah C and Brodsky, B. Biochemistry 1996,35, 10262-10268 (Shah NK, Ramshaw JAM、Kirkpatrick A, Shah C 和 Brodsky，B.，《生物化學》， 1996年第35卷第10262-10268頁))。例如，使用具有特定識別基序的合成三螺旋肽使得可以深入研究膠原的受體結合性質。另外，膠原的三螺旋構象可以是其被血小板和其他膠原受體識別的先決條件。此外，某些三螺旋序列可以直接與血小板受體如GpVI直接相互作用，其中包括重複的三聯體甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸(GPO)序列。對於簡單的膠原相關肽，(GPO)ltl序列形成解鏈溫度為58-70°C的熱穩定的三螺旋。羥脯氨酸胺基酸通過促進水介導的氫鍵的形成和通過提供立體電子效應而使三螺旋結構穩定。此外，國際公開號W007/052067描述了一系列短的三螺旋膠原肽，其涵蓋III型膠原域，並且具有基於對血小板的血管性血友病因子的A3區的親和力的血小板粘附活性。國際公開號W007/017671描述了含有GPO重複序列的三聚肽，該三聚肽在肽之間不交聯的情況下能夠活化血小板。國際公開號W006/0983^描述了一種由POG多肽和磷酸鈣化合物製備的合成膠原膜。日本專利公開2005206542描述了含有多肽序列Pro-X-Gly和Y-Z-Gly 的膠原組織結構(其中X和Z表示脯氨酸(ftx))和羥脯氨酸(Hyp)，Y表示具有羧基的胺基酸殘基)。日本專利公開2005126360描述了用於抑制膠原酶的通過固態合成製成的含有多肽序列 Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (其中 Y 表示 Gln、Asn、Leu、lie、Val 或 Ala ；Z 表示 Ile 或Leu)的化妝品和食物組合物。美國專利公開2003/162941(相當於JP 2003321500)描述了具有序列ftx)-Y-Gly (其中Y表示Pro或Hyp)的三螺旋結構的膠原多肽。美國專利 5,973, 112(相當於W099/10381)描述了序列)(aa-Xbb-Gly (其中Xaa表示胺基酸殘基；)(bb 表示4 (R)-氟-L-脯氨酸(Flp)、4 (S)-氟-L-脯氨酸、4，4- 二氟脯氨酸或乙醯基、甲磺醯基或三氟甲基改性的羥脯氨酸)的三肽膠原模擬物。膠原模擬物(Pr0-Flp-Gly)ltl顯示具有相對於膠原相關三螺旋Pro-Pro-Gly和ft^-Hyp-Gly而言增加的穩定性。自組裝已經採用若干種策略以在分離的膠原配體序列中引發三螺旋結構的形成(如與國際專利公開W098/007752相當的美國專利6，096，863及其參考文獻中所討論的)。通過向膠原序列的兩端添加多個Gly-Pr0-Hyp重複序列，可以引發在分離的膠原序列中形成三螺旋結構。然而，即使50%以上的肽序列由Gly-Pr0-Hyp重複序列組成，所得三螺旋也可能不具有足以在生理條件下存活的足夠的熱穩定性。雖然通過在三條肽鏈的C端區之間引入共價鍵可以實現三螺旋結構的基本穩定，但所得「支化的」三螺旋肽化合物較大的尺寸(90-125個胺基酸殘基)使其難以進行合成和純化(如美國專利6，096，863及其參考文獻中所討論的)。雖然寡聚的CRP通過樹枝狀聚合物組裝或共價交聯可以在不固定化的情況下有效引發血小板聚集，但較無序的CRP(例如具有(POG)ltl序列的那些)缺乏這種性質(Rao GHR, Fields CG, White JG and Fields GB, J. Biol. Chem. 1994,269, 13899-13903 (Rao GHR、Fields CG,White JG 和 Fields GB，《生物化學雜誌》，1994 年第洸9 卷第 13899-13903 頁)；Morton LF, Hargreaves PG, Farndale Rff, Young RD and Barnes MJ, Biochem. J. 1995, 306, 337-344 (Morton LF、Hargreaves PG、Farndale RW、Young RD 和 Barnes MJ,《生物化學雜誌》，1995 年第 306 卷第 337-344 頁)；Knight CG, Morton LF, Onley DJ, Peachey AR, Ichinohe Τ, Okuma Μ, Farndale Rff and Barnes MJ. Cardiovasc. Res.1999,41,450-457(Knight CG> Morton LF、Onley DJ> Peachey AR、Ichinohe T、Okuma M、Farndale Rff和Barnes MJ,《心血管研究》，1999年第41卷第450-457頁))。能夠自組裝的CRP的可得性和有效性一直依賴於其製備的容易性、CRP結構的簡單性和穩定性以及聚集活性的可能性。