在胞內環境中表現出增強的穩定性的免疫球蛋白構架及其鑑定方法

2023-05-06 23:19:11

在胞內環境中表現出增強的穩定性的免疫球蛋白構架及其鑑定方法【專利摘要】本發明提供了組合物，其可作為用於創建極為穩定且可溶的單鏈Fv抗體片段的構架。這些構架經胞內性能選擇，因而可理想地適用於創建scFv抗體片段或scFv抗體文庫，以用於其中穩定性和可溶性為抗體片段性能的限制因素的應用，例如在細胞的還原環境中。此類構架也可用於鑑定表現出增強的可溶性和穩定性的高度保守殘基及共有序列。【專利說明】在胞內環境中表現出增強的穩定性的免疫球蛋白構架及其鑑定方法[0001]本申請是分案申請，其直接母案申請是申請號為201010575786.1、申請日為2003年5月21日的同名發明專利申請；其原始母案申請是申請號為03814626.6、申請日為2003年5月21日的同名發明專利申請。發明領域[0002]本發明涉及蛋白質化學、分子生物學以及免疫學。[0003]相關【
技術領域：
】背景[0004]抗體能以高度的特異性和親和力識別並靶向幾乎任何分子。這個特點已被開發，以便將這些天然蛋白轉變為用於診斷和治療應用的強有力的工具。重組DNA技術的進展已推動了抗體基因在廣泛種類的非淋巴細胞中的操作、克隆和表達(Skerra,1988;Martineau，1998;Verma，1998)。已經構建了許多不同的抗體片段，以便最佳地滿足各種應用。保留整個母體免疫球蛋白全部抗原結合能力的最小實體是單鏈Fv片段(scFv)(Bird,1988)。該抗體片段包含由柔性肽接頭連接起來的重鏈和輕鏈可變區，這使得該蛋白能夠由單個基因表達。[0005]抗體片段較之於完整免疫球蛋白分子具有若干重要的優勢。由於分子小，它們在多種表達宿主細胞如大腸桿菌細胞中的表達得以易化、且產量得以提高(Pliickthun,1996)。而且,抗體片段允許在體內應用中改善腫瘤穿透力(Yokota,1992),並且它們能夠與多種用於治療途徑的效應分子共價連接。[0006]天然存在的抗體是由漿細胞分泌的，已進化至能夠在胞外氧化環境中行使功能。為獲得其功能性摺疊結構，它們通常需要在不同結構域內形成二硫鍵，這對於免疫球蛋白摺疊是至關重要的。與全長抗體形成對照，scFv或Fab抗體片段原則上能夠在任何細胞內部的還原環境中功能性地表達，並定向到任何區室，以靶向胞內蛋白，從而引發特定的生物學效應(Biocca,1991)。的確`,有些稱之為內體(intrabodies)的胞內單鏈抗體片段，已被成功地用於調節不同的生物系統中胞內靶蛋白的功能。從而，針對病毒侵染的抗性已在植物生物技術中得到展示(Tavladoraki,1993;Benvenuto,1995),內體與HIV蛋白的結合業已證明(Rondon,1997),並且與癌基因產物的結合(Biocca,1993;Cochet,1998;Lener,2000)也已有描述。而且胞內抗體在表徵目前通過人類基因組測序鑑定到的大量基因的功能方面有希望成為有價值的工具(Richardson,1995;Marasco,1997)。例如，它們可在功能基因組途徑中用於封閉或調節新近鑑定的蛋白的活性，由此促成對其功能的了解。最後，內體具有診斷和治療應用的潛力，例如在基因治療環境中。[0007]儘管存在極大的前景，功能性內體的產生仍然受限於其不穩定性和不可溶性或者聚集的傾向。胞漿的還原環境防止形成保守的鏈內二硫橋，從而使得高百分比的抗體片段不穩定，因此在細胞內無功能(Biocca,1995;Proba,1997)。抗體片段的穩定性和可溶性因此構成了內體在體內作為潛在的蛋白功能調解劑的應用的主要障礙。迄今為止，尚不可預言使得抗體片段在胞內環境中具備功能的序列要求。[0008]因此，急需在廣範圍的不同細胞類型中性能良好的抗體片段，從而可作為用於多種結合特異性的構架。此類構架可用於構建用於胞內篩選的文庫，或者可作為既有抗體結合部分的受體。[0009]除了獨特地滿足胞內應用之外，在眾多的胞外和體外應用中，基於極為穩定的可變結構域構架的此類抗體片段或完整抗體相比於其它抗體也具有獨特的優勢。當此類構架在氧化環境中產生時，其二硫橋能夠形成，進一步增強其穩定性，並使得它們高度抵抗聚集和蛋白酶降解。體內半衰期(及針對聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了親和力和特異性之外的、使抗體在治療或診斷應用中成功的唯一最為重要的因素(Willuda，1999)。抗體片段的半衰期可通過共價連接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而進一步得以提高(Weir,2002)。這類穩定分子代表了抗體應用的顯著進步，尤其但並不僅當不期望Fc功能時。[0010]抗體片段文庫極大的實踐重要性激發了該領域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗體可變區基因的初始克隆和表達。