用於預防和/或治療粥樣動脈硬化的組合物的製作方法

2023-05-06 12:50:41 1

專利名稱：用於預防和/或治療粥樣動脈硬化的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導免疫口服耐受性的組合物。
背景技術：
在西方社會，粥樣動脈硬化和它的臨床後遺症就其發病率和死亡率而論，是其中一個最危險的危害。因此，為了提供減緩或阻止粥樣動脈硬化的早期無痛進程的方法，已經花費巨大的力量來研究它的發病機理也就不奇怪了。雖然沒有明確的答案，但正逐步顯示出動脈粥樣硬化斑的逐漸形成並非僅與某一單獨機制有關，就像以前在脂平衡的異常調節方面所推測的。
臨床醫師利用詞語粥樣動脈硬化來定義導致身體各部分的動脈閉塞的組織病理學過程。閉塞是由於循環中逐步被大量脂肪填充的各種來源的不同細胞積聚而引起的。脂肪是沉積於脈管壁的主要物質，它主要是由「有害」膽固醇低密度脂蛋白(LDL)組成的。在粥樣動脈硬化的後期，脂質填充區開始積聚鈣。鈣的沉積致使動脈更硬、柔韌性更差，因此引起了它們的「石狀」外觀，這是導致了我們眾所周知的「動脈硬化症」(粥樣動脈硬化)的外觀。當所涉及的動脈阻礙了血液流向心臟，一個人就會「心臟病發作」；當腦部動脈閉塞時，這個人就會表現出中風。當四肢的動脈狹窄時，就會導致劇烈疼痛、降低身體可動性並可能需要進行截肢。
很明顯，許多年內都不能夠察覺到以上提到的疾病的進展，而只在晚期才表現出來。當能夠察覺到表現時，由於已經處於疾病晚期，因此進行治療要難得多。
像在上面提到的，粥樣動脈硬化是由於脂肪沉積於血管壁，因此形成了一個動脈粥樣硬化斑層，該層阻礙了血液流向生命器官，從而導致中風綜合症，心肌梗塞或外周血管疾病。已知的可加快病程的風險因素包括高血壓、糖尿病、肥胖、吸菸和缺乏運動。
最近的研究表明，傳染性因子如巨細胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)和肺炎衣原體也可能與粥樣動脈硬化的發展有關。除了血管阻塞和再狹窄與抗-CMV抗原的自身抗體效價之間的聯繫，或是在動脈粥樣硬化斑上發現傳染性顆粒之外，以上的發現還通過粥樣動脈硬化和齦炎之間的聯繫得到了證實。
最近十年，已經積累了許多證據來支持粥樣動脈硬化具有一個重要的傳染性自身免疫組分這一理論。
在自身免疫疾病中，免疫系統除攻擊外來入侵物外，也攻擊我們身體的組分(自身抗原)。自身免疫疾病可分為自身抗體介導的疾病或細胞介導的疾病。典型的自身抗體介導的自身免疫疾病包括重症肌無力和特發性血小板減少性紫癜(ITP)，而典型的細胞介導的自身免疫疾病是橋本氏甲狀腺炎和I型糖尿病。
在粥樣動脈硬化中涉及免疫網絡公認在粥樣動脈硬化損傷中免疫介導過程是普遍的，這種認識產生於在最初階段，即脂肪紋中一貫觀測到淋巴細胞和巨噬細胞。與更晚期的損傷相比，在早期損傷中，發現大部分為CD4+細胞(其餘為CD8+細胞)的這些淋巴細胞要比巨噬細胞更多，在更晚期的損傷中，這個比例趨向於逆轉。這些發現引出的問題是它們是反映了對於一個潛在抗原的初次免疫致敏作用，還是作為先前引起的局部組織損傷的一個純粹副現象而保持。無論這些因子是否將炎症細胞募集到早期動脈粥樣硬化斑，它們似乎表現出一種活化的狀態，這通過伴隨的II類MHC的HLA-DR和白介素(IL)受體以及白細胞共同抗原(CD45R0)和極晚期抗原1(VLA-1)整合蛋白的表達而得到證明。
在粥樣動脈硬化損傷早期階段，正在發生的炎症反應或者可能是主要的起始事件，從而導致局部細胞(即內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和炎性細胞)產生各種細胞因子，或者這個反應可能是機體防禦免疫系統對抗危害過程的一種形式。已經表明被居留細胞上調的細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ和單核細胞化學引誘肽-1(MCP-1)。也顯示出在動脈粥樣硬化斑中由細胞成分表達的血小板衍生生長因子(PDGF)是超量表達的，因此可能強化了由有絲分裂和趨化因子形式的共同刺激支持的先存炎症反應。就在最近，在UyemuraK，Demer LL，Castle SC等，粥樣動脈硬化中IL-12和IL-10的交叉調節作用.J Clin Invest 1996 97；2130-2138中闡述了與正常動脈相比，在人粥樣動脈硬化損傷中1型T細胞的細胞因子型，例如強表達IFN-γmRNA而不是IL-4 MRNA。此外，在損傷中發現了主要由活化單核細胞產生的並且是Th1細胞因子型的選擇性誘導物的T細胞生長因子—IL-12超量表達，這通過存在大量的它的主要異源二聚體形式p70和p40(它的顯性誘導型蛋白)mRNA而得到證明。
與證明在動脈粥樣硬化斑中細胞免疫系統佔優勢的有力證據相似，同樣也有充足的證據證明了也涉及局部體液免疫系統。因此，除了居留巨噬細胞中C3b和C3Bi受體的表達增加之外，在動脈粥樣硬化斑中還顯示出免疫球蛋白和補體組分的沉積。
