白細胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途的製作方法

2023-05-06 03:44:06

專利名稱：白細胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及白細胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具體而言，本發明涉及一種包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白，其選自(l)II^mIL3m2S0N3，(2) IL2mIL3m3S0N3 或(3) II^mIL;3mlSON3，其中 IUm 是 IL2 的突變改型的衍生片段，IL3m2 是 IL3 的突變改型的衍生片段2，IL3m3是IL3的突變改型的衍生片段3，IUml是IL3的突變改型的衍生片段1，S0N3是DNA結合蛋白SON的衍生片段且富含鹼性胺基酸。特別地，本發明還涉及上述融合蛋白的用途、編碼核苷酸序列、包含所述編碼核苷酸序列的表達重組體、包含所述重組體的工程細胞或工程菌、生產所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的複合物及所述複合物的用途。
背景技術：
攻克癌症一直是醫學界面臨的重大挑戰。傳統的化療與放療有兩個重大缺陷一個是藥物嚴重的毒副作用，第二個是治療後容易復發。為了克服這兩個缺陷，首先需要靶向殺滅腫瘤細胞。腫瘤靶向治療是利用特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，把藥物的殺傷作用或治療效應儘量限定在特定的靶細胞、 組織或器官內，而不傷害正常細胞、組織或器官，從而提高療效、減少毒副作用，具有高特異性、高效性以及低毒副作用的特點。靶向治療的主要特點是特異性結合，本發明根據一般白血病細胞的表面富集的受體設計特異性結合的配體避免對正常細胞的損傷。IL2R在一般白血病細胞表面高表達並富集，在正常的血液細胞表面低表達，甚至不表達。因此，IL2R的配體IL2可以成為特異性結合白血病細胞的「靶向頭」。其次需要靶向殺滅腫瘤幹細胞。腫瘤生長是腫瘤組織中極少見的腫瘤幹細胞增殖的結果。腫瘤幹細胞具有自我增殖和自我分化能力，在啟動腫瘤形成和生長中起著決定性的作用，對一般的化療與放療不敏感，是腫瘤復發的「源泉」。如要減少腫瘤復發，相對徹底地治癒惡性腫瘤，則必須清除腫瘤幹細胞。目前，腫瘤幹細胞已經在多種腫瘤組織中得到了驗證。如白血病、乳腺癌、腦癌、前列腺腫瘤、室管膜瘤、皮膚癌等；以腫瘤幹細胞為靶標治療腫瘤是治癒腫瘤的新希望。急性髓性白血病中的腫瘤幹細胞又稱之為白血病幹細胞。白血病幹細胞具有自我更新能力和分化能力，並且基本處於休眠狀態。白血病幹細胞在細胞生物學方面不同於較成熟的白血病幼稚細胞，它對常規的化療無反應。這可能是白血病多藥耐藥、早期復發的主要原因。因此，特異地針對白血病幹細胞的治療策略，將為AML患者提供更有效的治療。白血病幹細胞表面包含有區別於正常造血幹細胞的特異性表面標誌 ⑶123(IL-3Ra )。以IL_3Ra為靶點為選擇性清除白血病幹細胞的有前途的治療策略。IL3R 的配體IL3可以成為特異性結合白血病幹細胞的「靶向頭」。通過靶向白血病細胞和白血病幹細胞，將藥物的毒性作用限制於這兩種細胞，可以避免對正常細胞的傷害。
4
綠膿桿菌毒素PE作為人體異源的毒素蛋白質不應直接應用於導入人體血循環。 這是由於其產生的細胞殺傷作用不具備腫瘤細胞特異性，對人體可造成嚴重的毒副作用； 同時其作為人體異源蛋白還具有很強的免疫原性，不僅可導致抗體的迅速生成使之被中和失活，並可引起人體發生嚴重的過敏反應，甚至休克與死亡。因此需要把毒素導入血循環的方式由毒素蛋白質改為相應的毒素的編碼基因，從而最大限度地避免毒素蛋白質導入人體血循環時所造成的嚴重的毒副作用問題與免疫原性問題。因此，存在對特異性靶向白血病細胞核白血病幹細胞並特異性殺傷白血病細胞和白血病幹細胞的藥物需求。

發明內容
因此，本發明的技術目的在於開發一種能特異性靶向殺傷和/或清除白血病細胞與白血病幹細胞的藥物。因此，本發明的第一方面涉及一種包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白，其選自:(l)IL2mIL3m2S0N3, (2) IL2mIL3m3S0N3 ^ (3) IL2mIL3mlS0N3，其中 IUm是 IL2 的突變改型的衍生片段，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其中IL3m2是IL3的突變改型的衍生片段2，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 10所示，IL3m3是IL3的突變改型的衍生片段3，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，IUml是IL3的突變改型的衍生片段1，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12，其中S0N3是DNA結合蛋白SON的衍生片段且富含鹼性胺基酸，其相應的胺基酸序列如SEQ ID N0. 13所示。