雖然合成可能是有挑戰性的和相對複雜的，但已經通過採用半胱氨酸結自組裝共價連接的三股實體獲得了基於微米級CRP的材料(Koide T,Homma DL,Asada S and Kitagawa K,Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005,15,5230-5233(Koide T>Homma DL、Asada S 和Kitagawa K，《生物有機化學與醫藥化學通訊》，2005年第15卷第5230-5233頁)；Kotch F and Raines RT, Proc. Natl. Acad. Sci USA2006，103，3028—3033(Kotch F 禾口 Raines RT, 《美國科學院院刊》，2006年第103卷第3028-3033頁))。因此，仍然需要簡化的方法，以用於構建有利於肽對齊以及原纖引發和增長的膠原樣結構基序。具體地講，需要的是相對較短的單股CRP，這種CRP容易合成，並且能夠非共價自組裝成具有膠原模擬性質的三聚體。本領域還需要新型基材和用於刺激止血的新型方法，其中該新型基材具有增強的止血性質或止血活性，因而可以刺激止血。

發明內容
本發明總體上涉及一種能夠非共價自組裝成具有膠原模擬性質的三聚體的膠原相關多肽(CRP)。該CRP在N端和C端的每一端具有合成或天然的疏水胺基酸，其中所述胺基酸能夠引發原纖增長以形成膠原樣原纖。本發明還涉及式(I)的CRP B- (Z) m-X其中Z 為選自下列的三聯體Gly-Pro-J、Pro-J-Gly 和 J-Gly-Pro ；對於每個三聯體Z，J獨立地選自Hyp、fPro.mPro和ftO ；m 為選自 8、9、10、11、12、13、14 或 15 的整數；例如，如果Z為Gly-Pro-J且m為8，則8個J取代基中的每一個獨立地選自Hyp、 fPro、mPro 禾口 Pro ；並且，B和X獨立地選自F5_Phe、Phe(任選地在苯基上被氟、氯、溴、羥基、甲基或
代或二取代)371~、3，4-(0!1)2- 1^』6(^^1~、苯基甘氨酸、2-萘基 _Ala、l_ 萘基 _Ala、Trp、 Cha、Chg、Met、Leu、Ile 禾口 Val0本文所述CRP可用於構造可用來引發血小板聚集並用來治療和診斷出血性疾病的合成膠原。本發明的CRP還可用於作為止血劑的組合物中。本發明的另一個方面是新型止血泡沫基材和製造此類泡沫基材的新型方法，下文將對此進行進一步描述。本發明的又一個方面是如下文所述利用本發明的新型泡沫基材刺激止血的新型方法。


圖 1 為劑量-響應曲線，示出了具有 SEQ ID 25、SEQ ID 26、SEQ ID 27、SEQ ID 28, SEQ ID 34和SEQ ID 35的CRP與膠原相比在刺激血小板聚集方面的活性。
具體實施例方式本發明總體上涉及一種能夠非共價自組裝成具有膠原模擬性質的三聚體的CRP。該CRP在N端和C端的每一端具有合成或天然的疏水胺基酸，其中所述胺基酸能夠引發原纖增長以形成膠原樣原纖。本發明還涉及式(I)的CRP B- (Z) m-X其中Z 為選自下列的三聯體Gly-Pro-J、Pro-J-Gly 和 J-Gly-Pro ；對於每個三聯體Z，J獨立地選自Hyp、fPro、mPro和ft·。；m 為選自 8、9、10、11、12、13、14 或 15 的整數；例如，如果Z為Gly-Pro-J且m為8，則8個J取代基中的每一個獨立地選自Hyp、 fPro、mPro 禾口 Pro ；並且，B和X獨立地選自F5_Phe、Phe(任選地在苯基上被氟、氯、溴、羥基、甲基或
代或二取代)371~、3，4-(0!1)2- 1^』6(^^1~、苯基甘氨酸、2-萘基 _Ala、l_ 萘基 _Ala、Trp、 Cha、Chg、Met、Leu、Ile 禾口 Val0本發明的CRP能夠非共價自組裝成三聚體。所得CRP三聚體還能夠通過非共價、 芳環堆積和有序疏水相互作用更高階地自組裝成膠原樣原纖。本發明的一個實施例包括具有多個本發明的CRP的膠原樣纖維狀物質。本發明的實施例包括具有多個本發明的CRP的膠原樣纖維狀物質，其中CRP以多個CRP三聚體形式存在於膠原樣纖維狀物質中。在本發明的一個實施例中，CRP三聚體為同型三聚體，其中3個CRP為相同的。在本發明的一個實施例中，CRP三聚體為異型三聚體，其中3個CRP為不同的。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中Z為選自Gly-Pro-J、Pro-J-Gly和 J-Gly-Pro的三聯體，其中J在至少4個連續三聯體Z中為Hyp。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中對於每個三聯體Z，J獨立地選自Hyp、 fPro 禾口 Pro。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中對於每個三聯體Z，J獨立地選自Hyp和 Pro。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中m為10。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中B和X獨立地選自F5_Phe、Phe (任選地在苯基上被氟、氯、溴、羥基、甲基或CF3 —取代或二取代)、Tyr、3，4- (OH) 2-Phe、MeO-Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp, Cha、Chg, Met、Leu、lie 和 Val。