關於免疫介導的炎症反應促進粥樣動脈硬化進程的有價值線索來自動物模型。因此，與免疫活性小鼠相比，無免疫應答小鼠(I類MHC缺陷型)似乎趨向於出現加速粥樣動脈硬化。另外，利用IL-2轉錄的有效抑制劑環孢菌素A治療C57BL/6小鼠(Emeson EE，Shen ML.環孢菌素A治療高脂血C57BL/6小鼠的加速粥樣動脈硬化.Am JPathol 1993；1421906-1915)和紐西蘭白兔(Roselaar SE，Schonfeld G，Daugherty A.抑制細胞介導的免疫在膽固醇餵養兔中增強出現粥樣動脈硬化.J Clin Invest 1995；961389-1394頁)在「正常」脂蛋白「負載」下可導致明顯增強的粥樣動脈硬化。這些隨後的研究可能使人們深入地了解參與對抗粥樣動脈硬化斑中的自我保持的炎性過程的免疫系統的可能作用。
雖然粥樣動脈硬化的一些表現如產生阻塞血管的硬化斑可能與免疫系統作用有關，但它並不是一種典型的自身免疫疾病。在典型的自身免疫疾病中，可以很明確地確定受免疫系統攻擊的自身抗原；可以確定攻擊屬於免疫系統的自身抗原(自身抗體或細胞)的免疫系統部分，即淋巴細胞。最重要的是可以表明通過被動轉移這些免疫系統組分，在健康動物上可以誘導疾病，或是在人類中，患病孕婦可能將疾病傳給她的下一代。在粥樣動脈硬化中，以上幾點並不是很普遍。另外，粥樣動脈硬化的確具有共同的風險因素，如高血壓、糖尿病、缺乏體育運動、吸菸等；它影響老年人；它比典型自身免疫疾病具有不同的遺傳優勢。
從本世紀初以來就已經知道了誘導口服耐受的方法以減小變態反應。為變應性患者餵食低劑量的已知變應原，則機體的免疫耐受就會恢復，而不發生變態反應。
自身免疫疾病的口服耐受在自身免疫疾病中，口服耐受是用於描述減弱自身免疫疾病的免疫應答的術語。通過給動物餵食「有罪」抗原而產生的耐受，由於對免疫應答的「麻痺」作用，可以消除疾病的發生。最近本發明人揭示出，在用β2GP-1免疫之前口服人β2GP-1導致改善相當於抗磷脂(APS)的綜合症(anti-phospholipid(APS)-equivalent syndrome)。
口服耐受已經應用於自身免疫疾病領域，在自身免疫疾病中進行對抗自身抗原的免疫反應，而且也存在恢復免疫系統對自身抗原耐受的需要。這是通過給受治療者餵食低劑量的自身抗原進行的。迄今為止，已經報導了幾個動物模型，其中恢復了口服耐受，除通過給受治療者餵食膠原蛋白和HSP-65分別預防佐劑性關節炎和膠原性關節炎之外，包括通過給受治療者餵食來自神經膜的一種蛋白，即髓磷脂鹼性蛋白(MBP)，防治了相當於多發性硬化症(MS)的實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)的發生，。建于波士頓的一家名為「自身免疫」的公司已經進行了幾個預防糖尿病、多發性硬化症、類風溼性關節炎和眼色素層炎的人體實驗。人體實驗的結果並不比非人體實驗更令人印象深刻，然而在預防關節炎上卻獲得了成功。
抗原組分A.氧化的低密度脂蛋白LDL是一種大分子量蛋白的複合物，包括載脂蛋白B、中性脂、極性脂和親脂性抗氧化劑(維生素E和β胡蘿蔔素)。氧化修飾LDL，導致在天然分子中形成新表位(neoepitopes)(在Apo B結構域中)，使得它能夠被巨噬細胞上的清除受體所識別。粥樣動脈硬化斑中的所有細胞組分(即內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和淋巴細胞)有可能增強脂類過氧化，產生不同程度的LDL氧化，然而並不能確定它們各自的相對影響。不考慮這些細胞的精確作用，看來血管壁水平的氧化和抗氧化力之間的平衡決定了暴露於Ox LDL的程度以及隨後有害作用。Ox LDL具有活化衍生物，如溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，而且Ox LDL儘管是小分子量的，也仍然保留了一些生物活性。
溶血磷脂醯膽鹼(LPC)在人粥樣動脈硬化斑中表達。它是一種可以誘導粥樣動脈硬化第一步的活性生物物質。實際上，它比Ox LDL甚至更有效。
Ox LDL和它的副產品對於硬化斑的發生的總體體內和體外影響大大超出了本發明的範圍，但它對於闡明Ox LDL和免疫系統間的已知關係是重要的。
我們已經知道OxLDL是T細胞和單核細胞的趨化因子。而且OxLDL和它的副產品可以誘導如單核細胞趨化因子1的因子的表達；誘導集落刺激因子的分泌和發揮血小板活化特性，所有這些都是有效的生長刺激物。
Stemme S，FaberB，HolmJ等最近已經證實了在粥樣動脈硬化中細胞免疫應答的主動介入。來自人粥樣動脈硬化斑的T淋巴細胞識別氧化的低密度脂蛋白。Proc Natl Acad Sci USA 1995；923893-3897公開了從對作為刺激物的Ox LDL應答的硬化斑克隆中分離了CD4+。與Ox LDL相應的克隆(每27個中有4個)主要產生γ幹擾素，而不是IL-4。尚須了解上述T細胞克隆是否說明僅以細胞免疫系統與強烈刺激免疫原(Ox LDL)接觸，還是這個反應為對抗明顯的無痛粥樣動脈硬化過程而提供方法。