本發明的第二方面涉及如上所述的融合蛋白作為非病毒載體的用途，其中所述非病毒載體的用途是指所述融合蛋白利用其自身鹼性胺基酸所帶的正電荷與攜帶負電荷的核苷酸序列相互結合併利用融合蛋白中與細胞表面特異性受體結合的成分將所述核苷酸序列轉運至特定的靶細胞，從而起到靶向性運輸工具的作用。本發明的第三方面涉及如上所述的融合蛋白的編碼核苷酸序列，其特徵在於編碼所述IL2m、IL3m2、S0N3的核苷酸序列在不改變所述融合蛋白胺基酸序列的情況下，根據使用的宿主細胞的密碼子偏愛性相應調整所述核苷酸序列的密碼子，優選地，IL3m2的DNA編碼序列如SEQ ID N0. 2所示，IL3m3的DNA編碼序列如SEQ ID N0. 3所示，IL3ml的DNA編碼序列如SEQ ID N0. 4所示，IL2m的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 1所示，S0N3的DNA編碼序列如 SEQ ID N0. 5 所示。優選地，如上所述的融合蛋白的特徵在於IL2mIL3m2S0N3的胺基酸序列如SEQ ID N0. 14所示，和 / 或 IL2mIL3m3S0N3 的胺基酸序列如 SEQ ID N0. 15 所示，和 / 或 II^mIL;3mlSON3 的胺基酸序列如SEQ ID N0. 16所示，優選地，IL2mIL3m2S0N3的DNA編碼序列如SEQ ID N0. 6 所示，和/或IL2mIL3m3S0N3的DNA編碼序列如SEQ ID N0. 7所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的 DNA編碼序列如SEQ ID N0. 8所示。本發明的第四方面涉及包含如上所述的融合蛋白的編碼核苷酸序列或如上所述的編碼核苷酸序列的原核或真核表達重組體，優選地，所述表達重組體是由原核質粒載體 pCfflll 構建而成的表達型重組體 pCW-II^mIL3m2S0N3(圖 8)、pCW_IL2mIL3m3S0N3 (圖 15)或 pCff-IL2mIL3mlS0N3 (圖 19)。本發明的第五方面涉及包含如上所述的融合蛋白的編碼基因或如上所述的編碼核苷酸序列或如上所述的表達重組體的工程細胞或工程菌，其中所述細胞為適用於表達重組體表達的植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，所述菌為適用於表達重組體表達的細菌、 放線菌、黴菌或酵母菌，優選地，所述菌為細菌，更優選地，所述菌為大腸桿菌，最優選地，所述菌為大腸桿菌DH5 α。優選地，如上所述的工程細胞或工程菌的特徵在於所述工程菌為 pCff-IL2mIL3m2S0N3, pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW-II^mIL;3mlSON3 分別轉化入大腸桿菌 DH5 α 宿主細胞獲得的 DH5 α /pCff-IL2mIL3m2S0N3, DH5 α /pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 DH5 α / pCW-II^mIL3mlS0N3。本發明的第六方面涉及製備如上所述的融合蛋白的方法，其特徵在於可以以化學合成、半化學合成和/或重組表達的方式製備所述融合蛋白，優選地，以重組表達的方式製備所述融合蛋白，最優選地，通過在恰當的表達條件下培養權利要求6或7所述的工程細胞或工程菌獲得所述的融合蛋白。本發明的第七方面涉及所述的融合蛋白和毒素基因限制性表達重組體NFBS-miniCMV-PEIIImut組成的複合物，其中所述毒素基因限制性表達重組體 NFBS-miniCMV-PEIIImut在中國專利申請200610112334. 3中公開，其譜圖如圖40所示。本發明的第八方面涉及如上所述的複合物在製備殺傷和/或清除白血病細胞與白血病幹細胞的藥物中的用途。換言之，本發明旨在探索一條新的技術路線以克服傳統療法所帶來的藥物嚴重的毒副作用及治療後容易復發兩個缺陷，即一是靶向殺滅腫瘤細胞，二是靶向殺滅腫瘤幹細胞。為此，本發明構建與研製融合蛋白作為非病毒載體，並將之與已有的毒素基因限制性表達重組體組裝成複合物，用以準確靶向清除一般白血病細胞和白血病幹細胞，而不傷及正常細胞。非病毒載體融合蛋白/毒素基因限制性表達重組體複合物，乃經由一個毒素基因的靶向性運輸的設計與另一個毒素基因的限制性表達的設計，從而實現毒素基因只能在惡性腫瘤細胞以及腫瘤幹細胞內表達、而不能在正常細胞內表達的意圖。毒素基因的靶向性運輸設計是通過受體與配體特異性結合把毒素基因運輸至受體富集的腫瘤細胞及腫瘤幹細胞表面。本發明提供的這組非病毒載體與已有的毒素基因限制性表達重組體組裝成複合物一旦導入血循環，複合物將通過其包含的配體靶向性結合至 IL2R和/或IL3R富集的白血病細胞與白血病幹細胞表面，進而通過內吞作用進入細胞內。 正常細胞表面不表達或少表達這2類受體，複合物與之不結合或者結合較少。通過將複合物限制於白血病細胞與白血病幹細胞表面而避免傷及正常細胞，減少複合物的毒副作用。複合物進入細胞內以後，毒素基因是否表達受腫瘤特異性高表達的核因子-KB(NF-KB)調控，即限制性表達，本發明應用毒素基因限制性表達重組體 NFBS-miniCMV-PEIIImut ο其中，NFBS是由3個正向、3個反向克隆的NF_kB轉錄因子的結合位點及其旁側的DNA序列組成。miniCMV是削帽縮短的真核啟動子CMV。它必須在NF-κ B 的激活下才有啟動子的活性。PEIIImut是綠膿桿菌毒素第III功能域編碼序列的強毒突變型。