一種親水性磁性介孔矽材料的合成方法及其應用與流程

2023-05-06 04:10:51 1

本發明屬於先進納米介孔吸附劑材料與納米
技術領域：
，具體涉及一種親水性磁性介孔矽材料的合成方法及其應用，尤其涉及一種用於糖蛋白質組學分離富集與MALDI-TOFMS檢測的親水性的磁性介孔矽材料的合成方法及其應用。
背景技術：
：在哺乳動物中，糖基化是最普遍和最重要的蛋白質翻譯後修飾之一。由於其在調節眾多生物過程中扮演著重要角色，所以已被廣泛關注和研究。糖組成、種類以及結構等方面的變化與很多疾病尤其是癌症的發生發展密切相關。為了洞悉糖基化與疾病之間的具體關係，鑑定出糖基化位點上的更多結構信息、相應的糖鏈的結構信息以及相關的肽段信息顯得非常重要。但是由於實際樣品中通常存在大量的非糖基化肽段，加之糖基化肽段自身存在豐度低以及離子化效率低等特點，基於質譜的糖基化肽段分析策略遭遇巨大挑戰。解決這一難題的有效辦法就是對實際樣品進行純化，以增加樣品中糖基化肽段的豐度。近年來，科學家做出巨大努力，發展了不同的技術用於糖基化肽段的分離富集，其中利用親水相互作用是一重要策略。親水相互作用與質譜相結合展現出很多的優勢，比如說重複性好，富集性能高，而且此方法對於不同糖型肽段的富集展現同樣的優異富集性能。目前已有不同的生物兼容納米材料被選為載體負載親水性功能基團用於糖基化肽段的富集，例如金矽球以及磁性粒子等等。但是這些材料通常比表面積較小，限制了功能基團的修飾，從而制約了對於糖基化肽段分離富集的應用。介孔材料具有比表面積大、孔道大小均一以及孔道內壁可修飾等特性，在眾多領域如存儲、催化、載藥以及分離純化方面展現出巨大的應用前景。本發明首次合成具有強磁響應性的親水性磁性介孔矽材料並應用於糖基化肽段的富集。在外加磁場的作用下，捕獲了糖基化肽段的親水性磁性介孔矽材料可以方便快速地從複雜樣品溶液中分離開來，使整個分離富集、清洗以及洗脫過程所需時間大大縮短。同時，親水性磁性介孔矽材料對目標糖基化肽段具有很強的親和能力，複雜樣品中的糖基化肽段經過親水性磁性介孔矽材料的富集之後，其質譜信號強度顯著增加。而介孔層的存在使材料具有不錯的體積排阻能力，當目標糖基化肽段與蛋白質質量比達到1：200時，仍然展現出優異的糖基化肽段富集性能。技術實現要素：本發明目的在於提供一種親水性磁性介孔矽材料的合成方法及其在糖基化肽段分離富集以及MALDI-TOFMS檢測中的應用。本發明提供的一種親水性磁性介孔矽材料的合成方法，具體步驟如下：（1）將六水合三氯化鐵置於乙二醇中磁力攪拌，至溶液澄清透明後加入醋酸鈉，再經充分攪拌後轉移至水熱反應釜中，100-500℃下加熱10-18小時，待反應釜冷卻至室溫後，用去離子水和乙醇充分洗滌所得產物，於30-80℃下真空乾燥得到磁球；（2）將步驟（1）中所得磁球與表面活性劑均勻分散於溶劑中，加入矽源，將所得混合溶液在10-80℃攪拌反應8-12小時；（3）將步驟（2）中所得產物在空氣中100-450℃下煅燒1-9小時，得到磁性介孔矽材料；（4）將亞氨基二乙酸溶於碳酸鈉溶液中，調節溶液pH為9-11，置於冰浴中攪拌10-60分鐘；（5）滴加γ-(2,3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基矽烷於步驟（4）所得的溶液中後攪拌10-60分鐘，升溫至50-95℃繼續攪拌2-10小時；（6）將步驟（5）所得溶液置於冰浴中10-60分鐘後滴加γ-(2,3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基矽烷並攪拌10-60分鐘，升溫至50-95℃繼續攪拌2-10小時；（7）待步驟（6）所得溶液冷卻至室溫後調節溶液pH為5-7，置於冰箱備用；（8）將步驟（3）中所得的磁性介孔材料分散於步驟（7）所得的溶液中，超聲分散均勻後，在65-100℃下攪拌反應1-8小時，所得產物水洗後於30-80℃下真空乾燥，即得所述親水性磁性介孔矽材料。本發明中，步驟（2）中的表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基苯磺酸鈉或硬脂酸中的一種或幾種。本發明中，步驟（2）中的溶劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基苯磺酸鈉或硬脂酸中的一種或幾種。本發明中，步驟（2）中的矽源為正矽酸乙酯的乙醇溶液，其中正矽酸乙酯與乙醇的體積比為1：4。本發明中，步驟（2）中磁球與表面活性劑的質量比為：1：9-1：12。本發明中，步驟（4）中調節溶液pH值為10。