關於涉及體液機制的數據及其含義倍受爭議。幾篇報導已經將抗Ox LDL抗體水平的增加與粥樣動脈硬化的進程(通過頸動脈狹窄程度、外周血管病的嚴重程度等表現)相聯繫。然而，其它科學家沒有重現這些數據，也許是因為沒有對用來測定對LDL抗體的測定進行標準化。在所有情況下，似乎關於在粥樣動脈硬化斑中存在免疫複合物形式的Ox LDL抗體是一致的，儘管尚未確定這一發現的真正意義。
已經假設Ox LDL的抗體在脂蛋白代謝中起積極作用。因此，知道與Ox LDL相比，Ox LDL的免疫複合物和它的對應抗體在懸浮液中可以更有效的被巨噬細胞所吸收。由於Ox LDL被巨噬細胞加速吸收是有益的還是有害的問題仍然沒有解決，因此從對於粥樣動脈硬化的發病機理的這一一致的發現中並不能夠得出任何的結論。
從動物模型中獲得了關於體液免疫系統在粥樣動脈硬化中重要性的重要數據。已經發現，與用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)超免疫的對照組相比，用同源氧化LDL超免疫LDL-受體缺陷兔導致產生高水平的抗-Ox LDL抗體，並與粥樣動脈硬化損傷程度的明顯減小有關。利用富含膽固醇的脂質體免疫兔也減少了硬化斑的形成，並伴隨抗-膽固醇抗體的產生，而這個效應也伴隨有極低密度脂蛋白膽固醇水平下降35％。本發明人研究表明，在apoE剔除(knockout)小鼠中，利用同源Ox LDL重複免疫導致產生抗-Ox LDL抗體並減緩粥樣動脈硬化。
B.熱休克蛋白(HSP)60/65另外的一個起始炎症損傷並使損傷永存，從而最終導致增強粥樣動脈硬化的主要抗原組分是60Kd的熱休克蛋白。這種線粒體蛋白是HSP家族中的一員，該家族是由在不同物種間具有高度序列同源性的大約24種蛋白組成的。這些蛋白就像它們的名字所顯示的，對於各種脅迫損害包括暴露於自由基、熱、機械剪切應力、感染和細胞因子等做出反應而被上調。HSP的目的論重要性來自於它們對抗脅迫刺激物促進的細胞蛋白解摺疊的保護作用。這個作用使它們被命名為分子「伴侶蛋白」。然而，HSP的這些明顯有利作用也是一把雙刃劍，因為它們的高度表達在一定條件下可能促進自身免疫反應，從而導致組織損傷。負責HSP免疫介導的損傷的機制目前仍不是完全清楚，並假設隱藏的新表位在上調後，暴露於免疫系統而不再被免疫系統識別為「自身抗原」。另一方面，有人認為在「外來」HSP和在感染後引入的自身HSP間存在交叉反應，這起作用而觸發針對自身結構的免疫攻擊。
HSP 60是一種特殊蛋白，它構成上面提到的HSP家族內的一個不同「類別」，並與HSP65一起為一個亞組蛋白的體內摺疊提供一個隔離的環境。
在哺乳動物HSP60和細菌HSP65之間存在相似性，它容易被宿主的免疫效應子交叉識別。
證明在一些自身免疫疾病中自身抗體增強和對於HSP 60/65的細胞應答的研究支持了HSP涉及自身免疫的觀點。
HSP65和粥樣動脈硬化間的聯繫最初開始於Georg Wick小組在二十世紀九十年代初開展的開拓性工作(Xu Q，Dietrich H，Steiner HJ等，通過用免疫熱休克蛋白65免疫在正常膽固醇血小鼠、兔中誘導粥樣動脈硬化.Arteriosclerosis Thrombosis 1992；12789-799)。他們發現，只要用於免疫的製劑含有弗氏完全佐劑(CFA)，則利用不同的抗原免疫的兔發生粥樣動脈硬化，。由於CFA的主要成分是熱滅活的結核分枝桿菌，而它的首要組分是HSP-65，他們由此認為針對此組分的免疫應答導致粥樣動脈硬化的發生。當所述動物隨後僅僅用HSP-65免疫後，並且顯現出明顯的粥樣動脈硬化時，這個假設得到證實。需要強調的是，注意到各組之間在脂蛋白分布型方面沒有差別。隨後Wick的小組開展的另外工作揭示出，與來自相應動物的外周血相比，發現從誘發粥樣動脈硬化的兔的損傷處提取的T細胞超量表達HSP-65，從而證明在受脅迫的主動脈脈管的附近存在局部和受限的免疫反應。本發明人加強了Wick的發現，表明HSP-65(或結核分枝桿菌)免疫初次實驗的小鼠導致加速形成脂肪紋。
當在患有粥樣動脈硬化的患者中觀察到了涉及對HSP-65應答的體液免疫機制時，進一步證明了這些發現。因此，在高水平抗-HSP65抗體和在篩選健康個體中根據聲波圖估計的頸動脈狹窄程度之間建立了相互關係。
最近，用於評價HSP-60/65對於培養內皮細胞的影響的體外分析加強了這些發現。因此，已經表明內皮細胞與HSP65一起溫育可引起它們對單核細胞和粒細胞的粘連性，這種粘連性是濃度和時間依賴性的。此外，已經證實，這種作用是由內皮細胞E-選擇蛋白(C62E)、血管細胞粘附分子-1(CD106)和細胞內粘附分子-1(CD54)的超量表達介導的。
磷脂和β2GP1作為粥樣動脈硬化中的自身抗原組分本發明人發現，在用人抗心磷脂抗體(aCL)免疫的LDL-受體剔除小鼠中，抗心磷脂的產生會促進早期粥樣動脈硬化。這個發現是由關於抗心磷脂抗體在粥樣動脈硬化中的可能前致動脈粥樣化(proatherogenic)作用方面積累的的間接資料一致。