由這些基因出發，他建立了在互補決定區(CDR)以及構架區具有高度多樣性的巨大抗體文庫。不過，Winter未披露不同構架用於文庫構建的用途。[0011]另一方面，Pliickthun(EP0859841)教導試圖通過將構架限於有限數目的合成共有序列而改進文庫設計。包括引入大量合理設計的突變的蛋白質工程的努力以前就提示針對相應共有序列的突變是提高分離的可變免疫球蛋白結構域穩定性的合適手段(Ohage1999;Ohage1999以及US5，854，027，特此併入作為參考)。[0012]Pliickthun(EP0859841)公開了基於這些共有序列進一步優化結合親和力的方法。Pliickthun專利也承認正在發生著的有關抗體的知識的增長，因此意欲包括此類文庫設計的遠景發現。然而，未建議合成共有構架可能的進一步改善。[0013]因而Winter、Pliickthun及他人(如Soderlind,WO0175091)的教導試圖以CDR·的高度多樣性為焦點建立巨大的抗體文庫，用於選擇並在氧化條件下應用所選scFv。然而，所有這些文庫未進行胞內應用優化，因而不能用於還原環境或對所表達的抗體片段的穩定性和可溶性提出特殊要求的其它條件下的選擇和應用。[0014]抗體片段在還原環境如原核和真核細胞的胞漿中表現良好所需的性質尚不清楚。因此胞內抗體或「內體」的應用目前受限於其在還原條件下(可影響其穩定性和可溶性能)不可預測的行為(Biocca,1995;Worn,2000)。現有專利申請(EP1040201、EP1166121和W00200729)及出版物(Visintin，1999)涉及以篩選技術為焦點的內體的胞內篩選，但是未公開在真核細胞特別是酵母中有功能、從而可用於本上下文的文庫構建的具體抗體序列。[0015]Visintin和Tse獨立地描述了所謂的胞內共有序列(ICS)的分離(Visintin，2002;Tse，2002)。該序列來自於已從酵母抗原-抗體相互作用篩選中分離出的許多序列。然而，由於現有噬菌體展示選擇，胞內篩選的輸入是有嚴重偏差的。因而，在Visintin等的例子中，只有一個輸入序列屬於VH3亞群。公開的共有序列ICS與由Knappik(2000)和EP0859841描述的人類VH3亞群的共有序列完全相同。ICS的62個胺基酸中的60個也與由Steipe以構建具有增強的穩定性的可變結構域為基礎而提出的一般人類VH-結構域共有序列相同(美國專利號N0.6，262，238，特此併入作為參考)。這些工作依次建立在早期的序列收集(即Kabat,1991)和可變結構域亞群及結構決定簇的定義(Tomlinson,1992;Williams,1996;Chothia,1989和Chothia,1987)的基礎上。然而，由於所述內體選擇的輸入是有嚴重偏差的(即在Visintin等例子中，只有一個VH結構域為VH3)，由胞內篩選分離VH3序列並不是特別令人驚訝。由於其輸入文庫的嚴重偏差，Tse等和Visintin等的工作未能提供對人類可變結構域所有組成部分的全面評價，而這將會由無偏差的查詢提供，並且這是鑑定存在於人類所有組成部分中的有用內體構架所必需的。[0016]我們以前曾描述過不依賴於其抗體-結合特異性而允許在酵母中選擇穩定且可溶的內體的系統(AufderMaur(2001),WOO148017)。這個途徑允許有效地篩選scFv文庫和分離特定構架，它們在酵母細胞的還原環境中是穩定且可溶的。目的仍然是實際分離構架序列，並且使用的模式是，第一步中預測何種序列類型將會在還原環境中最穩定，而第二步中通過分析、重組以及進一步的體內和體外實驗鑑定最佳序列。[0017]發明的簡要概述[0018]本發明填補了抗體產生領域缺失的環節。它提供了就穩定性和可溶性而言具有優異特性的抗體可變結構域構架序列。這些對許多相關應用，例如在診斷、治療或研究中是關鍵特點。這些構架可用於移植既有的結合特異性或者用於產生具有高穩定性和可溶性的抗體文庫。[0019]ScFv文庫被用來分離在酵母細胞的還原環境中穩定且可溶的構架。分離構架的性能隨後在人類細胞系和體外實驗中表徵。所述構架可直接作為既有結合特異性的受體主鏈，或者通過一個或多個高變環的隨機化構建CDR文庫用於還原或其它挑戰性的環境。分離的可變結構域序列進一步通過對比進行分析，以鑑定優選的序列家族。從那些優選的可變結構域序列家族中，根據結構分析選擇最佳序列，該結構分析可排除含幹擾免疫球蛋白摺疊的構架殘基的序列。鑑定的可變結構域序列候選物隨後以所有可能的變化重組，並通過分析其在酵母、哺乳動物細胞和體外的性能挑選最佳的輕鏈和重鏈可變結構域組合。[0020]這些優化的scFv及組成它們的可變結構域構架，以及其它抗體片段或由其衍生的全抗體，舉例來說，可理想地作為既有結合特異性的受體主鏈，或通過一個或多個高變環的隨機化構建CDR文庫用於還原或其它挑戰性的環境。