白血病細胞與白血病幹細胞高表達NF-κ B (NF-κ B+)，複合物通過受體與配體特異性靶向結合併進入白血病細胞與白血病幹細胞以後，細胞內高表達的NF-K B與毒素基因表達載體上的NFBS結合，激活了 miniCMV偏動子，被激活的miniCMV驅動了其下遊的毒素基因PEIIImut的高表達，進而殺傷該細胞。轉錄因子NF-K B在正常細胞內無活性(NF-κ B_)， 因此毒素基因即使進入了正常細胞也不會表達，該正常細胞不會被殺傷。通過毒素基因的限制性表達將複合物的毒副作用最小化。也即，本發明通過上述革命性的全新靶向性設計，成功地實現了將包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白特異性靶向白血病細胞及白血病幹細胞，在所述融合蛋白通過受體、配體靶向結合到白血病細胞和白血病幹細胞並通過內吞作用進入白血病細胞和白血病幹細胞後，毒素基因在腫瘤特異性高表達的核因子-κ B(NF-kB)調控下進行表達，從而殺死所述白血病細胞和白血病幹細胞，為以毒副作用最小化的方式實現防治復發的白血病治療提供了一種有效的藥物。


圖1.表達重組體pCW_IL2mS0N3構建示意圖。圖 2. PCR 反應得到 NdeI-II^mIL3m2S0N3-BamHI 1.DNA 分子量標準 DL2000，2. PCRC 產物 NdeI-II^mIL3m2S0N3-BamHI，大小為 916bps。圖3. Nde I 和 BamHI 雙酶切鑑定克隆 pCW-II^mIL3m2S0N3 結果4·DNA分子量標準DL15000，1-3，5-7. pCff-IL2mII3m2S0N3 克隆雙酶切產物。圖4.表達重組體pCW-II^mIL3m2S0N3構建示意圖。圖5.表達重組體pCW_IL3m2S0N3構建示意圖。圖 6. PCR 反應得到 Nde I-IL2mIL3m3S0N3_BamH I 1.DNA 分子量標準 DL2000Plus，2. PCR 產物 Nde I-IL2mIL3m2S0N3_BamHI，大小為 916bps。圖7.克隆 pCW-II^mIL3m3S0N3Nde I 和 BamHI 雙酶切鑑定結果1.DNA 分子量標準 DL2000，2-6. pCW-IL2mIL3m3S0N3 克隆雙酶切產物。圖8.表達重組體pCW-II^mIL3m3S0N3構建示意圖。圖 9. PCR 反應得到 NdeI-II^mIL3mlS0N3-BamH I 1.DNA 分子量標準 DL2000Plus，2. PCR 產物 NdeI-II^mIL3mlS0N3-BamHI，大小為 916bps。圖10.克隆 pCW-II^mIL3mlS0N3Nde I 和 BamHI 雙酶切鑑定結果1.DNA 分子量標準 DL2000，2-6. pCff-IL2mIL3mlS0N3 陽性克隆雙酶切產物。圖11.表達重組體pCW-II^mIL;3mlSON3構建示意圖。圖12.經陽離子層析後所收集樣品的SDS-PAGE電泳結果1.蛋白分子量標準(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌體裂解液(未誘導)，3.菌體裂解液(誘導)，4. IL2mIL3m2S0N3 包涵體溶解液，
5.純化後樣品。圖13.經陽離子層析後所收集樣品的SDS-PAGE電泳結果1.蛋白分子量標準(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌體裂解液(未誘導)，3.菌體裂解液(誘導)，4. IL2mIL3m3S0N3 包涵體溶解液，5.純化後樣品。圖14.經陽離子層析後所收集樣品的SDS-PAGE電泳結果1.蛋白分子量標準(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌體裂解液(未誘導)，3.菌體裂解液(誘導)，4. IL2mIL3mlS0N3 包涵體溶解液，5.純化後樣品。圖15.經陽離子層析後所收集樣品的SDS-PAGE電泳結果1.蛋白分子量標準(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌體裂解液(未誘導)，3.菌體裂解液(誘導)，4. IL3m2S0N3包涵體溶解液，5.純化後樣品。圖16.經陽離子層析後所收集樣品的SDS-PAGE電泳結果1.蛋白分子量標準(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌體(未誘導)，3.菌體(誘導)，4. IL2mS0N3包涵體溶解液，5.純化後樣品。圖17.抗IL2抗體分析融合蛋白表達1. IL2mIL3m2S0N3 免疫印跡，2. IL2mIL3m3S0N3 免疫印跡，3. IL2mIL3mlS0N3 免疫印跡，4. IL3m2S0N3 免疫印跡，5. IL2mS0N3 免疫印跡。圖18.瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗對融合蛋白II^mIL3m2S0N3結合DNA的能力進行評價1.DNA 分子量標準 DL15000，2. DNA,3-8.不同質量比的蛋白與DNA的孵育產物。圖19.瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗對融合蛋白II^mIL3m3S0N3結合DNA的能力進行評價1.DNA 分子量標準 DL15, 000，
2. DNA,3-8.不同質量比的蛋白與DNA的孵育產物。圖20.瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗對融合蛋白II^mIL;3mlSON3的結合DNA的能力進行評價1.DNA 分子量標準 DL15000，2. DNA,3-8.不同質量比的蛋白與DNA的孵育產物。圖21.瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗對融合蛋白IL3m2S0N3結合DNA的能力進行評價1.DNA 分子量標準 DL15000，2. DNA,3-9.不同質量比的蛋白與DNA的孵育產物。圖22.瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗對融合蛋白IL2mS0N3結合DNA的能力進行評價1.DNA 分子量標準 DL15000，2. DNA,3-8.不同質量比的蛋白與DNA的孵育產物。圖23.同一蛋白對於不同細胞株的轉染效率。圖中 23S 代表 II^mIL3m2S0N3 ；23S-G 代表 IL2mIL3m3S0N3 ；23S-GAL 代表 IL2mIL3mlS0N3 ；3S代表IL3m2S0N3 ；2S代表IL2mS0N3 (本發明下文中出現的簡稱所代表的非病毒載體均與此一致)；DNA代表綠色螢光蛋白EGFP-Nl表達載體。圖24. RT-PCR檢測PEIIImut的轉錄情況1.DNA 分子量標準 DL2, 000，2-4. NFBS-miniCMV-PEIIImut 轉染 HUT78 後的 RT-PCR 產物(507bps, 426bps, 379bps)，5-7. NFBS-miniCMV-PEIIImut 轉染 HL60 後的 RT-PCR 產物(507bps,426bps, 379bps)，8.陽性對照，9.陰性對照。圖25. —般白血病細胞株HUT-78 (IL2R+IL3R—NF-κ B+)在各瞬時轉染條件下所得到的MTT結果以殺傷率(％ )表示細胞殺傷活性大小圖中DNA代表毒素基因限制性表達載體NFBS-miniCMV-PEIIImut(本發明下文圖譜中出現的DNA均代表同一毒素基因表達載體)；顯示劑量以毒素基因限制性表達重組體 NFBS-miniCMV-PEIIImut所用劑量表示(本發明下文圖譜中出現的所用劑量標準均與此一 1)。圖26. —般白血病細胞株HL60 (IL2R—IL3R+NF-κ B+)在各瞬時轉染條件下所得到的MTT結果以殺傷率(％ )表示細胞殺傷活性大小。圖27.腫瘤細胞株HEPG2 (IL2R"IL3R"NF- κ B+)在各瞬時轉染條件下所得到的MTT 結果，以殺傷率(％ )表示細胞殺傷活性大小。圖28.非病毒載體融合蛋白/NFBS-miniCMV-PEIIImut複合物轉染HUT78細胞後
凋亡率。
圖29.非病毒載體融合蛋/NFBS-miniCMV-PEIIImut複合物轉染HL60細胞後凋亡率。圖30.急性髓性白血病病人來源單個核細胞在各瞬時轉染條件下所得到的細胞殺傷率。圖31.健康志願者來源單個核細胞在各瞬時轉染條件下所得到的細胞殺傷率。圖32.流式細胞儀分選⑶34+⑶123+雙陽性白血病幹細胞。圖33.白血病幹細胞純度鑑定。圖34. CD;34+CD123+白血病幹細胞瑞氏染色。圖35.甲基纖維素培養基培養18d後集落生成。圖36.與基質細胞共培養5周後可見細胞呈鵝卵石狀排列。圖37.白血病幹細胞在各瞬時轉染條件下所得到的細胞殺傷率。圖38. IL2mIL3m3S0N3/LIP/DNA對白血病幹細胞的細胞殺傷作用。圖39. IL2mIL3m3S0N3/Ca++/DNA對白血病幹細胞的細胞殺傷作用。圖40.毒素基因限制性表達載體NFBS-miniCMV-PEIIImut圖譜。圖41.總體設計方案示意圖。圖42.實驗流程圖。
具體實施例方式總體設計方案示意圖見圖41、實驗流程圖見圖42。本發明涉及的融合蛋白作為非病毒載體與毒素基因限制性表達重組體DNA組裝而成的複合物，乃經由一個毒素基因的靶向性運輸的設計與另一個毒素基因的限制性表達的設計，從而實現毒素基因只能在惡性腫瘤細胞內表達、而不能在正常細胞內表達的意圖。毒素基因的靶向性運輸設計是通過受體與配體特異性結合把毒素基因運輸到受體富集的腫瘤細胞表面。在非病毒載體融合蛋白(l)IL2mIL3m2S0N3、(2) II^mIL3m3S0N3或 (3) IL2fflIL3ffllS0N3的設計中，以受體的配體IL3、IL2或其突變衍生物作為「靶向頭」，並與編碼富含鹼性胺基酸的DNA結合蛋白及核定位多肽的序列S0N3連接，且以基因工程的技術方法，克隆與表達並製備其相應的融合蛋白作為非病毒載體。本發明涉及的融合蛋白非病毒載體靶向結合域IL3m2、IL3ml，其受體富集於一般白血病細胞及白血病幹細胞表面；其中IL3m3取自IL3第9-1 胺基酸片段，並且將 AsplOl突變為Tyr，Lysl 16突變為Tyr以增強其與IL3Ra的結合能力。IL3m2在IL3m3基礎上，把Glu22突變為Wie，以去除IL3與IL_3Ri3亞基的結合能力並增加其與L3Ra的競爭性結合，IUml增強其與IL3Ra的結合能力，同時考察IL3m2、IL3m3突變位點的效果。本發明涉及的融合蛋白非病毒載體靶向結合域IL、，其受體富集於一般白血病細胞表面，取自IL2N端1-100個胺基酸，並將第58位半胱氨酸突變為絲氨酸，以獲得無生物學活性但保留其結合受體能力的IL2衍生片段。本發明涉及的DNA結合域S0N3包含核定位序列和DNA結合序列，由58個胺基酸組成，富含鹼性胺基酸。該片段豐富的正電荷可與富含負電荷的毒素基因重組體DNA結合成複合物；其核定位序列可介導該複合物進入細胞核。本發明運用DNA重組技術，將IL3mS基因或IL3m2基因或IL3ml基因、IUm基因、S0N3
10基因相聯接，構建、表達了融合蛋白II^mIL3m3S0N3與II^mIL3m2S0N3及II^mIL;3mlSON3。毒素基因的限制性表達設計是對毒素基因特異性表達的調控。本發明應用只在惡性腫瘤細胞內具有轉錄調控活性的轉錄因子(如NF-kB)作為調控序列以將毒素基因的表達嚴格限制在腫瘤細胞內，從而殺滅該細胞；因該轉錄因子在正常細胞內無活性，毒素基因即使進入了正常細胞也不會表達，該正常細胞不會被殺傷。本發明涉及的融合蛋白作為非病毒載體與毒素基因限制性表達重組體組裝而成的複合物不但靶向殺傷白血病細胞，還靶向殺傷白血病幹細胞，同時不傷及正常細胞。同時，本發明還構建並研製了分別只含有單個配體的IL2mS0N3與IL3m2S0N3融合蛋白作為對照，以全面分析白細胞介素3衍生片段的融合蛋白作為非病毒載體與毒素基因限制性表達重組體組裝成複合物的智能化抗癌功能。實施例^MM 1編碼融合蛋白非病毒iH本的IL2二某的獲得本發明以qmIL2-pG載體(在專利申請號為200610112334. 3的說明書中有詳細說明)為模板，設計外引物(引物序列如SEQ ID NO. 17所示)以及上下遊引物(引物序列如SEQ ID NO. 18和19所示)在5，端引入Nde I酶切位點序列CATATG及起始密碼子AUG，在3』端引入融合蛋白Iinker(G4SG4T)序列GGTGGCGGAGGTTCTGGTGGC GGTGGAACC，通過重疊PCR擴增已突變的IL2基因編碼從N-C端1-100個胺基酸的DNA序列獲得片段NdeI-(IL2m+linker)-，大小為368bps。重疊PCR反應體系總體積60 μ 1，組成為體系 I :DNA 模板 0. 5-1 μ g, dNTPs (2mM) 4 μ 1，Pfu DNA 聚合酶 QU/μ 1)0. 25 μ 1， 10XPCR Buffer(20mMMg2+)5y 1，上遊引物(10 μ Μ) 2 μ 1，下遊引物(10 μ Μ) 2 μ 1，加 ddH20 至總體積50μ 1。體系II 上遊引物(各10μΜ)2. 4μ 1，下遊引物(各10μΜ)2. 4μ 1， dNTPs (2mM) 0. 8 μ 1，PfuDNA 聚合酶(2U/μ 1)0. 05 μ 1, IOXPCRBuffer (20mM Mg2+) 1 μ 1，加 ddH20至總體積10 μ 1 ；反應條件為體系I :95°C X 5分鐘，(95°C X 1分鐘一50°C X 45秒 -72V Xl分鐘)X8循環，72°C X8分鐘暫停，加入體系II，(95°C X 1分鐘一50°C X45 秒一720C X 1分鐘)X 30循環，72°C X 10分鐘。本發明後續重疊PCR反應體系及條件均照此進行，各參數可能隨情況作適當調整，不再一一列出。擴增完以後，取5μ 1 PCR產物於 1. 0% Agrose電泳檢測，結果表明獲得了大小符合預期的片段，_20°C保存。實施例2編碼融合蛋白非病毒載體的S0N3基因片斷的獲得本發明以NCBI登錄號為NM_032195的SON蛋白編碼核苷酸為模板，設計外引物 (引物序列如SEQ ID NO. 20所示)以及上下遊引物(引物序列如SEQ ID NO. 21和22所示) 在5，端引入融合蛋白Iinker(G4TC4T)編碼序列GGTGGCGGCGGTACCGGTGGTGGCGGAACT以及鹼性胺基酸KRKRS編碼序列AAACGCAAGCGTAGC，在3』端引入BamH I酶切位點序列GGATCC，通過0VERLAP-PCR獲得片段(linker-S0N3)-BamH 1_，大小為237bps，瓊脂糖凝膠電泳證實獲得的片段大小與預期相符。實施例3原核表達重組體pCW_IL2mS0N3表達重組體的構建本發明以實施例1中獲得的IUm和實施例2中獲得的S0N3為模板，設計外引物 (引物序列如SEQ ID N0. 23所示)以及上下遊引物(引物序列如SEQ ID NO. M和25所示)進行重疊PCR以連接、擴增DNA片段。回收並純化後用BamH I和Nde I雙酶切，同樣雙酶切pCWlll原核表達載體，按酶連比例連接載體片段，構建pCW-IL2mS0N3表達重組體。重組體構建流程見圖1，瓊脂糖凝膠電泳證實了獲得的片段大小與預期相符。實施例4原核表達重組體pCW-II^mIL3m2S0N3表達重組體的構建本發明以實施例1中獲得的IUm和實施例2中獲得的S0N3以及通過全基因合成獲得的模板，用引物(弓丨物序列如SEQ ID NO. M和25所示)進行重疊PCR以連接、擴增得到DNA片段。回收並純化後用BamHI和Nde I雙酶切，同樣雙酶切pCWlll原核表達載體，按酶連比例連接載體片段，構建pCW-II^mIL3m2S0N3表達重組體。重組體構建流程見圖4，實驗結果見圖2、圖3。 實施例5原核表達重組體pCW_IL3m2S0N3表達重組體的構建本發明以實施例4中獲得的pCW-IL2mIL3m2S0N3為模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 25和沈所示)擴增得到DNA片段。回收並純化後用BamHI和Nde I雙酶切，同樣雙酶切pCWlll原核表達載體，按酶連比例連接載體片段，構建pCW-IL3m2S0N3表達重組體。重組體構建流程見圖5，瓊脂糖凝膠電泳證實了獲得的片段大小符合預期大小。實施例6原核表達重組體pCW-II^mIL3m3S0N3表達重組體的構建本發明以實施例4中獲得的pCW-IL2mIL3m2S0N3為模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 27和28所示)設計突變IL3m2Glu22位點為Phe ；通過PCR擴增得到2個DNA片段。 利用引物SEQ ID NO. 24和25通過重疊PCR將獲得的2個DNA片段連接。回收並純化後用 BamHI和Nde I雙酶切，同樣雙酶切pCWlll原核表達載體，按酶連比例連接載體片段，構建 pCff-IL2mIL3m2S0N3表達重組體。重組體構建流程見圖8，實驗結果見圖6、圖7。實施例7原核表達重組體pCW-II^mIL;3mlSON3表達重組體的構建本發明以實施例6中獲得的pCW-IL2mIL3m3S0N3為模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 29和30所示)設計突變lL3m2Aspl01突變為Tyr, Lysl 16突變為Tyr ；通過PCR擴增得到2個DNA片段。利用引物(引物序列如SEQ ID N0. 24和25所示)通過重疊PCR將獲得的2個DNA片段連接，回收並純化後用BamHI和Nde I雙酶切，同樣雙酶切pCWlll原核表達載體，按酶連比例連接載體片段，構建pCW-IL2mIL3m2S0N3表達重組體。重組體構建流程見圖11，實驗結果見圖9、圖10。實施例8 融合蛋白非病毒載體 IL2mIL3m2S0N3、IL2mIL3m3S0N3, IL2mIL3mlS0N3, IL3m2S0N3和IL2mS0N3的大腸桿菌表達分別以鑑定後的陽性表達重組體pCW-IL2mIL3m3S0N3、pCW_IL2mIL3m2S0N3、 pCff-IL2mIL3mlS0N3, pCff-IL3m2S0N3 和 pCW_II^mS0N3 轉化 Ecoli 宿主菌 DH5 α，37 °C 培養過夜。同時設置PCWlll空載體及無DNA的轉化體系作為陽性和陰性對照。挑取陽性轉化單菌落接種含50yg/ml氨苄青黴素的5ml LB液體培養基，32 °C振蕩培養過夜。菌液按1 2% (ν/ν)比例轉接於150 200mlLB抗性液體培養基，32°C振蕩培養至菌液 OD6tltl達0.4 0.6。42 °C振蕩培養4小時。菌液於6000rpm離心10分鐘，收集菌體沉澱，進行SDS-PAGE，檢測目的蛋白的表達。結果顯示，與非誘導陰性對照相比，誘導表達質粒pCW-IL2mIL3m2S0N3 (預期蛋白分子量33. 78kD)、pCff-IL2mIL3m3S0N3 (預期蛋白分子量 33. 76kD) ,pCff-IL2mIL3mlS0N3 (預期蛋白分子量 33. 68kD)、pCW_IL3m2S0N3 (預期蛋白分子量 21. 58kD)和pCW-IL2mS0N3(預期蛋白分子量19. 52kD)均於相應條帶大小附近出現特異性條帶，分子量與預期一致。實施例9 融合蛋白非病毒載體 IL2mIL3m2S0N3、IL2mIL3m3S0N3, IL2mIL3mlS0N3,
12IL3m2S0N3 和 IL2mS0N3 的純化本發明使用ACTAR蛋白純化儀通過陽離子層析柱純化蛋白。9.1層析步驟9. 1. 1陽離子柱的清洗與平衡起始緩衝液(A液)磷酸緩衝液(pH = 7. 4)；洗脫緩衝液(B液)磷酸緩衝液(pH = 7. 4)，2M氯化鈉；利用A液清洗機器管路，並在25min內達到A液的柱平衡。再採用梯度上升的方式，在5min內達到B液的柱平衡。隨後，重新瞬時恢復至A液的柱平衡。[注]所有用於層析的液體，均必須0.22μ m濾膜過濾。9. 1.2 上樣上樣前的樣品處理將得到的復性後包涵體14，OOOrpm離心IOmin後，取上清經過 0. 22 μ m孔徑濾膜，得到包涵體上樣液。將A管置入製備好的得到包涵體上樣液，設置流速為 lml/min。9. 1.3蛋白的洗脫及目的蛋白的收集流速始終保持在lml/min。在上樣結束後實施蛋白的B液梯度洗脫，即設置B液在 20min內在陽離子柱中所佔比例由0%經梯度上升至100%。隨著B液比例的提高，緩衝液的極性將逐漸增加，相應極性的蛋白組分隨之從固定相洗脫下來，隨洗脫液出柱，同時在監測器上出現相應的明顯的吸收峰。收集吸收峰所對應的洗脫液。9. 2SDS-PAGE電泳檢測收集的層析樣品收集層析純化後樣品，以及上柱樣品、菌體樣品，一同進行SDS-PAGE電泳檢測，實驗結果見圖12、圖13、圖14、圖15、圖16。並使用ChromSCan3快速凝膠掃描儀於6^nm波長處對凝膠進行掃描，分析目的蛋白分別在上柱樣品和層析收集樣品中所佔比例。9. 3依照上述層析步驟將待上柱樣品全部層析，利用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce 公司)進行蛋白定量。將收集的純化後的樣品透析至IXPBS溶液中，定量並凍幹，-70°C保存，用於隨後細胞實驗。實施例10融合蛋白非病毒載體的理化性質檢測10. 1選擇4個純化後融合蛋白送N端胺基酸測序。結果表明其序列與理論序列相符。10. 2利用抗IL2抗體、對5種融合蛋白進行免疫印跡，進一步檢測目的蛋白的表達。10. 2. 1蛋白轉移電泳PVDF膜先用甲醇浸溼，再用電轉緩衝液浸溼轉膜所用的海綿、濾紙和PVDF膜，其中PVDF膜至少要平衡lOmin。順序放置電轉儀塑料支架、海綿、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿、電轉儀塑料支架(凝膠和PVDF膜之間不要有氣泡)，然後將塑料支架夾緊。 將上述系統放入電轉槽中(注意使PVDF膜在正極方向)。於O°C以電流200mA轉膜Ihr。10. 2. 2 雜交電轉完畢的PVDF膜先於TBST溶液中洗滌5min，再於封閉液中室溫封閉lhr。將膜放入用封閉液稀釋的一抗溶液中，室溫孵育l_2hr或4°C孵育過夜。用TBST溶液洗膜3 次，每次lOmin。將膜放入用封閉液稀釋的二抗中，室溫孵育1-air。再用TBST溶液洗膜3次，每次lOmin。吸去膜上多餘水分，蛋白面向上放在保鮮膜上。將化學發光液均勻滴加於 PVDF膜表面，避光Imin後，小心將膜包裹。在暗室中用X光片進行顯影。實驗結果見圖17。實施例11融合蛋白作為非病毒載體對毒素基因限制性表達重組體DNA結合能力的檢測，即瓊脂糖遷移延遲檢測首先分別計算各融合蛋白和DNA所帶電荷的數量。依據每摩爾質粒DNA所帶的負電荷摩爾數，按照每個鹼基帶一個磷酸根基團即一個負電荷計算，雙鏈DNA乘以2 ；蛋白質所帶的負電荷按照天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)各貢獻一個負電荷；賴氨酸(K)精氨酸(R)各貢獻一個正電荷計算。理論上計算出蛋白質與DNA帶相同電荷時的質量比。依據理論上的結果，選擇合適的融合蛋白與毒素基因限制性表達重組體NFBS-miniCMV-PEIIImut比例進行孵育並進行瓊脂糖凝膠電泳，比較遷移率變化情況。當兩者的比例合適並形成蛋白/DNA 複合物，則複合物的電泳遷移較單獨質粒電泳明顯滯後；選擇複合物僅稍有泳出加樣孔時所對應的非病毒載體蛋白與DNA的最小質量比(本發明下合物的制各方法以及制各比仿|丨均桉照此方法以及誦i寸此方法獲得的質量比)。實驗結果見圖18、圖19、圖20、圖21、 圖22。實施例12融合蛋白作為非病毒載體的轉染效率檢測分別將複合物加入前Id已經接種好的無抗生素培養基培養的細胞株 HUT78 (IL2R+IL3IT)、HL60 (IL2ITIL3R+)、HEPG2 (IL2R"IL3R0 (每孔重複 3 次)。非病毒載體融合蛋白IL2mIL3mlS0N3, IL2mIL3m2S0N3, IL2mIL3m3S0N3，IL3m2S0N3， IL2mS0N3與綠色螢光蛋白報告載體pEGFP-Nl (工作濃度為lyg/ml)以分別質量比5 1， 5 1,5 1,4 1,3 1的比例進行孵育，製備非病毒載體融合蛋白/pEGFP-m複合物。脂質體與綠色螢光蛋白報告載體pEGFP-Nl (工作濃度為1 μ g/ml)按照2μ 1 1 μ g比例進行孵育，製備脂質體/pEGFP-Nl複合物。將複合物加入無抗生素培養基培養的細胞株。觀察轉染細胞的綠色螢光蛋白的表達情況，實驗結果見表1，圖23。表1計算各自轉染效率並進行分析
權利要求
1.一種包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白，其選自l)IL2mIL3m2S0N3， 2) IL2mIL3m3S0N3或3) IL2mIL;3mlSON3，其中IUm是IL2的突變改型的衍生片段，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其中工！^&是〗!^的突變改型的衍生片段2，其胺基酸序列如 SEQ ID NO. 10所示，IL3m3是IL3的突變改型的衍生片段3，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，仏；^是〗!^的突變改型的衍生片段1，其相應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12，其中S0N3是DNA結合蛋白SON的衍生片段且富含鹼性胺基酸，其相應的胺基酸序列如SEQID NO. 13所示。
2.根據權利要求1所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白作為非病毒載體的用途，該用途是指所述融合蛋白利用其自身鹼性胺基酸所帶的正電荷與攜帶負電荷的核苷酸序列相互結合併利用融合蛋白中與細胞表面特異性受體結合的成分將所述核苷酸序列轉運至特定的靶細胞，從而起到靶向性運輸工具的作用。
3.根據權利要求1所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白的編碼核苷酸序列，其特徵在於編碼所述IL2m、IL3m2、S0N3的核苷酸序列在不改變所述融合蛋白胺基酸序列的情況下，根據使用的宿主細胞的密碼子偏愛性相應調整所述核苷酸序列的密碼子，優選地，IL3m2的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 2所示，IL3m3的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 3所示，IL3ml的DNA編碼序列如SEQID NO. 4所示，IL2m的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 1 所示，S0N3的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 5所示。