β2GP1是一種證明為自身免疫病患者的aCL目標的分子。已經表明抗-β2GP1抗體會導致實驗性APS並活化內皮細胞和血小板。本發明人已經證明，用β2GP1免疫的轉基因型LDL-RD缺陷小鼠會產生相應的抗體以及促進早期脂肪紋的形成，並伴隨有CD4+細胞的局部聚集。因此，在粥樣動脈硬化中，β2GP1可能作為自身免疫應答的一個自身抗原目標。
在動物和人類疾病模型中已經發現了自身抗原HSP60-65和OxLDL的自身抗體效價與粥樣動脈硬化水平之間的相互聯繫。體內OxLDL是由於天然LDL的氧化產生的並且被認為是粥樣動脈硬化的有害因子。對所述毒素應答產生抗-Ox LDL抗體。β2GP-1是人血液中對血液凝結過程起作用的一個天然蛋白；HSP65是各種脅迫刺激的結果。
在利用具有粥樣動脈硬化發生的遺傳素因的小鼠(LDL-R剔除小鼠)進行的實驗中，通過餵食小鼠低劑量Ox LDL表明粥樣動脈硬化病症縮減了30％。
此外，免疫系統參與粥樣動脈硬化的誘發的事實以及免疫系統(淋巴細胞、自身抗體)的明確參與，指出了利用自身抗原例如Ox LDL、HSP60/65和β2GP1誘發口服耐受而控制疾病的能力。
美國專利第5,348,945號公開了一種在脅迫下的細胞或組織中對抗死亡率的方法。該方法包括將促進該細胞或組織存活有效量的熱休克蛋白70(HSP70)接觸該細胞或組織。該方法也許可以應用於在需要這樣的治療的人類或動物受治療者中對抗粥樣動脈硬化、血管成形術後的再狹窄和神經損傷。也公開了在藥學上可接受的製劑中包含治療有效量HSP70的藥用組合物。
雖然HSP70和HSP60屬於包括大約24種高度保守的熱休克蛋白的家族，但它們表現出兩種截然不同的特性。例如，它們的機制看來在控制抵抗脅迫刺激的保護作用方面的作用不一致。
HSP70最初獲得專利是由於其在熱暴露和其他脅迫損傷如缺血性預調節中具有明顯的誘發作用。確實在轉基因動物中HSP70的超量表達與防止脅迫危害的保護作用有關。
因此，美國專利第5,348,945號沒有指出或提示本發明的主題。
本發明的公開因此，依照本發明現在提供了一種通過口服給予預防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種用於口服的藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發明的一個優選實施方案中，提供了一種通過口服給予預防和/或治療心臟病發作的誘導免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發明的另一個優選實施方案中，提供了一種通過口服給予用於預防和/或治療血管成形術-再狹窄的誘導免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發明的一個更優選實施方案中，提供了一種通過口服給予預防和/或治療中風的誘導免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發明的一個甚至更優選實施方案中，提供了一種誘導免疫及口服耐受的組合物，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65(HSP60/65)或β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本發明提供了一種誘導免疫口服耐受的組合物，其中所述活性衍生物是溶血磷脂醯膽鹼(LPC)。
本發明也提供了一種誘導免疫口服耐受的組合物，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
本發明的另一個方面提供了一種預防和/或治療受治療者的粥樣動脈硬化的方法，包括口服給予一種誘導免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個優選實施方案中，提供了一種預防和/或治療受治療者的心臟病發作的方法，包括口服給予一種誘導免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個更優選實施方案中，提供了一種預防和/或治療受治療者的血管成形術-再狹窄的方法，包括口服給予一種誘導免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個甚至更優選實施方案中，提供了一種預防和/或治療受治療者中風的方法，包括口服給予一種誘導免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發明的另一個實施方案中，提供了一種預防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65(HSP60/65)或其中所述活性組分是β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本發明還提供了一種預防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述活性衍生物是溶血磷脂醯膽鹼(LPC)。