適於胞內應用的抗體從定義上來講更為穩定且可溶。從而，它們在胞內環境外界的應用中的用途也將具有優勢。[0021]本發明提供了包括抗體可變結構域構架和單鏈Fv抗體(ScFv)片段的組合物，其可摻入到多種抗體片段或全抗體中。提供了最穩定且可溶種類的抗體可變結構域片段，因而最適於胞內應用。也提供了在胞內測定中表現出最高性能的抗體可變結構域和scFv抗體片段的具體構架序列。本發明也提供了抗體可變結構域和scFv片段中輕鏈和重鏈可變結構域的人造組合的具體構架序列，舉例來說，它們可最理想地用於胞內應用，並且就穩定性和可溶性而言在體外表現出最佳性能。[0022]本發明提供具有如下通式結構的單鏈構架試劑:[0023]NH2-VL-接頭-VH-COOH或[0024]NH2-VH-接頭-VL-C00H。[0025]在本發明的另一個實施方案中，所述單鏈構架可融合於第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體:[0026]NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-C00H[0027]NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH[0028]這些融合構建體中VH和VL區的取向可以顛倒。[0029]在本發明的另一個實施方案中，可變結構域可摻入到Fab片段中，其可融合於第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體:[0030]NH2-VH-CH-第二蛋白-C00H及NH2-VL-CL-C00H[0031]第二蛋白可融合於重鏈或輕鏈的N-端或C-端。[0032]在優選的實施方案中，單鏈或Fab構架融合構建體的第二蛋白是直接或通過轉錄激活為胞內測定提供讀出的蛋白。[0033]本發明的另一個目的是提供抗體可變結構域的構架類型以及可變結構域和scFv序列，舉例來說，它們適於從既有抗體上移植高變環，以便獲得在還原或者其它挑戰性環境中具有功能的抗體。[0034]本發明的另一個目的是提供抗體可變結構域的構架類型以及可變結構域和scFv序列，舉例來說，通過隨機化此類構架的一個或多個高變環，它們適於建立文庫用在還原或者其它挑戰性環境中。[0035]本發明的另一個目的是所公開的序列在鑑定保守殘基和共有序列中的應用。[0036]因利用所公開的構架而得的抗體或抗體片段可用作靶確認以及人類、動物和植物疾病的治療、預防和診斷中的試劑。所述抗體可以蛋白或編碼該蛋白的DNA的形式應用，而且不限於胞內應用。[0037]附圖簡述[0038]圖1顯示了在啤酒糖酵母中進行質控篩選後的胞內性能。圖1顯示了通過IacZ表達的激活而測定的典型的酵母中`的「質控」篩選(例如參見實施例1)。在若干不同的篩選中鑑定到所選的陽性菌落(黑色)，並且陽性菌落的相應序列可見於圖12和13。所選序列與陽性對照極為穩定的λ-移植物(深灰)進行了比較。[0039]圖2顯示了在哺乳動物Hela細胞系中所選構架的胞內性能。圖2顯示了通過與極為穩定的λ-移植物(深灰)相比的由螢光素酶表達的激活而測定的由典型的酵母「質控」篩選分離的構架(黑色)在人類細胞系Hela中的性能。陽性對照Gal4-VP16(白色)給出了該系統最大可能的轉錄激活水平。螢光素酶活性已就轉染效率進行了校正。[0040]圖3顯示了在啤酒糖酵母中新構架的胞內性能。圖3顯示了在酵母中通過IacZ表達的激活而測定的優良構架組合的體內性能。構架序列(黑色)與陽性對照(極為穩定的λ-移植物(深灰))進行了比較。構架的編號如圖16所述。[0041]圖4顯示了新構架在Hela細胞系中的胞內性能。圖4顯示了在人類細胞系Hela中通過螢光素酶表達的激活而測定的優良構架組合的體內性能，並通過與極為穩定的λ-移植物(深灰)的比較進行圖解說明。陽性對照Gal4-VP16(白色)給出了該系統最大可能的轉錄激活水平。螢光素酶活性已就轉染效率進行了校正。[0042]圖5顯示了在啤酒糖酵母的細胞質中可溶性表達產物。圖5顯示了通過酵母菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)JPY9胞眾中產生的可溶蛋白的量測定的優良構架組合的體內性倉泛。[0043]圖6顯示了在E.coli中的表達行為。圖6顯示了所選構架組合在大腸桿菌(E.coli)周質中的表達行為。箭頭標示對應於這些scFv構架的條帶位置。[0044]圖7顯示了所選構架在不同哺乳動物細胞系中的胞內性能。圖7顯示了在三種人類細胞系(Hela(黑色)、Saos-2(深灰)及HEK293(白色))中通過螢光素酶表達的激活而測定的所選優良構架組合的體內性能，並通過與極為穩定的λ-移植物的比較進行圖解說明。