4.根據權利要求1所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白，其特徵在於II^mIL3m2S0N3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 14所示，和/或II^mIL3m3S0N3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 15所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的胺基酸序列如SEQ ID NO. 16所示，優選地，II^mIL3m2S0N3的DNA編碼序列如SEQID NO. 6所示，和/或II^mIL3m3S0N3的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 7所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的DNA編碼序列如SEQ ID NO. 8所示。
5.將根據權利要求1或4所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白的編碼核苷酸序列或根據權利要求3所述的編碼核苷酸序列重組連接到原核或真核表達載體後獲得的表達重組體，優選地，所述表達重組體是由原核質粒載體PCWlll構建而成的表達型重組體 pCW-II^mIL3m2S0N3、pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW_II^mIL3mlS0N3。
6.包含根據權利要求1或4所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白的編碼核苷酸序列或根據權利要求3所述的編碼核苷酸序列或根據權利要求5所述的表達重組體的工程細胞或工程菌，其中所述細胞為適用於表達重組體表達的植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，所述菌為適用於表達重組體表達的細菌、放線菌、黴菌或酵母菌，優選地，所述菌為細菌，更優選地，所述菌為大腸桿菌，最優選地，所述菌為大腸桿菌DH5 α。
7.根據權利要求6所述的工程細胞或工程菌，其特徵在於所述工程菌為 pCW-IL2mIL3m2S0N3、pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW-II^mIL;3mlSON3 分別轉化入大腸桿菌 DH5 α 宿主細胞獲得的 DH5 α /pCff-IL2mIL3m2S0N3, DH5 α /pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 DH5 α / pCW-II^mIL3mlS0N3。
8.製備根據權利要求1或4所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白的方法，其特徵在於可以以化學合成、半化學合成和/或重組表達的方式製備所述融合蛋白，優選地，以重組表達的方式製備所述融合蛋白，最優選地，通過在本領域已知的表達條件下培養權利要求6或7所述的工程細胞或工程菌獲得所述的融合蛋白。
9.根據權利要求1或4所述的包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白和毒素基因限制性表達重組體NFBS-miniCMV-PEIIImut組成的複合物，其中所述毒素基因限制性表達重組體NFBS-miniCMV-PEIIImut在中國專利申請號2006101123 . 3中公開。
10.根據權利要求9所述的複合物在殺傷和/或清除白血病細胞與白血病幹細胞中的用途。
全文摘要
本發明涉及白細胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具體而言，本發明涉及一種包含突變改型的白細胞介素3衍生片段的融合蛋白，其選自(1)IL2mIL3m2SON3，(2)IL2mIL3m3SON3或(3)IL2mIL3m1SON3，其中IL2m是IL2的突變改型的衍生片段，IL3m2是IL3的突變改型的衍生片段2，IL3m3是IL3的突變改型的衍生片段3，IL3m1是IL3的突變改型的衍生片段1，SON3是DNA結合蛋白SON的衍生片段且富含鹼性胺基酸。本發明還涉及上述融合蛋白的用途、編碼核苷酸序列、包含所述編碼核苷酸序列的重組體、包含所述重組體的工程細胞或工程菌、生產所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的複合物及所述複合物的用途。本發明為殺傷和/或清除一般白血病細胞以及白血病幹細胞提供了一種全新機理的藥物。
文檔編號A61K47/42GK102336835SQ201010234598
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者盧麗, 盧聖棟, 李濤, 王欣, 王湛, 肖衛純, 路金芝, 陳偉京 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所