本發明還提供了一種預防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
其中用到的名詞「功能性衍生物」預計包括標記蛋白、綴合蛋白、融合嵌合蛋白和可溶形式的純化受體以及所述蛋白的片段、缺失和保守置換。
本發明人從粥樣動脈硬化中存在針對Ox LDL的免疫應答和針對Ox LDL的反應與該疾病嚴重性之間的相互聯繫，並結合在小鼠和兔中Ox LDL的活性疫苗可以阻止粥樣動脈硬化的發生的證據得出以下結論通過給人類受治療者服用Ox LDL誘導免疫耐受，可以導致粥樣動脈硬化進程速度減緩。需要提到的是，通過口服誘導免疫耐受的機制有可能是通過細胞因子TGFβ的刺激和產生以及非特異性抑制T細胞的發育而介導的。
本發明的口服耐受可以擴展以產生旁路(bystandard)抑制效應即阻斷髮生在粥樣動脈硬化斑附近並對它的發生起一定作用的其他(非抗原特異性)自身免疫(抗自身)應答。
需要注意的是，本發明的目的是誘導耐受或者麻痺針對HSP65的免疫應答，而不是僅僅獲得血清升高來幫助蛋白解摺疊。
因此，一方面本發明結合了口服耐受、Ox LDL和粥樣動脈硬化，粥樣動脈硬化是一種部分由於免疫因素引起的疾病。已經報導Ox LDL在小鼠和兔中誘導Ox LDL抗原的免疫反應(與誘導免疫耐受相對比)並促進粥樣動脈硬化病症。在這些動物模型中，沒有報導Ox LDL進行口服實驗，也完全沒有提出用於口服耐受。
依照本發明用於口服給予的藥用組合物是按照本身已經清楚的方法製備的，以及其給予也是按照已知的口服給予方法。
治療前面描述的疾病的有效量取決於一些平常的因素，例如所述疾病的性質以及嚴重性和哺乳動物的體重對於口服給予，最好以單位劑量組合物的形式給予所述活性成分。
這些組合物是通過混合製備的，並適合於以片劑、膠囊、口服液體製劑、粉劑、顆粒劑等形式口服給予。
用於口服給予的片劑和膠囊通常呈現為單位劑量，並包括常規的賦形劑，如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、添味劑和甜味劑。片劑可以依照本領域的已知方法進行包衣。
可用的合適填充劑包括纖維素、甘露醇、乳糖和其他相似填充劑。合適的崩解劑包括澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、澱粉衍生物如澱粉羥基乙酸鈉。合適的潤滑劑包括例如硬脂酸鎂。藥學上可接受的合適潤溼劑包括硫酸月桂酯鈉。
這些固體口服組合物可以通過摻和、填充或壓片的常規方法製備。重複的摻和操作可以使得活性劑均勻分散在使用了大量填充劑的那些組合物中。當然，這樣的操作在本領域是常規的。
口服液體製劑可以是某些形式，例如水性或油性懸浮劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者是做為乾粉，在使用前用水或其他合適介質重建。這些液體製劑可以包括一些常規添加劑，例如懸浮劑，如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂；乳化劑，例如卵磷脂、山梨糖醇酐單油酸脂或阿拉伯膠；非水性介質(可以包括食用油)，例如杏仁油、分級椰子油、油性脂例如甘油脂、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯(proply)，以及如果需要，可以包括常規添味劑或著色劑。
口服形式也包括常規的緩釋製劑，例如具有腸溶衣的片劑或顆粒劑。
優選實施方案的描述雖然在下列實施例中描述了本發明的某些優選實施方案，以便可以更全面理解和認識本發明的許多方面，但並不是要將本發明限制於這些特定的實施方案。相反地，它意圖包括所有，可以包括在所附權利要求書中確定的本發明範圍內的替代方案、修改方案和等同方案。因此，下面包括優選實施方案的實施例用來說明本發明的實施，應該理解，所顯示的具體的實施例是作為實例，只是為了本發明的優選實施方案的解說性討論，以及為了提供關於配製程序以及本發明原理和概念方面被認為是最有用而且容易理解的描述。
材料和方法動物12周齡的LDL-RD小鼠(C57BL/6J和129Sv品系的雜種)是通過同源重組產生的。小鼠購自Jackson實驗室(Bar-Harbor ME)。當LDL-RD小鼠服用狗食具有高膽固醇水平(與人的值相似)，並且在食用高脂肪食物後發生明顯的粥樣動脈硬化，因此使用LDL-RD小鼠。給LDL-RD小鼠或者餵食包含4.5％(重量)脂肪(0.02％膽固醇)的正常狗食，或者餵食含有1.25％膽固醇、7.5％酪蛋白和0.5％(wt/)膽酸鈉的致動脈粥樣化飲食(Harlan，Teklad Premier Laboratory Diets，Madison，WI)。將小鼠保持在12小時光/12小時黑暗的周期中，而且允許它們隨意接觸到食物和水。
LDL的分離、氧化和特性鑑定空腹12小時後將用於脂蛋白分離的血液收集到EDTA(1mg/ml)中。用Kbr-調節密度後，用50型轉子以50,000rpm/min製備性超速離心22小時，將LDL(密度＝1.019-1.063g/l)從血漿中分離出來。通過超速離心清洗LDL樣品，在pH7.4、0.15mol/L的EDTA中透析，通過Acrodisc濾膜(孔徑0.22μm)除去聚集體，然後保存於氮中，置於黑暗處。