陽性對照Gal4-VP16給出了該系統最大可能的轉錄激活水平。螢光素酶活性已就轉染效率進行了校正。[0045]圖8顯示了在37°C對聚集的抗性。圖8代表如在PBS-緩衝液中所示的通過溫育前後存在的單體蛋白的量而定量的所選構架組合在37°C對聚集的抗性。圖表A代表構架2.4和5.2，而圖表B代表構架4.4,6.4和7.3。[0046]圖9顯示了在人血清中對聚集和蛋白酶降解的抗性。圖9代表通過延長溫育前後存在的可溶性全長蛋白的量而定量的所選構架組合在37°C人類血清中對蛋白酶降解聚集的抗性。[0047]圖10顯示了在酵母相互作用測定中通過IacZ表達的激活而測定的兩個所選結合物對Fab-環境下新構架7.3的性能。Fab-鏈的表達始於位於ars/cen或2微米載體之上的雙向半乳糖誘導型啟動子。所述Fab載體的表達產生抗體輕鏈和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白。結合物定向於人類球樣激酶l(hPLKl)。與該靶的結合和與無關抗原的非特異性結合以及未隨機化的構架7.3的結合進行了比較。注意作為參照包括在內的相應scFv是由肌動蛋白啟動子(2微米)表達的。[0048]圖11顯示了通過酵母菌株JPY9胞漿中產生的可溶蛋白的量測定的所述scFv構架在Fab-環境下的體內性能。Gal4-AD-scFv融合子(肌動蛋白/2微米)的表達與相應的Fab-構建體的表達並與作為Fab的母體構架7.3進行了比較，兩者均來自兩個不同的載體(Gal-誘導型、ars/cen和2微米)。Fab載體的表達產生抗體輕鏈和VH-CHl-Gal4_AD融合蛋白，它在該印跡中檢測。[0049]圖12顯示了所選VH結構域序列的對比。圖12顯示了由多種酵母「質控」篩選挑選出的所有VH-結構域構架序列的對比。[0050]圖13顯示了所選VL結構域序列的對比。圖13顯示了由多種酵母「質控」篩選挑選出的所有VL-結構域構架序列的對比。[0051]圖14顯示了隨機文庫成員的對比。圖14顯示了從文庫中隨機挑取的序列的對比。[0052]圖15顯示了在質控系統中所選的性能良好的構架的亞類的統計分析(佔全部所選序列的百分比)。圖15顯示了由「質控」系統分離到的序列中VH-和VL-結構域亞類頻率的統計分析。只考慮隨後在定量酵母測定中發現是陽性的那些序列。所選序列與由有限數目的隨機序列(圖14)確定的未選文庫進行了比較。[0053]圖16顯示了用於進一步重組和評價最佳scFv組合的序列以及它們各自的縮寫(abb.)、來源和亞家族。[0054]發明詳述[0055]除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬【
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】的普通技術人員所通常理解的相同的含義。儘管類似於或等同於本文所述那些的方法和材料可用於實施或檢驗本發明，合適的方法和材料還是描述於下文。特此將文中提及的所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻全文併入作為參考。如有衝突，將以本說明書(包括定義)為準。另外，所述材料、方法和實施例僅用於舉例說明，而並非旨在限制。[0056]如本文所用，「同一性」是指兩多肽、分子或兩核酸之間的序列相似性。當兩相比序列的某位置都被同一鹼基或胺基酸單體亞單位佔據時(例如，兩DNA分子中每一個的某位置都被腺嘌呤佔據，或者兩多肽中每一個的某位置都賴氨酸佔據)，則相應分子在該位置上是一致的。兩序列間的「百分比同一性」是兩序列共有的匹配位置數目除以比較的位置數目XlOO的函數,例如，如果兩序列10個位置中有6個匹配,則這兩個序列具有60%的同一性。作為離子，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50%的同源性(總共6個位置上有3個匹配)。一般而言，當兩序列比對可得出最大同源性時就進行比較。此類對比可利用例如Needleman等，J.MolBiol.48:443-453(1970)的方法提供,通過電腦程式例如Alignprogram(DNAstar,Inc.)方便地執行。[0057]「相似」序列是那些在比對時享有相同和相似胺基酸殘基的序列，其中相似殘基是比對的參照序列中相應胺基酸殘基的保守取代或者「許可的點突變」。就這點而言，參照序列殘基的「保守取代」是被與對應參照殘基物理上或功能上類似，如具有相似大小、形狀、電荷、化學特性，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等的殘基取代。因而，「保守取代修飾」的序列是與參照序列或野生型序列的差異在於存在一個或多個保守取代或許可的點突變的序列。兩序列間的「陽性百分比」是含兩序列共有的匹配殘基或保守取代的位置數目除以比較的位置數目X100的函數。