本發明中，步驟（7）中調節pH值為6。本發明得到的親水性磁性介孔矽材料在糖基化蛋白質組學分離富集中的應用，將親水性磁性介孔矽材料配置成分散液，將該分散液和目標糖基化肽段溶液加入含有體積比80%-100%乙腈和體積比0.1-3%三氟乙酸的緩衝溶液中，37℃下孵育，含體積比50-95%乙腈和體積比0.1-5%的磷酸的緩衝液作為材料清洗液，體積比0.1-65%乙腈作為洗脫液，點樣和基質於MALDI-TOFMS靶板上自然乾燥後進行質譜分析。本發明的有益效果在於：合成的具有介孔結構、親水基團修飾的磁性介孔矽材料，其介孔為柱型孔道，孔徑約為2.54nm，比表面積約為197.60m2/g。具有良好磁響應性和親水性，介孔大小以及功能基團易於控制，其大比表面積與數量眾多、排列緊密的介孔結構有益於目標糖基化肽段的捕獲，同時排阻大體積蛋白質在孔道外。此材料無生物毒性，對糖基化肽段具有很強的捕集能力，可作為分離富集糖基化肽段的固相吸附劑。結合大比表面積、介孔孔道以及內壁修飾的大量親水性功能化基團，該材料對目標糖基化肽段展現了優異富集性能，富集靈敏度以及體積排阻能力。其合成方法簡單低耗，在糖基化肽段分離富集以及MALDI-TOFMS檢測分析中具有高靈敏度、高信噪比放大倍數和適合用於複雜生物樣品分離分析等特點。附圖說明圖1為實施例1的親水性磁性介孔矽材料的透射電子顯微鏡照片；圖2為實施例1的親水性磁性介孔矽材料的掃描電子顯微鏡照片；圖3為實施例1的親水性磁性介孔矽材料的氮氣吸附等溫線以及孔徑分布圖；圖4為實施例1的親水性磁性介孔矽材料的元素分析圖；圖5為實施例2的親水性磁性介孔矽材料富集HRP酶解液中糖基化肽段富集條件優化圖，其中圖A為在80%乙腈與3%三氟乙酸溶液條件下富集得到的糖基化肽段的質譜圖，圖B為在89%乙腈與3%三氟乙酸溶液條件下富集得到的糖基化肽段的質譜圖，圖C為在95%乙腈與3%三氟乙酸溶液條件下富集得到的糖基化肽段的質譜圖。圖6為實施例3的親水性磁性介孔矽材料排阻大分子蛋白並富集HRP酶解液中糖基化肽段的質譜圖；圖A為HRP與BSA摩爾比1:0時富集得到的糖基化肽段的質譜圖，圖B為HRP與BSA摩爾比1:100時富集得到的糖基化肽段的質譜圖，圖C為HRP與BSA摩爾比1:200時富集得到的糖基化肽段的質譜圖。圖7為實施例4的親水性磁性介孔矽材料富集具另一糖型的IgG酶解液中糖基化肽段的質譜圖。圖A為未經富集的IgG糖基化肽段的質譜圖，圖B為本材料富集後IgG糖基化肽段的質譜圖。具體實施方式下面的實施例是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的範圍。實施例1：一種親水性磁性介孔矽材料的合成（1）將1.35gFeCl3·6H2O分散於75mL乙二醇中磁力攪拌，待溶液至澄清後，加入3.6gNaAc，再經充分攪拌後轉移至水熱反應釜中，200℃下加熱16小時，待反應釜冷卻至室溫後，用去離子水和乙醇充分洗滌所得產物，於50℃下真空乾燥；（2）將（1）中所得產物磁球50mg與表面活性劑CTAB500mg超聲分散於50ml去離子水中，加入400mL去離子水以及50mLNaOH（0.01M），將所得混合溶液在60℃反應30min後加入2.5mL正矽酸乙酯/乙醇（v/v,1:4）,60℃過夜攪拌反應；（3）將（2）中所得產物在空氣中350℃下煅燒4h，得到磁性介孔矽材料；（4）將2.5g亞氨基二乙酸溶於50mL（2M）碳酸鈉溶液中，NaOH調節溶液pH為10，置於冰浴中攪拌10min；（5）滴加1.6mLγ-(2,3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基矽烷（GLYMO）於（4）中後繼續攪拌30min；（6）將（5）中溶液反應溫度升至65℃繼續攪拌6h；（7）將（6）中反應液再次置於冰浴中10min後再次滴加與（5）中1.6mLGLYMO並攪拌30min；（8）將（7）中反應溫度再次升至65℃繼續攪拌6h；（9）待（8）中反應液冷卻至室溫後Hcl調節溶液pH為6，置於冰箱備用；（10）將（3）中所得產物50mg分散於（9）中所得溶液中，超聲分散均勻後，在95℃下攪拌反應2h，所得產物水洗後於50℃下真空乾燥。將製得的親水性磁性介孔矽材料用透射電子顯微鏡檢測，檢測條件是：200kV工作電壓下，將乾燥的材料取少量均勻分散在無水乙醇中並用混合液將微柵網浸潤，乾燥後插入儀器抽真空，在100納米比例尺下投射電子顯微鏡觀察，檢測結果如圖1所示。