LDL的氧化是通過將預透析的LDL(在無EDTA的PBS中的濃度為1mg蛋白/ml)與硫酸銅(10μM)一起在37℃溫育24小時來進行。通過對硫代巴比妥酸反應性物質(TBARS)的分析可以確定脂蛋白的氧化，TBARS可以通過脂肪過氧化試驗來測量丙二醛(MDA)相當物，也可以通過對脂蛋白的共軛雙烯含量的分析來確定。
抗-Ox LDL抗體效價的測定預先製備天然LDL和銅氧化的LDL的製劑。將96孔聚苯乙烯酶標板(Nunc Maxisorp，丹麥)在4℃用Ox LDL、天然LDL(在PBS中濃度為5μg/ml)或PBS包被過夜。利用含有0.05％吐溫和0.001％抑酶肽(Sigma，美國)的PBS清洗4次後，再用2％牛血清清蛋白(BSA)在室溫下封閉酶標板2小時。血清部分按1∶50稀釋到含有0.05％吐溫和0.2％BSA的PBS中。酶標板在再溫育過夜後，洗板，然後加入鹼性硝酸酶綴合的山羊抗-鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratory Inc.，美國)，按1∶10,0000稀釋到含有0.05％吐溫、0.2％BSA的PBS中，室溫下保留1小時。在徹底清洗後，加入在含有1mM MgCl2pH9.8的50mM碳酸緩衝液中濃度為1mg/ml的對硝基苯磷酸(Sigma)作為底物。30分鐘後加入1M NaOH終止反應。利用Titertek酶標儀(S.L.TLaboratory Instruments，Vienna，Austria)在405nm波長讀數，結果以405nm的OD值顯示。抗-Ox LDL抗體的效價通過從結合Ox LDL中獲得的數值減去從結合天然LDL中獲得的數值而計算出來。
進行抑制測定是為了確定抗-Ox LDL抗體的特異性，並檢查與HSP-粥樣動脈硬化中重要的免疫源的可能交叉反應性。確定達到最大結合Ox LDL一半的HSP-65免疫的小鼠血清的濃度，並應用濃度增加的不同抑制物(即HSP-65、Ox LDL、牛血清白蛋白)。
抗-HSP-65抗體的檢測通過在4℃溫育過夜將磷酸緩衝鹽溶液(PBS，pH7.2)中的重組HSP-65(1μg/ml)包被到平底96孔酶標板(Nunc Maxisorp，丹麥)上。用含0.02％吐溫的PBS(0.02％PBS Tween)洗板後，再用含1％BSA的PBS封閉，然後按不同稀釋度(1∶50、1∶100、1∶200，PBS中)加入血清，在室溫下溫育1小時。加入過氧化酶綴合的兔抗-鼠IgG(DakoLtd，HighWycombe，UK)，在室溫下溫育1小時，然後用PBS/Tween清洗4次。最後，加入含有0.53mg/ml 2，2-連氮基-二(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Sigma)的枸櫞酸鹽磷酸緩衝液(0.1M，pH4.2)100μl，30分鐘後利用Titertek酶標儀在490nm測定吸光率。
抗-磷脂抗體的檢測利用改良ELISA對抗PL的小鼠和人抗體的反應性進行測定。利用陰離子PL[心脂質(CL)、磷脂醯絲氨酸(PS)、磷脂醯肌醇(PI)]和磷脂醯膽鹼(PC)中任一種包被微量酶標板(Nunc Maxisorp，丹麥)，以上的所有試劑來自Sigma化學公司，St.Louis，Mo，濃度50μg/ml，除了PC(氯仿-甲醇，1∶3)外其餘溶解於乙醇中。酶標板在真空中乾燥並用含有0.5％明膠的TBS封閉。然後用TBS清洗酶標板三次，再將不同濃度的小鼠製品加入到用人β2GP1(5μg/ml，30分鐘)或僅僅是0.1％明膠/TBS處理的酶標板孔內。利用羊抗-鼠鹼性磷酸酶綴合物和加入底物(對硝基苯磷酸)來檢測抗體結合。結果通過405nm的吸光率(OD405)顯示。
抗-b2GP1抗體的檢測在96孔聚苯乙烯酶標板(Nunc)中4℃過夜溫育50mM碳酸氫鹽緩衝液pH9.6中的1μg/ml β2GP1或不同的DM。用TBS清洗3次後，再用0.5％明膠/TBS封閉2小時(如抗-PL ELISA一樣)。然後清洗酶標板3次，再加入鼠血清(按1∶100稀釋到明膠/TBS中)，在室溫下溫育2小時。3次清洗後，加入分別稀釋到0.1％明膠/TBS(1∶10,000)中的鹼性磷酸酶綴合的羊抗-人IgG。再清洗3次後，加入在碳酸鈉緩衝液pH9.8中的底物對硝基苯磷酸，在405nm測吸光率。
脾臟淋巴細胞的增殖測定處死時從小鼠中取出脾臟，然後分離淋巴細胞。在不同濃度的HSP-65、OxLDL、β2GP1或卵清蛋白存在下在微量酶標板中，在0.2ml培養基中培養三份平行的1×106個細胞/ml 72小時。通過在培養的最後12個小時內在DNA中[3H]胸腺嘧啶的摻入來測定淋巴細胞的增殖。結果通過刺激指數(S.I.)計算出來抗原平均cpm與缺乏抗原時獲得的平均背景cpm之比。