例如,如果兩序列10個位置中有6個匹配,且10個位置中有2個含保守取代，則這兩個序列具有80%的陽性同源。[0058]「VH結構域」是指免疫球蛋白分子重鏈的可變部分。[0059]「VL結構域」是指免疫球蛋白分子輕鏈的可變部分。[0060]VH或VL「亞型」是指通過如Knappik(2000)中所定義的相應共有序列所定義的亞型。術語「亞家族」或「亞類」作為「亞型」的同義詞使用。如本文所用的術語「亞型」是指與代表其亞型的相應共有序列享有高度同一性和相似性的序列。某一可變結構域序列是否屬於某「亞型」是通過將該序列與相應結構域的所有已知人類生殖系區段、或者定義的共有序列比對，並隨後鑑定最大同源性確定的。確定同源性和通過利用查詢矩陣例如BLOSUM(Henikoff1992)對序列分類的方法是本領域技術人員眾所周知的。[0061]如本文所用的「胺基酸共有序列」是指胺基酸序列，它可利用至少兩個或優選更多比對的胺基酸序列矩陣產生，並且考慮到比對中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的胺基酸殘基。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的胺基酸的序列。如果在單個位置上等同地表示兩個或多個胺基酸，則共有序列包括兩個或所有那些胺基酸。[0062]蛋白的胺基酸序列可在多種水平分析。例如，保守或變異可表現在單殘基水平、多殘基水平、具有空缺的多殘基水平等。殘基可表現出相同殘基的保守或者可以在分類的水平上保守。胺基酸分類的實例包括極性但不帶電荷的R基團(絲氨酸、蘇氨酸、天門冬醯胺和穀氨醯胺)；帶正電荷的R基團(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電荷的R基團(穀氨酸和天門冬氨酸)；疏水R基團(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊胺基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它分類是本領域技術人員公知的，並且可利用結構決定簇或其它數據定義，以評估可取代性。就該意義而言，可取代胺基酸可以指能夠被取代並維持該位置上的功能保守性的任何胺基酸。[0063]如本文所用的「多核苷酸共有序列」是指核苷酸序列，它可利用至少兩個或優選更多比對的核酸序列矩陣產生，並且考慮到對比中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的核苷酸。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的核苷酸的序列。如果在單個位置上等同地表示兩個或多個核苷酸，則共有序列包括兩個或所有那些核苷酸。[0064]如本文所用的「結構亞-元件」是指蛋白或多肽內與該分子限定的結構或功能部分對應的一段胺基酸殘基。這些可以是環(即抗體的CDR環)或者蛋白或多肽內任何其它二級或功能結構(即結構域、α-螺旋、β-片層、抗體構架區等)。結構亞元件可利用相似或同源多肽的已知結構或者通過利用上文提及的比對胺基酸序列的矩陣鑑定。這裡各位置上的變異是確定屬於某一結構亞元件(如抗體高變區)的一段胺基酸殘基的基礎。[0065]如本文所用的「亞序列」是指編碼至少一個結構亞元件的基因模塊。它未必一定與結構亞元件相同。[0066]如本文所用的「抗體⑶R」是指抗體的互補決定區，其由如Kabat等(1991)所定義的抗原結合環組成。例如，抗體Fv片段的兩可變結構域中的每一個都含3個CDR。[0067]如本文所用的「抗體」是「免疫球蛋白」的同義詞。根據本發明的抗體可以是完整免疫球蛋白或其片段，包括免疫球蛋白的至少一個可變結構域，例如單可變結構域，Fv(Skerra,1988)、scFv(Bird,1988;Huston,1988)、Fab、(Fab')2或本領域技術人員眾所周知的其它片段。[0068]如本文所用的「抗體構架」是指可變結構域VL或VH的一部分，它起著該可變結構域抗原結合環的支架的作用(Kabat等，1991)。[0069]合理設計的scFv片段已證明了scFv片段的熱動力學穩定性與其體內性能之間清楚的關聯(Wdrn，2000;AufderMaur,2001)0利用最近研發的命名為「質控」的系統(AufderMaur,2001),已分離到適於胞內應用的特定抗體可變結構域構架序列(圖12和13)、描述了特徵(圖1和2)並進一步改善(圖3至9及圖14)。如同我們以前的實驗中所觀察到的那樣，在胞內測定中所選的性能良好的構架表現出高的體外穩定性，如通過其37°C抗聚集和蛋白酶降解所證明的那樣(圖8和9)。而且，形成了允許在更廣基礎上根據其構架亞家族(圖15)選擇用於胞內應用的構架的模式。文中公開了可用於胞內應用的特定抗體可變結構域，還有通用模式。一方面，這允許利用這些序列作為移植實驗的構架供體以獲得保留了環供體的結合特異性的功能性內體。另外，可利用公開的序列作為構架構建抗體文庫。此類文庫適用於還原條件下的胞內選擇系統，例如原核和真核細胞系統。另外，所公開的序列可用於鑑定例如保守序列或殘基或基序。結構亞元件的移植，例如抗體結合環的移植(如Jung,1997)，還有抗體或其片段文庫的製備(如Vaughan,1996;Knappik,2000)已有詳細描述，並且是本領域技術人員眾所周知的。[0070]由於胞內應用將抗體片段暴露於極為不利的條件下(即升高的溫度、還原環境)，而本發明公開的序列獲得了使之抵抗最不利條件的特點。因此，當與「普通」序列相比時，這裡公開的序列具有出色的穩定性和可溶性，如通過其對聚集和蛋白酶降解的抗性所證明的那樣(圖8和9)。這些特點，連同其優良的表達產率，使得所公開的抗體構架序列獨特地不僅適於胞內應用，而且尤其適於所有其中極需關注長半衰期、耐用性和製備的容易性的治療和診斷應用。[0071]本發明使得可能設計包括至少抗體的可變部分、可用於還原或其它挑戰性環境下的應用的多肽序列。在第一實施方案中，本發明提供了可用於胞內應用的抗體構架序列集合(圖12和13)。在第一步中，利用酵母質控系統不依賴於結合親和力地篩選多種序列的文庫。分離的序列可在酵母和哺乳動物細胞中評價其胞內性能(圖1和2)。[0072]在本發明的一個實施方案中，對分離序列的集合通過比對進行分析，以鑑定抗體可變結構域亞類和適用於胞內應用的共有序列。[0073]在本發明另一優選的實施方案中，對上述抗體構架序列的集合進一步通過相互比對和亞家族分類進行分析。屬於一個亞型的所有構架就其在酵母和在哺乳動物細胞中的胞內性能進行比較(圖1和2，作為實例)，並就其胺基酸序列中相對於各亞型共有序列所發生的陰性、中性或陽性交換進行比較。本領域技術人員能夠根據免疫球蛋白結構域中特定交換殘基的結構環境區別陽性、中性和陰性變化。隨後，選擇表現出最佳胞內性能的可變抗體結構域構架序列，並且其與相應亞型共有序列相比沒有陰性交換。優選地，挑選進一步含有據認為是陽性胺基酸交換的序列。[0074]在另一優選的實施方案中，所選的重鏈和輕鏈抗體可變結構域隨後以所有可能的組合重組為scFv片段，以鑑定具有最高穩定性和可溶性的組合。為了這個目的，對新的重組scFv片段進行有關在酵母(圖3)和在哺乳動物細胞系(圖4和7)的胞內相互作用測定中還原條件下的性能以及有關在酵母中的可溶性胞內表達(圖5)的評價。對有希望的組合進一步通過分析大腸桿菌中的周質表達(圖6)、升高的溫度下對聚集的抗性(圖8)以及在人類血清中於37°C延長溫育後對聚集和蛋白酶降解的抗性(圖9)進行有關氧化條件下的行為的評價。這些數據被用來鑑定最適於胞內或氧化條件下的任何特定應用的scFv構架。[0075]本文公開的所選且優化了的構架序列不僅在胞內應用中，而且在所有可得益於scFv提高的穩定性和/或可溶性的應用中都具有顯著的優勢。實例有在診斷應用中需要以高濃度長期貯存，以及37°C血清中延長的功能半衰期(例如象治療應用中所需的那樣)。[0076]根據本發明的一個方面，提供了包括具有如下通式結構的單鏈構架的內體構架:[0077]NH2-VL-接頭-VH-COOH;或[0078]NH2-VH-接頭-·VL-COOH[0079]其中VH構架為la、Ib或3亞型。[0080]在另一個實施方案中，上述單鏈構架中VH和VL區的取向顛倒。[0081]根據本發明的一個方面，提供了包括具有如下通式結構的單鏈構架的內體構架:[0082]NH2-VL-接頭-VH-COOH;或[0083]NH2-VH-接頭-VL-COOH[0084]其中VH構架為la、Ib或3亞型，且VL構架為λ?、λ3或κI亞型。[0085]在另一個實施方案中，本發明提供了融合於第二蛋白成分的單鏈構架，以產生具有如下通式結構的融合構建體:[0086]NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-C00H;或[0087]NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH[0088]其中VH構架為la、Ib或3亞型，且VL構架為λ?、λ3或κI亞型。[0089]在另一個實施方案中，這些融合構建體中VH和VL區的取向可以顛倒。[0090]在另一個實施方案中，可變結構域可摻入到Fab片段中，所述片段可另外融合於第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體:[0091]NH2-VH-CH-第二蛋白-C00H和NH2-VL-CL-C00H[0092]所述第二蛋白可融合於重鏈或輕鏈的N-端或C-端。[0093]如本文所公開的，胞內應用中存在著對亞型為3及Ia和Ib的VH構架極強的偏好。至於輕鏈可變結構域(VL)，κI構架在數量上具有清楚的偏好，但λI和3也被富集。因此，這些構架亞型，即與κ1、λ3VL結構域相組合的VHlaUb和3最適合用於胞內應用以及需要scFv摺疊性質的其它應用。因此，為了降低還原環境中無功能分子的數量，用於胞內篩選系統的文庫應當優選由這些構架亞型的混合物構建。[0094]在優選的實施方案中，本發明抗體片段的VH結構域為la、lb或3亞群。[0095]在優選的實施方案中，本發明抗體片段的VL結構域為κ1、λI或3亞群。[0096]在優選的實施方案中，用作為構架的抗體片段選自如圖16所示的1.1,2.1,3.1、4.1,5.1,1.2,2.2,3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3,7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4和6.4。[0097]在本發明的一個實施方案中，至少兩個並且優選多個構架被鑑定然後予以分析。當蛋白序列彼此比對時，可建立蛋白序列的資料庫。則該比對可用於定義例如在序列和結構排列上(如果該信息可用的話)都表現出高度相似性的殘基、亞元件、亞序列或構架序列亞群。[0098]亞元件的長度優選，但並非僅在I個胺基酸(例如酶活性位點中的一個殘基或結構決定殘基)和150個胺基酸(例如完整蛋白結構域)的範圍之內。最優選的是，長度範圍在3和25個胺基酸之間，例如最常見於抗體CDR環中的。[0099]在另一個實施方案中，合成了由分析推測的共有核酸序列。這可通過本領域熟練從業人員眾所周知的多種方法中的任何一種，例如通過全基因合成或通過以PCR為基礎的途徑實現。[0100]在另一個實施方案中，所述核酸序列被克隆到載體中。載體可以是測序載體、表達載體或展示(如噬菌體展示)載體，所有這些都是本領域技術人員眾所周知的。載體可包含一個核酸序列或在不同或同一操縱子中的兩個或多個核酸序列。在最後一種情況下，它們可單獨或作為連續的序列克隆。[0101]在一個實施方案中，多肽具有特定物種的模式特徵。例如，這可通過由僅僅一個種類的同源蛋白的集合，優選由人類蛋白集合推斷共有序列而實現。[0102]本發明另一實施方案涉及通過提供編碼如上所述的多肽和附加成分的DNA序列而得的融合蛋白。[0103]在另一實施方案中，本發明提供了核酸序列、含所述核酸序列的載體、含所述載體的宿主細胞以及根據本文所述方法可獲得的多肽。[0104]在另一實施方案中，本發明提供了合成或以其它方式在本發明的核酸序列末端安置限制性位點，以使其能夠克隆到合適的載體中。[0105]在另一優選的實施方案中，本發明提供了與編碼所述多肽的核酸序列相容的載體系統。所述載體包括限制性位點，這將是，舉例來說，在該載體系統中獨一無二的，並且就摻入到編碼所述多肽的核酸序列中的限制性位點而言基本上是唯一的，除了例如該核酸序列克隆到載體中所必需的限制性位點之外。[0106]在另一個實施方案中，本發明提供了試劑盒，包括一個或多個核酸序列、重組載體、多肽和根據上述方法的載體，以及例如用於產生所述多肽的合適的宿主細胞。[0107]所有上述本發明的實施方案可利用本領域技術人員公知的分子生物學標準技術完成。[0108]在另一個實施方案中，核酸序列是能夠編碼本發明的多肽的任何序列。[0109]在另一個實施方案中，本發明的核酸用於基因治療。[0110]在另一個實施方案中，單鏈構架是(圖16)中1.1,2.1,3.1,4.1,5.1,1.2,2.2、3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3、7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4、6.4任一序列的變體，其中如本文所用的「變體」是指表現出90%或更大的同一性、同時又保持增強的穩定性的序列。[0111]在另一個實施方案中，單鏈構架是(圖16)中1.1,2.1,3.1,4.1,5.1,1.2,2.2、3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3,7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4,6.4任一序列的衍生物，其中如本文所用的「衍生物」是指僅保持了對於該分子功能和穩定性至關重要的那些胺基酸的序列。如實施例3中所述的構架中孤立的中性或陽性交換不被認為是與本發明的抗體構架相關的變化。[0112]在本發明優選的實施方案中，所述單鏈構架融合於第二蛋白，其中該蛋白為胞內測定提供了讀出。所述讀出可以是直接的，例如以與可檢測的蛋白如可通過螢光觀察的GFP(綠色螢光蛋白)、增強的藍色螢光蛋白、增強的黃色螢光蛋白、增強的青色螢光蛋白或者具有不同檢測方法的其它融合伴侶融合的形式。或者，所述讀出可通過報告基因的轉錄激活實現，其中scFv-融合蛋白的融合伴侶是轉錄激活劑，例如Gal4激活結構域，或者DNA-結合蛋白，例如LexA或Gal4DNA-結合結構域，其激活酶例如β-半乳糖苷酶、螢光素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶等報告基因的轉錄，這轉錄提供了讀出。提供讀出的融合蛋白是本領域技術人員眾所周知的。[0113]本發明的另一個實施方案是包括本文所述的構架的抗體。[0114]本發明的另一個實施方案是本發明抗體的應用。[0115]本發明另一優選的實施方案是抗體可變結構域的所述構架類別以及可變結構域和scFv序列用於從既有抗體上移植高變環的用途，以獲得在還原或其它挑戰性環境中有功能的抗體。[0116]本發明另一個進一步優選的實施方案是抗體可變結構域的所述構架類別以及可變結構域和scFv序列的用途，例如通過此類構架的一個或多個高變環的隨機化，用於建立文庫，應用於還原或或其它挑戰性環境中。[0117]對本領域普通技術人員將會顯而易見的是，文中所述的本發明的分子可用於診斷和治療應用、靶確認以及基因治療。[0118]本發明可通過如下實施例舉例說明，其並不旨在以任何方式限制本發明的範圍。[0119]參考文獻[0120]Agatep,R.,Kirkpatrick,D.1,.,Parchaliuk,R.A.,Woods和Gietz,R.D.(1998)."TransformationofSaccharomycescerevisiaebylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyIeneglycolprotocol."Technical.TipsOnline(http://tt0.trends,corn).[0121]AufderMaur,A.,Escher,D.和Barberis,A.(2001)."Antigen-1ndependentselectionofstableintracellularsingle-chainantibodies."FEBSLett508:407-412.[0122]【權利要求】1.單鏈構架，具有如下通式結構:NH2-VL-接頭-VH-COOH;或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VL結構域如序列Seq.1d.N0.4所示並且VH結構域如序列Seq.1d.N0.11所示。2.融合於第二蛋白成分的權利要求1的單鏈構架，以產生具有如下通式結構的融合構建體:NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOH;或NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-C00H。3.權利要求2的單鏈構架，其中VH和VL區的取向顛倒。4.權利要求2的單鏈構架，其中所述第二蛋白為胞內測定提供讀出信息。5.權利要求4的單鏈構架，其中所述第二蛋白選自GFP、增強的藍色螢光蛋白、增強的黃色螢光蛋白、增強的青色螢光蛋白、轉錄激活劑或DNA-結合蛋白。6.權利要求5的單鏈構架，其中所述轉錄激活劑為Gal4激活結構域。7.權利要求5的單鏈構架，其中所述DNA-結合蛋白為LexA或Gal4DNA-結合結構域。8.權利要求1-7中任一項的單鏈構架在靶確認或文庫構建中的用途。9.權利要求1的構架序列在鑑定保守構架殘基種類中的用途。10.權利要求9的用途，其中保守構架殘基種類選自下組:極性但不帶電荷的R基團；帶正電荷的R基團；帶負電荷的R基團；疏水R基團；及特殊胺基酸，即，半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸。11.權利要求1的構架序列在鑑定至少一個保守構架序列中的用途。12.權利要求11的用途，其中保守構架序列為2-5個殘基。13.權利要求11的用途，其中保守構架序列為5-10個殘基。14.權利要求11的用途，其中保守構架序列為10-25個殘基。15.權利要求11-12中任一項的用途，其中保守構架序列具有缺口。16.抗體，包括來自根據權利要求1-7中任一項的單鏈構架的VL和VH。17.抗體片段，包括來自根據權利要求1-7中任一項的單鏈構架的VL和VH。18.權利要求16的抗體或權利要求17的抗體片段在靶確認或文庫構建中的用途。19.核酸，能夠編碼根據權利要求1-7中任一項的單鏈構架。20.載體，包含根據權利要求19的核酸。21.宿主細胞，包含根據權利要求19的核酸。【文檔編號】C07K16/18GK103739706SQ201410031953【公開日】2014年4月23日申請日期:2003年5月21日優先權日:2002年5月22日【發明者】K·緹索特,S·艾沃特,A·奧弗德爾茂爾,A·巴伯裡斯,D·艾施爾申請人:艾斯巴技術-諾華有限責任公司