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中B和X獨立地選自F5-Phe、Phe和Leu。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中B選自F5_Phe、Wie (任選地在苯基上被氟、羥基、甲基或CF3 —取代或二取代)371~、3，4-(0!1)2- 1^』6(^^1~、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp、Cha、Chg 禾口 Leu0本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中B選自F5_Phe、Phe(任選地在苯基上被氟、羥基、甲基或CF3 —取代或二取代)和Leu。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中B選自F5-Phe、Phe和Leu。本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中X選自Wie (任選地在苯基上被氟、氯、 溴、羥基、甲基或CF3 —取代或二取代)、Tyr、3，4-(0H)2-Phe、Me0_Tyr、苯基甘氨酸、2-萘基-Ala、1-萘基-Ala、Trp> Cha、Chg> Met、Leu、lie 禾口 Val0
本發明的一個實施例為式(I)的CRP，其中X為Wie。本發明的一個實施例為選自下列的式(I)的CRP SEQ ID 1 :B-(Gly-Pro-Hyp) 4-(Gly-Pro-J) n-X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或 11的整數；SEQ ID 2 :B_(Gly-Pro-Hyp) 8_(Gly-Pro-J)ρ_Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；SEQ ID 3 :B_(Gly-Pro-Hyp) 12-(Gly-Pro-J) q-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數；SEQ ID 4 :B_ (Pro-Hyp-Gly) 4_ (Pro-J-Gly) n_X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或 11的整數；SEQ ID 5 :B_(Pro-Hyp-Gly) 8_(Pro-J-Gly)ρ_Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；SEQ ID 6 :B_(ftO-Hyp-Gly) 12-(Pro-J-Gly) q-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數；SEQ ID 7 :B_ (Hyp-Gly-Pro) 4_ (J-Gly-Pro) n_X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或 11的整數；SEQ ID 8 :B_(Hyp-Gly-Pro) 8_(J-Gly-Pro)ρ_Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；或SEQ ID 9 :B_(Hyp-Gly-Pro) 12-(J-Gly-Pro) q-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數。在另外的實施例中，式(I)的CRP選自SEQ ID 10 :B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或11的整數；SEQ ID 11 :B_ (Gly-Pro-J) p-(Gly-Pro-Hyp) 8-Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；SEQ ID 12 :B_ (Gly-Pro-J) q-(Gly-Pro-Hyp) 12-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數；SEQ ID 13 :B_(Pro-J-Gly)n_(Pro-Hyp-Gly)4-X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或11的整數；SEQ ID 14 :B_ (Pro-J-Gly) p-G3TO-Hyp-Gly) 8-Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；SEQ ID 15 :B_ (ftO-J-Gly) q-(Pro-Hyp-Gly) 12-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數；SEQ ID 16 :B_(J-Gly-Pro)n_(Hyp-Gly-Pro)4-X，其中 η 為選自 4、5、6、7、8、9、10 或11的整數；SEQ ID 17 :B_ (J-Gly-Pro) p-(Hyp-Gly-Pro) 8-Χ，其中 ρ 為選自 O、1、2、3、4、5、6 或 7的整數；或SEQ ID 18 :B_ (J-Gly-Pro) q-(Hyp-Gly-Pro) 12-Χ，其中 q 為選自 O、1、2 或 3 的整數。
在另外其他的實施例中，式(I)的CRP選自SEQ ID 19 :B-(Gly-Pro-J) r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J) s-X，其中 r 和 s 各自為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 的整數，並且其中(Gly-Pro-J) r、(Gly-Pro-J) s 和 (Gly-Pro-Hyp) 4 的組合不超過(Z) 15 ；SEQ ID 20 :B_ (Gly-Pro-J) t_ (Gly-Pro-Hyp) 8_ (Gly-Pro-J) u_X，其中 t 和 u 各自為選自 1、2、3、4、5 或 6 的整數，並且其中(Gly-Pro-J) t、(Gly-Pro-J)u 和(Gly-Pro-Hyp) 8 的組合不超過(Z) 15 ；SEQ ID 21 :B- (Pro-J-Gly) r~ (Pro-Hyp-Gly) 4- (Pro-J-Gly) s-X,其中 r 和 s 各自為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 的整數，並且其中(Pro-J-Gly) r、(Pro-J-Gly) s 和 (Gly-Pro-Hyp) 4 的組合不超過(Z) 15 ；SEQ ID 22 :B_ (Pro-J-Gly) t_ (Pro-Hyp-Gly) 8_ (Pro-J-Gly) u_X，其中 t 和 u 各自為選自 1、2、3、4、5 或 6 的整數，並且其中(Pro-J-Gly) t, (Pro-J-Gly) u ^P (Gly-Pro-Hyp) 8 的組合不超過(Z) 15 ；SEQ ID 23 :B- (J-Gly-Pro) r~ (Hyp-Gly-Pro) 4- (J-Gly-Pro) s-X,其中 r 和 s 各自為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 的整數，並且其中(J-Gly-Pro) r、(J-Gly-Pro) s 和 (Gly-Pro-Hyp) 4的組合不超過(Z) 15 ；或SEQ ID 24 :B_ (J-Gly-Pro) t_ (Hyp-Gly-Pro) 8_ (J-Gly-Pro) u_X，其中 t 和 u 各自為選自 1、2、3、4、5 或 6 的整數，並且其中(J-Gly-Pro) t、(J-Gly-Pro)U 和(Gly-Pro-Hyp) 8 的組合不超過(Z) 15。在某些實施例中，式(I)的CRP選自SEQ ID 25 =F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)IO-Phe ；SEQ ID 26 =Phe-(Gly-Pro-Hyp)IO-Phe ；SEQ ID 27 :Leu-(Gly-Pro-Hyp)IO-Phe ；SEQ ID 31 =F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe ；SEQ ID 32 :Phe_(Gly-Pro-Hyp)9_Phe ；禾口SEQ ID 33 :Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe 在本發明的討論中，某些其他多肽序列包括比較 SEQ ID 28 :Gly- (Gly-Pro-Hyp) IO-Gly ；比較 SEQ ID 29 =Ac-(Gly-Pro-Hyp) IO-Gly ；參考SEQ ID 30 (Pro-Hyp-Gly) 4_ (Pro-Hyp-Ala) - (Pro-Hyp-Gly) 5 ；參考SEQ ID 34 (Pro-Hyp-Gly) 10 ；禾口比較 SEQ ID 35 :F5Phe_ (Gly-Pro-Hyp) 5_Ph。以舉例的方式，具有SEQ ID 25的式(I)的CRP具有下列結構
權利要求
1.一種製備止血泡沫基材的方法，所述方法包括以下步驟製備3重量％的35/65(摩爾/摩爾)PCL/PGA於1，4_ 二氧雜環己烷中的溶液； 將所述溶液傾入模具中； 將所述模具中的所述溶液凍幹； 將水溶液加到所述模具中的泡沫；讓所述泡沫在室溫下浸泡於所述水溶液中達充分有效的一段時間；以及將所述水溶液中的所述泡沫凍幹。
2.一種根據權利要求1所述的方法製備的止血泡沫基材。
3.一種增強哺乳動物中的止血的方法，所述方法包括將根據權利要求1所述的泡沫基材施用於所述哺乳動物的出血部位。
4.根據權利要求1所述的止血泡沫基材，所述基材包含35/65(摩爾/摩爾)的PCL/PGA。
全文摘要
本發明涉及在N末端和C末端具有疏水胺基酸基團的膠原相關多肽(CRP)，以及其合成、使用方法和其組合物，所述多肽能夠非共價自組裝成膠原模擬三螺旋及其原纖。本發明還涉及新型止血泡沫基材、製造所述泡沫基材的方法、以及使用此類泡沫基材刺激哺乳動物中的止血的方法。
文檔編號A61L15/32GK102369026SQ201080015780
公開日2012年3月7日 申請日期2010年1月29日 優先權日2009年1月30日
發明者C·楊, T·M·約翰, T·馬塔勒納斯 申請人:伊西康公司