細胞因子水平的檢測小鼠處死後取出脾臟細胞，利用Ox LDL、HSP-65或卵清蛋白培養脾細胞3天，然後收集上清。檢測在脾細胞培養上清中細胞因子分布型(IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β)。
實施例實施例1在這個實驗中用到的小鼠被稱為LDL-受體缺陷(LDL-RD)小鼠。這些動物具有導致全身細胞中LDL受體缺陷的遺傳突變。該受體負責從循環中排洩和清除「有害的」膽固醇(LDL)，當該受體缺乏時，若給小鼠餵食3-5周的高脂肪食物，小鼠會患有高血脂症，並發生粥樣動脈硬化。
使用3組小鼠(每組15隻LDL-RD小鼠)。通過一個特殊的裝置(導管)進行餵食，所述裝置設計成將食物導入小鼠的食道，以確保食物基本上全部到達胃部。
第1組隔天給小鼠餵食5劑溶於PBS的1mg人Ox LDL。在最後一劑量結束時，給小鼠餵食高脂肪食物並在餵食3周或5周後處死。
第2組給小鼠餵食5劑溶於PBS的1mg對照蛋白(卵清蛋白)，然後給小鼠餵食所述特殊食物3周或5周。
第3組在開始所述飲食之前，不給小鼠餵食任何東西。
處死小鼠時評估小鼠粥樣動脈硬化損傷的存在、血清膽固醇數值以及Ox LDL抗體水平。
結果在本研究之前及結束時所有的小鼠都具有相似的重量。我們發現餵食Ox LDL的小鼠產生的粥樣動脈硬化要少(減少30％)。
在本研究中，已經顯示出在小鼠中用Ox LDL的口服耐受對誘發粥樣動脈硬化的有益作用。有許多結果指出口服耐受在各種自身免疫疾病中的效果的研究，例如膠原蛋白在佐劑性關節炎(類似於類風溼性關節炎)中的作用、在糖尿病中的作用、在眼色素層炎中的作用、在EAE(類似於多發性硬化症)中的作用。在以上提到的研究中已經進行了人體實驗。最近在給患有風溼性關節炎的病人通過口服給予膠原蛋白II(口服耐受)時，注意到了一個顯著的功效。在對各種自身免疫疾病的小鼠研究和人體研究之間具有相類似的功效，表明外推至人類可獲得成功。應該強調的是這種治療沒有任何副作用。
實施例2在LDL-受體缺陷小鼠中通過餵食人Ox LDL抑制高脂肪食物誘發的粥樣動脈硬化給LDL-RD小鼠(n＝15)餵食5個劑量(隔天)的3種不同濃度(1mg/劑量、100μg/劑量和1mg/劑量)的人Ox LDL。給另外的LDL-RD小鼠(每組n＝15)餵食對照抗原(相似劑量的卵清蛋白)。
在最後一次餵食的第2天，所有小鼠用高脂肪食物(「paigen」)攻擊5周。
在實驗的最後，檢測所有小鼠的血清中抗-OxLDL抗體、抗-HSP65抗體和抗磷脂抗體是否存在，並進行脂質分布型的檢測(總膽固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
在研究的最後取出所有小鼠的心臟，使用前冷凍於-70℃(見「材料與方法」)。利用抗CD3、CD4、CD8的單克隆抗體、巨噬細胞、平滑肌細胞和淋巴細胞活化標記進行在恆冷箱切片上進行免疫組織化學研究。
利用Ox LDL的活性衍生物-LPC進行相似的餵食方案。
實施例3通過餵食HSP-65抑制結核分枝桿菌引起的粥樣動脈硬化本發明人已經發現，用MT免疫一次的LDL-RD小鼠產生增強的早期粥樣動脈硬化。
給LDL-RD小鼠(n＝15)餵食5個劑量(隔天)的3種不同濃度(1mg/劑量、100μg/劑量和1μg/劑量)的重組HSP65。給另外的LDL-RD小鼠(每組n＝15)餵食對照抗原(相似劑量的卵清蛋白)。
在最後餵食的第2天，所有的小鼠經過用在完全弗氏佐劑中乳化的MT熱滅活懸浮液(10mg/ml、100μg/只)免疫來進行攻擊。小鼠在用MT免疫後12周處死。
在實驗的最後，檢測所有小鼠的血清中抗-HSP65抗體是否存在，並進行脂質分布型的檢測(總膽固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
評估來自HSP-65耐受小鼠和餵食對照物小鼠的引流(draining)淋巴結細胞對HSP的增殖應答。
評估在從培養基收集的上清液中細胞因子(IL-4、IFN-γ、IL-10和TGF-β)的水平，在所述培養基中用HSP65體外誘發淋巴細胞。
從所有小鼠中取出心臟，於-70℃冷凍。為了確定粥樣動脈硬化的程度，進行恆冷箱切片(每個切片5μm厚)。有關切片(來自主動脈竇區域)利用油紅O染色，通過計算用方格網統計的區域就可確定粥樣動脈硬化的程度。
利用抗CD3、CD4、CD8的單克隆抗體、巨噬細胞、平滑肌細胞和淋巴細胞活化標記進行關於恆冷箱切片的免疫組織化學研究。
實施例4通過餵食人b2GP1抑制粥樣動脈硬化實驗程序與用於Ox LDL和HSP65的程序相類似，而且基於用β2GP1免疫誘發早期粥樣動脈硬化的觀察。
粥樣動脈硬化程度的評估通過計算主動脈竇內粥樣動脈硬化脂肪紋損傷的大小(作一定的修正)，可以定量測定定所述損傷。簡而言之，從動物中取出心臟和主動脈的上段切片，細心剝離外周的脂肪。上段切片包埋在OCT培養基中並冷凍。取整個主動脈竇(400μm)的每隔一個切片(10μm厚)進行分析。通過作為動脈與心臟連接點的3個瓣前尖來識別主動脈竇的遠側部。在用油紅O染色後評估切片的脂肪紋損傷。一個不熟悉檢測標本的觀察者利用網格來統計每個切片的損傷。
在主動脈竇的水平來評估粥樣動脈硬化程度。將組織進行加工和染色。通過Rubin EM、Kraus RM、Spanler EA等的修正方法(在轉基因小鼠中人載脂蛋白AI抑制早期粥樣動脈硬化.Nature 1991；353265-267頁)來定量測定損傷區域。
粥樣動脈硬化損傷的免疫組織化學mAbs大鼠單克隆抗體H129.19(L3T4)-抗-小鼠CD4+和S3-6.7(Ly-2)-抗-小鼠CD8a得自PharMingen(San Diego，CA，USA)；MCA497(F4/80)-抗-小鼠巨噬細胞得自Serotec(Oxford，UK)。
在主動脈竇5μm厚的冷凍切片中對CD4、CD8和巨噬細胞進行免疫組化染色。切片在甲醇中-20℃固定4分鐘，接著用乙醇在-20℃溫育10分鐘。然後用非免疫山羊血清在室溫下封閉切片15分鐘，接著用CAS封閉劑在室溫下溫育30分鐘。隨後，加入抗-小鼠CD4/CD8的大鼠-單克隆抗體1小時。清洗後，在室溫下加入親和純化生物素基化的兔抗-大鼠IgG抗體30分鐘。清洗後，用0.3％H2O2溫育玻片，接著再進行清洗，然後在室溫下用鏈黴抗生物素蛋白-過氧化酶綴合物溫育30分鐘。清洗後，用3-氨基-9-乙基carbonasole(AEC)底物(Dako)對玻片進行顯色15分鐘。切片用蘇木精復染。脾臟切片作為陽性對照。在缺乏第1或第2抗體的情況下染色作為陰性對照。
過繼轉移實驗在每一個研究中都從耐受小鼠和非耐受小鼠中分離T-細胞(CD4或CD8細胞)，並把它們轉移到將用致動脈粥樣化食物攻擊6周的LDL-RD同窩小鼠中。在實驗的結束時取出心臟用於評估粥樣動脈硬化和進行免疫組化分析。
對於本領域技術人員來說，顯然本發明並非限制於前面的說明性實施例的細節，而且在沒有違背本發明必要的特徵的情況下，本發明可以體現為其他特定形式，因此，本發明的實施方案和實施例在所有方面都應該被要求認為是例證性的而不是限制性的，並且參考所附的權利要求書，而不是前面的描述，因此包括在所述權利要求書等同物的含義和範圍之內的所有變化，都將包括在本發明中。
權利要求
1.用於預防和/或治療選自心臟病發作、血管成形術-再狹窄和中風的疾病的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其含有治療有效量的選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、熱休克蛋白60/65、β2-糖蛋白-1、其功能性衍生物和混合物的活性組分，該活性組分與藥學上可接受的載體結合以便於口服給藥。
2.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是心臟病發作。
3.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是血管成形術-再狹窄。
4.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是中風。
5.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白。
6.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白。
7.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白的功能性衍生物。
8.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65。
9.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65的功能性衍生物。
10.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是β2-糖蛋白-1。
11.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是β2-糖蛋白-1的功能性衍生物。
12.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述修飾的低密度脂蛋白是溶血磷脂醯膽鹼。
13.權利要求1的誘導免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述修飾的低密度脂蛋白是丙二醛LDL。
全文摘要
公開了用於預防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結合一種口服用藥學上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP 60/65)、β
文檔編號A61K38/17GK1616085SQ200410011940
公開日2005年5月18日 申請日期1999年9月30日 優先權日1998年10月4日
發明者耶胡達·索恩菲爾德, 德羅爾·哈拉特斯, J·喬治 申請人:脈管生物生長有限公司