將製得的親水性磁性介孔矽材料用掃描電子顯微鏡檢測，檢測條件是：20kV工作電壓下，將乾燥的材料取少量黏貼在絕緣膠帶上，經噴金、抽真空後，8微米比例尺下掃描電子顯微鏡觀察，檢測結果如圖2所示。圖3為親水性磁性介孔矽材料的氮氣吸附等溫線以及孔徑分布圖；圖4為的親水性磁性介孔矽材料的元素分析圖；元素原子百分比質量百分比O51.035.4Fe17.843.2Si5.87.1N13.68.3C11.76.1實施例2：將實施例1得到的親水性磁性介孔矽材料作為固相吸附劑用於HRP酶解液中糖基化肽段的分離富集時的富集條件優化。（1）試樣的製備：HRP在50mMNH4HCO3溶液中37℃酶解16h。（2）200μg親水性磁性介孔矽材料分散在100μL含有1pmol/μL步驟（1）的糖基化肽段的不同富集緩衝液中，ACN/H2O/TFA(80/17/3,v/v/v),ACN/H2O/TFA(89/8/3,v/v/v)和ACN/H2O/TFA(95/2/3,v/v/v)。37℃孵育20min。用200μL清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5,v/v/v）衝洗樣品三次。用6μL50%ACN洗脫30min。（3）質譜分析：取1μL步驟（2）中洗脫液點靶，進行質譜分析，質譜圖如圖5所示。對比圖5中的不同質譜圖，選擇ACN/H2O/TFA(89/8/3,v/v/v)作為富集緩衝液。實施例3：將實施例1得到的親水性磁性介孔矽材料作為固相吸附劑用於糖基化肽段的分離富集時對大分子蛋白的體積排阻能力。（1）試樣的製備：HRP在50mMNH4HCO3溶液中37℃酶解16h。配製HRP酶解液與BSA蛋白質量比分別為1：100以及1：200的混合溶液。（2）200μg親水性磁性介孔矽材料加入步驟（1）配製的不同混合溶液中。37℃孵育20min。用200μL清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5,v/v/v）衝洗樣品三次。用6μL50%CAN洗脫30min。（3）質譜分析：取1μL步驟（2）中洗脫液點靶，進行質譜分析，質譜圖如圖6所示。對比質譜圖，選擇ACN/H2O/TFA(89/8/3,v/v/v)作為富集緩衝液。對比圖6中的質譜圖，可以發現隨著HRP酶解液與BSA蛋白比例的增大，親水性磁性介孔矽材料分離富集糖基化肽段後的質譜圖中，糖基化肽段的條數以及信號強度持穩定狀態，說明親水性磁性介孔矽材料具有從混有大分子蛋白的混合液中捕獲糖基化肽段的能力實施例4：將實施例1得到的親水性磁性介孔矽材料作為固相吸附劑用於IgG酶解液中糖基化肽段的分離富集時的富集條件優化。（1）試樣的製備：IgG在50mMNH4HCO3溶液中37℃酶解16h。（2）200μg親水性磁性介孔矽材料分散在100μL含有1pmol/μL步驟（1）的糖基化肽段的ACN/H2O/TFA(89/8/3,v/v/v)緩衝溶液中。37℃孵育20min。用200μL清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5,v/v/v）衝洗樣品三次。用6μL50%ACN洗脫30min。（3）質譜分析：取1μL步驟（2）中洗脫液點靶，進行質譜分析，質譜圖如圖7所示。HRP與IgG具有不同的糖型，如圖7所示，親水性磁性介孔矽材料對IgG酶解液中糖基化肽段也展現出優異的富集性能，說明材料對於不同糖型的糖基化肽段均具有富集性能。實施例5：將實施例1得到的親水性磁性介孔矽材料作為固相吸附劑用於人血清酶解液中糖基化肽段的分離富集。（1）試樣的製備：2μL人血清和16μL25mMNH4HCO3溶液混合後在12000rpm下離心2min，所獲得的上清液經DTT在37℃下還原30min，再經IAA在37℃下烷基化1h。然後加入69μL25mMNH4HCO3和trypsin，酶解16h。凍幹備用。（2）步驟（1）中凍幹血清重溶在200μLACN/H2O/TFA(90/8/2,v/v/v)中，加入400μg親水性磁性介孔矽材料。37℃下孵育30min。用200μL清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5,v/v/v）衝洗樣品三次。用30μL50%ACN洗脫2次。（3）將500unitsPNGaseF酶和60μLNH4HCO3於步驟（2）中所得混合洗脫液中,37℃下孵育16h。凍幹後重溶於5%ACN/0.1%TFA中，用於LC-MS/MS分析。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp