合成的C型肝炎基因組和製備及使用方法

2023-05-06 18:28:41 2

合成的C型肝炎基因組和製備及使用方法
【專利摘要】使用Bayesian系統發生樹分析、祖先序列重建和協方差分析的本發明的方法提供了包括被稱為Bole1a和Bole1b的1a和1b基因組的合成的代表性的HCV亞型。Bole1a集中分支在用於其設計的390條全基因組序列、謹慎組織的143條序列全基因組數據集和包括來自Baltimore定群的214條E1E2序列的獨立的組的單獨的基因組區中。Bole1a是廣泛流行的毒株的系統發生代表。全基因組非同義多樣性比較和9-mer肽覆蓋分析顯示Bole1a能夠比包括傳統的參考序列H77的數據集中任何其他序列提供更多的覆蓋（分別地94%和78%）。當與所有已知的T細胞表位相比時，Bole1a還提供了無與倫比的表位覆蓋。
【專利說明】合成的C型肝炎基因組和製備及使用方法
[0001]相關申請的引用
[0002]本申請要求2011年5月2日提交的美國臨時專利申請號61/481，457的權益，該美國臨時專利申請在此通過弓丨用被併入用於所有目的，如同在本文被完全列出。
[0003]政府權益的聲明
[0004]本發明根據基金號R01DA024565，在美國政府支持下完成。美國政府在本發明中具有某些權利。
_5] 發明背景
[0006]HCV是小的包膜的黃病毒(Flaviviridae)科病毒，具有由5』非翻譯區(UTR)、編碼病毒特異性蛋白的大的開放閱讀框和3』 UTR組成的9.6-kb的單鏈、正鏈RNA基因組。5』 UTR包含介導具有約3000個胺基酸的單個多蛋白(polyprotein)的翻譯的內部核糖體進入位點(IRES)。多蛋白由位於N端的結構蛋白(核心(core )、EI和E2 )，之後為在剩餘部分中編碼的P7和非結構蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)組成。
[0007]儘管對於有效的HCV疫苗存在公認的需求，待被用作抗原的病毒毒株的選擇是任意的。在人和黑猩猩中的研究已顯示宿主免疫系統能夠發動對HCV的有效的應答，且曾經已清除感染的人有可能再次進行該清除，儘管該作用是由宿主遺傳潛在地引起。HCV的遺傳多樣性，其甚至大於HIV的遺傳多樣性，對有效疫苗的研發造成巨大的挑戰。由於即使單個胺基酸的取代也能夠通過消除由該表位特異性的T細胞的識別而減少疫苗效力，選擇適合的毒株作為疫苗候選毒株是至關重要的。已提出使用祖先或共有序列作為用於HIV-1的疫苗候選序列。與共有序列相比，嵌合方法(包括單個表位的多個變體序列)產生了對HIV-1表位的更有活力的T細胞應答。最近已鑑定了關於HCV的嵌合候選序列，儘管它們的效力仍然未知。
[0008]C型肝炎病毒(HCV)影響世界範圍的約1.7億人口。約20%_25%的患有急性C型肝炎的患者實現病毒的自發清除，而75%-80%的患者則發展為慢性感染。約20%的慢性C型肝炎患者發展為肝硬化，且在這些人中，4%的患者將發展為肝細胞癌且6%的患者將發展為終末期肝病。沒有可用的HCV疫苗且通常使用的基於幹擾素的治療是有毒的、長期的、昂貴的、非一貫地成功的，且在大多數疾病的晚期形式中是無效的。
[0009]如此，對於製備針對HCV和相關病毒的抗原、抗體和疫苗的更有效的工具仍然存在未滿足的需求。
[0010]發明概沭
[0011]根據實施方案，本發明提供了編碼合成的C型肝炎病毒亞型Ia的基因組(Bolela)的核酸分子,包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其互補序列(complement)。
[0012]根據另一個實施方案，本發明提供了與在SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列或與其互補序列特異性雜交的分離的核酸分子。
[0013]根據另外的實施方案，本發明提供了用於PCR的寡核苷酸引物對，其中第一條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列特異性雜交的分離的核酸分子，且第二條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的互補序列特異性雜交的分離的核酸分子。
[0014]根據仍然另一個實施方案，本發明提供了由包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列的核酸編碼的分離的多肽。
[0015]根據又另外的實施方案，本發明提供了具有SEQ ID NO:2的胺基酸序列的分離的多肽。
[0016]根據一個實施方案,本發明提供了一種病毒粒子,該病毒粒子包括a)SEQ ID NO:1的核心序列的最後27個胺基酸、隨後為El和E2區的胺基酸序列，和b)報告元件。
[0017]根據另一個實施方案，本發明提供了 HCV抗原，該HCV抗原包含編碼SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的15至100之間的連續的胺基酸的多核苷酸分子。
[0018]根據另外的實施方案，本發明提供了抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分與具有SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的核酸分子特異性結合。
[0019]根據仍然另一個實施方案，本發明提供了測試樣品以確認樣品中HCV的存在的方法，該方法包含檢測樣品中與以上公開的抗體特異性結合的多肽的存在。
[0020]根據實施方案，本發明提供了治療被HCV感染的受試者的方法，包括以足夠刺激受試者中針對抗原的免疫應答的量向受試者施用包含以上描述的抗原的藥物組合物，如此以致免疫應答足夠減少受試者中HCV的病毒載量。
[0021]附圖簡沭
[0022]圖1描繪了顯示a) Bolela和Yusim數據集b) Bolela和E1E2數據集的鄰接樹。在兩幅圖中Bolela序列都呈粗體顯示。
[0023]圖2 Ca)是使用20個密碼子的滑動窗口大小，比較亞型Ia序列(「亞型la」)中平均成對非同義(dN)和同義(dS)多樣性與Bolela和亞型Ia序列之間的平均成對距離的多樣性圖。關於該比較，390條全基因組序列的原始數據集是多蛋白參考序列的來源。圖2(b)顯示使用Bolela作為參考序列和(390條序列的)共有區、H77、HCV_1和Ib (D90208)序列比較E1E2的比對。垂直條指示與Bolela相比各自的序列中具有胺基酸差異的位置且星號指示HVRl的位置。
[0024]圖3 (a)描繪了基於由Bolela和Yusim數據集中所有其他序列提供的模式(最常觀察到的)9-mer的覆蓋，Bolela (由星號指示)是極具代表性的，且圖3 (b)顯示與已知表位的同一性，描繪為顯示是已知並常見的338種表位T細胞表位的相同序列的表位序列的百分數的直方圖。
[0025]圖4顯示呈1glO (RLU)顯示的不同的HCVpp的感染性。黑色虛線代表感染性HCVpp的RLU閾值。條的最左邊的組分別描繪僅具有培養基的Bolela、具有抗-⑶81的Bolela及具有同種型對照的Bolela的平均感染性。條的中間的組分別描繪僅具有培養基的H77、具有抗-CD81的H77及具有同種型對照的H77的平均感染性。誤差條是從3次實驗計算的標準差。右邊的兩個條顯示感染性的(實線框)和非感染性的(虛線框)所有亞型IaHCVpp的平均感染性。誤差條代表感染性的標準差。
[0026]發明詳沭
[0027]本發明提供了合成的HCV亞型Ia基因組(Bolela)，其對於疫苗研究和開發、抗原製備、抗體製備、診斷測試和寡核苷酸引物或探針製備和其他用途是有用的。
[0028]根據一個或多個實施方案，本發明提供了合成的亞型la HCV病毒基因組且所得的源自計算的基因組是廣泛流行的毒株的代表，具有體外介導進入肝癌細胞的功能包膜基因，且無論比較所有的9-mer還是所有已知的常見表位都比GenBank中任何其他亞型Ia序列匹配更多的⑶8+T細胞表位。
[0029]根據實施方案，本發明提供了編碼合成的C型肝炎病毒亞型Ia的基因組(Bolela)的核酸分子,該核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其互補序列。
[0030]如本文所用的術語「核酸」，包括「多核苷酸」、「寡核糖核苷酸」和「核酸分子」，且通常指DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈的或雙鏈的，合成的或從天然來源中獲取的(例如，分離的和/或純化的)，其可包含天然的、非天然的或經改變的核苷酸，且其可包含天然的、非天然的或經改變的核苷酸間連鍵，諸如氨基磷酸酯連鍵或硫代磷酸酯連鍵，代替在未修飾的寡核苷酸的核苷酸之間發現的磷酸二酯。通常優選的是核酸不包含任何插入、缺失、倒置(inversion)和/或取代。然而，在某些情況下，如本文討論的，核酸包含一個或多個插入、缺失、倒置和/或取代可以是適合的。
[0031]在實施 方案中，本發明的核酸是重組體。如本文使用的，術語「重組體」指(i)通過連接天然的或合成的核酸區段與能夠在活細胞中複製的核酸分子在活細胞外構建的分子，或(ii)以上(i)中所描述的分子的複製產生的分子。為了本文的目的，複製可以是體外複製或體內複製。
[0032]使用本領域已知的方法，基於化學合成和/或酶促連接反應可構建核酸。見，例如，Sambrook等人(編者)，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York (2001)和 Ausubel 等人，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates 和 John Wiley&Sons, NY(1994)。例如，可使用天然存在的核苷酸或被設計增加分子的生物穩定性或增加雜交時所形成的雙鏈體的物理穩定性的經多種修飾的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化學合成核酸。可被用於產生核酸的經修飾的核苷酸的實例包括，但不限於，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、P -D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖Q核苷、5』-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(V)、wybutoxosine、假尿喃唳、Q核苷、2_硫胞喃唳、5-甲基_2_硫尿喃唳、2_硫尿喃唳、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤。可選地，本發明的一種或多種核酸可從公司購得，諸如MacromolecularResources (Fort Collins, CO)和 Synthegen(Houston, TX)。
[0033]核酸可包含編碼任何Bolela多肽或蛋白或其片段或功能部分或功能變體的任何核苷酸序列。例如，核酸可包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列或可選地可包含與SEQ IDNO:1簡併的核苷酸序列。
[0034]本發明還提供了分離的或純化的核酸，該核酸包含與本文描述的任何核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列或在嚴格條件下與本文描述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在實施方案中，本發明提供了與SEQ ID NO:1的全長核苷酸序列互補的核酸分子。
[0035] 如本文定義的，Bolela多肽或蛋白的功能部分或功能變體包括，例如，核心、EUE2、NS3、NS4、NS5和它們的亞基、UTR抗原蛋白和其片段的任一項。
[0036]在實施方案中，分離的核酸分子包含與SEQ ID NO:1或其互補序列基本上相同，例如，與SEQ ID NO:1或其互補序列具有至少50%，例如，60%、70%、80%或90%或更多的連續的核酸序列同一性的核苷酸序列。
[0037]在嚴格條件下雜交的核苷酸序列優選在高度嚴格條件下雜交。「高度嚴格條件」是指核苷酸序列以比非特異性雜交可檢測地強(detectably stronger)的量與祀序列(本文描述的任何核酸的核苷酸序列)特異性雜交。高度嚴格條件包括將具有準確互補的序列的多核苷酸，或僅包含一些分散的錯配的多核苷酸與碰巧具有匹配該核苷酸序列的一些小的區(例如，3-10個鹼基)的隨機序列區分開的條件。具有互補性的此類小的區比14-17或更多鹼基的全長互補序列更容易解鏈，且高度嚴格雜交使得它們可容易區分。相對高度嚴格條件將包括，例如，低鹽和/或高溫度條件，諸如由約0.02-0.1M NaCl或等同物、在約500C _70°C的溫度時提供的條件。
[0038]本發明的核酸可被併入重組表達載體。就這一點而言，本發明提供了包含本發明的任何核酸的重組表達載體。為了本文的目的，術語「重組表達載體」指如下的基因修飾的寡核苷酸或多核苷酸構建體:當該構建體包含編碼mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，且載體在足夠使得mRNA、蛋白、多肽或肽在細胞內表達的條件下與細胞接觸時，允許mRNA、蛋白、多肽或肽被宿主細胞表達。本發明的載體不是作為整體天然存在。然而，載體的部分可以是天然存在的。本發明的重組表達載體可包含任何類型的核苷酸，包括，但不限於，DNA和RNA，其可以是單鏈的或雙鏈的、合成的或部分從天然來源中獲得的，且其可包含天然的、非天然的或經改變的核苷酸。重組表達載體可包含天然存在的、非天然存在的核苷酸間連鍵、或這兩種類型的連鍵。優選地，非天然存在的或經改變的核苷酸或核苷酸間連鍵不會阻礙載體的轉錄或複製。
[0039]本發明的重組表達載體可以是任何適合的重組表達載體，且可被用於轉化或轉染任何適合的宿主。適合的載體包括設計用於增殖和擴增或用於表達或二者的載體，諸如質粒和病毒。載體可選自由以下組成的組:pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript 系列(Stratagene, La Jolla, CA)、pET 系列(Novagen, Madison, WI)> pGEX 系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)和 pEX 系列(Clontech, Palo Alto, CA)。還可使用噬菌體載體，諸如 XGT10、AGTlU A ZapII (Stratagene)、X EMBL4 和 XNM1149。植物表達載體的實例包括 pBIOl、pBIlOl.2、pBIlOl.3、pBI121 和 pBIN19 (Clontech, MountainView, CA)。動物表達載體的實例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo (Clontech)。優選地,重組表達載體是病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體，諸如慢病毒載體。
[0040]可使用在例如在前的Sambrook等人和在前的Ausubel等人中描述的標準重組DNA技術，製備本發明的重組表達載體。可製備環狀或線性的表達載體的構建體以包含在原核或真核宿主細胞中發揮功能的複製系統。複製系統可源自例如，ColEl、2ii質粒、X、SV40、牛乳頭瘤病毒、慢病毒，等等。
[0041]期望地，重組表達載體包含調節序列，諸如轉錄和翻譯起始和終止密碼子，其是對載體待被引入的宿主類型(例如，細菌、真菌、植物或動物)特異性的，視情況而定並考慮載體是基於DNA還是RNA。
[0042]重組表達載體可包括一種或多種標誌物基因，其允許選擇轉化的或轉染的宿主。標誌物基因包括殺生物劑抗性，例如，對抗生素、重金屬等的抗性，營養缺陷型宿主中的互補以提供原養型，等等。用於本發明的表達載體的適合的標誌物基因包括，例如，新黴素/G418抗性基因、潮黴素抗性基因、組氨醇抗性基因、四環素抗性基因和氨苄青黴素抗性基因。
[0043]重組表達載體可包含與編碼Bolela病毒多肽或蛋白(包括其功能部分和功能變體)，諸如核心、E1、E2、NS3、NS4、NS5、UTR,等等的核苷酸序列可操作連接的天然的(native)或非天然的(nonnative)啟動子,或與同編碼Bolela病毒多肽或蛋白或其片段的核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列可操作連接的天然的或非天然的啟動子，如以上討論的。
[0044]啟動子的選擇，例如，強的、弱的、可誘導的、組織特異性的和發育特異性的，在技術人員的普通技能之內。相似地，將核苷酸序列與啟動子組合也在技術人員的技能之內。啟動子可以是非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子和在鼠(murine)幹細胞病毒的長末端重複中發現的啟動子。
[0045]根據另一個實施方案，本發明提供了包含分離的核酸分子的分離的宿主細胞，該分離的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其互補序列。
[0046]本發明還提供了包含本文描述的任何重組表達載體的宿主細胞。如本文所用的，術語「宿主細胞」指可包含本發明的重組表達載體的任何類型的細胞。宿主細胞可以是真核細胞，例如，植物、動物、真菌或藻類或可以是原核細胞，例如，細菌或原生動物。宿主細胞可以是經培養的細胞或原代細胞，即從生物體例如人直接分離的細胞。宿主細胞可以是粘附細胞或懸浮細胞，即，生長在懸液中的細胞。適合的宿主細胞是本領域已知的並包括，例如，DH5 a大腸桿菌(E.coli)細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞，和類似的細胞。對於擴增或複製重組表達載體的目的，宿主細胞優選是原核細胞，例如DH5a細胞。對於製備重組Bolela病毒、多肽或蛋白的目的，宿主細胞優選是哺乳動物細胞。最優選地，宿主細胞是人細胞。宿主細胞可以是任何細胞類型，可以起源於任何類型的組織，且可以是任何發育階段。宿主細胞可以是肝細胞，諸如，例如，Hep3B細胞。
[0047]本發明還提供了包含本文描述的至少一種宿主細胞的細胞群體。細胞群體可以是包含含有描述的任何重組表達載體的宿主細胞，以及至少一種其他細胞的異質群體，至少一種其他細胞例如不包含任何重組表達載體的宿主細胞(例如，肝細胞)，或不是皮膚細胞的細胞，例如，巨噬細胞、嗜中性粒細胞、紅細胞、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌細胞、腦細胞,等。可選地,細胞群體可以是基本上均質的群體,其中群體主要包括(例如,基本上由其組成)含有重組表達載體的宿主細胞。群體還可以是克隆的細胞群體，其中群體的所有細胞都是包含重組表達載體的單個宿主細胞的克隆，如此以致群體的所有細胞都包含重組表達載體。在本發明的一個實施方案中，細胞群體是包含含有如本文描述的重組表達載體的宿主細胞的克隆群體。
[0048]根據另外的實施方案，宿主細胞是哺乳動物細胞，優選地肝細胞或源自其的細胞系。
[0049]根據實施方案，本發明提供了與在SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列或與其互補序列特異性雜交的分離的核酸分子。在另一個實施方案中，與在SEQ ID N0:1中展示的核苷酸序列或與其互補序列特異性雜交的分離的核酸分子包含長度為約10和約100之間核苷酸、或具有約20、30、40、50、60、70、80和約90個核苷酸長的不同長度的寡核苷酸引物。
[0050]根據實施方案，本發明提供了用於PCR的寡核苷酸引物對，其中第一條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列特異性雜交的分離的核酸分子，且第二條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的互補序列特異性雜交的分離的核酸分子。
[0051]根據實施方案，本發明提供了由包含SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的核酸編碼的分離的多肽，該多肽具有SEQ ID N0:2的胺基酸序列。
[0052]根據實施方案，本發明提供了用於構建可被用於構建病毒粒子、偽粒子的合成的病毒基因組多核苷酸序列，包括，例如，一系列合成的HCV病毒基因組多核苷酸序列的方法，且多核苷酸序列的片段或部分可被用於許多目的，包括，例如，表位、抗原、抗體和疫苗的製備。
[0053]在一個實施方案中，用於合成合成的病毒基因組多核苷酸序列的方法通常包含以下步驟:
[0054]1.選擇用於目的病毒的適宜數目的代表性非重組基因組核苷酸序列和適宜數目的外群序列(outgroup sequences)。關於缺少代表性樣品的基因組區,轉到步驟6。
[0055]2.使用適宜的比對程序諸如 MUSCLE (Nucleic Acids Res.32:1792-1797 (2004))或ClustalX比對序列。
[0056]3.為了避免任何單個系統發生的特應性，使用適於比對的兩種系統發生信息區的Bayesian或最大似然方法(Maximum Likelihood method)重建2種獨立系統發生樹。運行足夠數目的迭代以確認用於系統發生樹的參數的收斂。
[0057]4.使用兩種系統發生樹推斷用於基因組的剩餘部分的祖先序列。用於估計的程序必須推斷祖先序列作為每一個位置的概率分布，產生關於每一個鹼基的概率(例如:MrBayes 或 Garli)。
[0058]5.以以下方式(方法I&II)推斷最終的代表性序列:
[0059]5a.關於基因組中每一個核苷酸位置i，如果兩種樹都對最大後驗概率(MPP)殘基達成一致，那麼選擇該位置的概率Pi為這兩個MPP中較大的。將這些位置定義為一致。
[0060]5b.關於每一個不一致的位置(其中MPP殘基未達成一致)，(方法I)直接轉到步驟5d或(方法II)基於兩種樹計算包含不一致位置的密碼子k的聯合概率。關於此密碼子內的一致的殘基，在前一步驟(the previous step)中計算的pi被用於計算聯合概率。
[0061]5c.選擇來自兩種樹的具有較高聯合MPP的密碼子以代表該密碼子的位置。該基於密碼子的分析分辨(resolve) 了其中密碼子中不止一個位置是不一致的情況並適應6倍簡併的密碼子。
[0062]5d.為了確定對於密碼子/核苷酸MPP的嚴格的閾值，關於MPP值的二階導數的方差小於10-6的密碼子/核苷酸MPP的分布中的拐點,被用作用於分辨密碼子/核苷酸的閾值。具有大於或等於基於任一種樹的閾值的MPP的每一個密碼子/核苷酸被視作祖先且其組成位置被定義為已分辨。
[0063]5e.協方差分析被用於檢查仍未分辨的位置。每一個位點獨立地進化的系統發生樹重建的基本假定忽略了共變和相互作用位點。為了將此類位點考慮在內，確定了鹼基對的觀察到的和預期的頻率並如方程I中顯示的計算卡方度量並調整卡方度量用於使用 Holm—Bonferroni 方法的 a =0.05 白勺多重 I:匕較(multiple comparisons using theHolm-Bonferroni method at a =0.05)。
[0064]x ij2=(oij-eij)/eij (I)
[0065]5f.使用經調整的卡方度量，鑑定了與未分辨的位置i顯著共變的所有已分辨的位置j。在正相互作用的情況下(oij>eij)，選擇包含正相互作用殘基的MPP密碼子/核苷酸。關於負相互作用(oij〈eij)，淘汰具有負相互作用鹼基的所有密碼子/核苷酸並從剩餘部分中選擇MPP密碼子。
[0066]5g.在仍未分辨的位點處，選擇MPP密碼子即使小於閾值(這很少有必要)。
[0067]5h.結果是代表性序列。
[0068]6.(關於缺少代表性序列樣品的基因組區)使用可用的序列，確定共有序列。
[0069]如本文所用的術語「分離的和純化的」指與其他蛋白或多肽基本上沒有締合(association)的蛋白，例如,作為通過使用抗體或其他方法已從細胞和其他汙染物中分開的天然存在的蛋白或作為重組宿主細胞培養物的純化產物。
[0070]如本文所用的術語「生物活性」指具有天然存在的分子的結構、調節或生物化學功能的酶或蛋白。
[0071]在特定實施方案中，如本文所用的胺基酸序列的「功能變體」，指目的序列中不超過一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸取代。功能變體保持通常與該胺基酸序列相關的至少一種生物活性。在特定實施方案中，功能變體保持通常與全長胺基酸序列相關的至少約40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%或更多的生物活性。在其他的實施方案中，功能變體是與本文公開的多肽序列(或其片段)至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%或98%相似的胺基酸序列。
[0072]根據實施方案，本發明提供了 HCV假病毒粒子，該HCV假病毒粒子包含a) SEQ IDNO:1的核心序列的最後27個胺基酸、隨後為El和E2區的胺基酸序列；和b)報告元件。根據另一個實施方案，該假病毒粒子包含螢光素酶多蛋白或其功能部分作為報告元件。
[0073]HIV容易與許多不同病毒的包膜蛋白形成假型或偽粒子。特別地，具有天然HCV El和E2糖蛋白的HIV偽粒子針對人肝癌細胞系Huh-7和PLC/PR5具有感染性。顯著地，感染性是PH依賴的且可被一些E2特異性的mAb中和。可通過用等量的表達病毒gp的表達質粒或空載體和包膜缺陷(envelope-defective)的pNL4.3.Luc.R-E-前病毒基因組共轉染293-T細胞產生HCV假病毒粒子。
[0074]根據實施方案，本發明提供了包含編碼由SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列編碼的多肽的15至100之間的連續的胺基酸的多核苷酸分子的HCV抗原，或其部分或片段。在另一個實施方案中，本發明提供了包含具有SEQ ID NO:2的胺基酸序列的多肽的HCV抗原，或其部分或片段。在一個或多個另外的實施方案中，本發明的HCV抗原包含編碼來自SEQID NO: 2的多肽的核心、El和/或E2區的胺基酸的多核苷酸分子，或其部分或片段。
[0075]根據實施方案，本發明提供了治療HCV感染的受試者的方法，該方法包括以足夠刺激受試者中針對抗原的免疫應答的量向受試者施用包含以上描述的抗原的藥物組合物，如此以致免疫應答足夠減少受試者中HCV的病毒載量。
[0076]為了本發明的目的，被施用的本發明的疫苗組合物的量或劑量應足夠刺激受試者的免疫應答，該免疫應答經合理的時間範圍將減少受試者中HCV的病毒載量。將通過特定藥物製劑的效力和受試者中靶細胞群的位置及待被治療的受試者的體重確定劑量。
[0077]在另一個實施方案中，術語「施用」指將本發明的至少一種或多種藥物組合物引入受試者，優選接受用於疾病的治療的受試者，且允許至少一種或多種組合物與具有體內目的靶基因的一個或多個疾病相關的細胞或細胞群接觸。
[0078]如本文所用的，術語「治療」及源自其的詞，包括診斷性和預防性及疾患減輕性(remitative)治療。
[0079]如本文所用的，所述「受試者」指的是任何哺乳動物，包括，但不限於，齧齒目(Rodentia)哺乳動物，諸如小鼠和倉鼠，和兔形目的哺乳動物，諸如兔。優選的哺乳動物來自食肉目(Carnivora),包括貓科動物(Felines)(貓)和犬科動物(Canines)(狗)。更優選的哺乳動物來自偶蹄目(Artiodactyla),包括牛科動物(Bovines)(牛)和豬科動物(Swines)(豬(pig))或奇蹄目，包括馬科動物(Equines)(馬)。最優選的哺乳動物是靈長目、四足猴目(Ceboids)或猴目(Simoids)(猴)或類人猿目(Anthropoids)(人和猿)。特別優選的哺乳動物是人。
`[0080]在另外的實施方案中，本發明的藥物組合物可與已知能夠治療以上所討論的病症或疾病的一種或多種另外的治療活性劑組合被使用。例如，所描述的本發明的組合物可與一種或多種已知的治療活性劑組合被使用以治療疾病或病症，諸如HCV感染。能夠在本發明的藥物組合物中容易被組合的其他治療活性劑的非限制性實例是酶促核酸分子、變構的核酸分子、反義核酸分子、誘館(decoy)核酸分子或適體核酸分子、抗體諸如單克隆抗體、小分子和其他有機和/或無機化合物包括金屬、鹽和離子。
[0081]根據實施方案，本發明提供了與SEQ ID NO:1中展示的核酸分子或其部分或片段、或具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的分離的多肽或其部分或片段特異性結合的抗體或其抗原結合部分。
[0082]本發明提供了針對包括，例如，核心、El和/或￡2、吧2、吧3、吧4、吧5和它們的亞基的任何HCV多肽或蛋白和其片段的單克隆抗體。在實施方案中，抗體是人抗體分子或人源化抗體分子。
[0083]根據又另一個實施方案，用可檢測的標記物標記抗體。
[0084]功能變體包括，但不限於，在一級結構序列方面基本上相似但包含例如未在親本結合分子中發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。此類修飾除了其他的以外包括乙醯化、醯化、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化，等
坐寸o
[0085]與抗原上的表位結合的抗體片段或抗原可結合片段的非限制性實例包括以下:Fab片段、F(ab)2片段、Fab'片段、由F(ab)表達文庫產生的片段、F(ab' )2片段、Fd片段、Fd'片段和Fv片段。抗體可以是人抗體，或來自除了人之外的動物，優選哺乳動物，諸如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊和豬。優選的是小鼠單克隆抗體和其抗原結合片段或部分。另外，本發明包括嵌合抗體和雜交抗體。
[0086]在實施方案中，可通過在培養基，例如，包含胎牛血清的RPMI1640培養基中培養產生本發明抗體的雜交瘤獲得本發明的單克隆抗體。可選地，可通過以下獲得抗體:製備包含重鏈或輕鏈的基因，其中通過PCR方法或化學合成將編碼重鏈或輕鏈恆定區的DNA與編碼每一個可變區的DNA連接；將獲得的基因插入傳統使用的能夠表達該基因的表達載體(例如，pcDNA3.1 (Invitrogen));在宿主細胞諸如CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)或大腸桿菌(Escherichia coli)中表達該基因以製備抗體；並使用蛋白A/G柱或類似的方法從培養基中純化獲得的抗體。
[0087]此外，本發明的單克隆抗體可通過以下獲得:從用重組融合蛋白免疫的哺乳動物製備雜交瘤，所述重組融合蛋白包含任何HCV蛋白或其片段，包括例如，核心、EU E2、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基，和一種或多種其他蛋白；在細菌培養物中表達融合蛋白；從細菌裂解物中純化融合蛋白；將包含任何HCV蛋白或其片段的純化的融合蛋白與佐劑混合併用純化的融合蛋白接種哺乳動物。三周之後，給予接種的哺乳動物一次加強的接種並隨後，在加強接種後三天收集脾細胞和淋巴細胞。將淋巴細胞和脾細胞與鼠B細胞雜交瘤細胞，諸如SP2/mIL6細胞(ATCC)融合，並根據製造商的說明，使用HFCS補充物(Roche)增殖。隨後篩選雜交瘤與不同種類的重組HCV蛋白或其片段的反應性。
[0088]本發明的範圍包括綴合物，例如，包含任何本發明的單克隆抗體(包括任何其功能部分或變體)、宿主細胞、宿主細胞群體、或抗體、或其抗原結合部分的生物綴合物。綴合物，及通常合成綴合物的方法是本領域已知的。見，例如，Hudecz, F.,Methods Mol.Biol.，298:209-223 (2005)和 Kirin 等人，Inorg.Chem.，44 (15): 5405-5415 (2005)。
[0089]抗體可以是本領域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如,抗體可以是任何同種型，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM,等。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。抗體可以是天然存在的抗體，例如，從哺乳 動物，例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人，等中分離和/或純化的抗體。可選地，抗體可以是基因改造的抗體，例如，人源化抗體或嵌合抗體。抗體可以呈單體或聚合體形式。抗體還可具有對於包括，例如，核心、El、E2、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基的任何HCV多肽或蛋白和其片段的任何水平的親和力或親合力。
[0090]測試抗體結合任何HCV蛋白或其片段的能力的方法是本領域已知的並包括任何抗體抗原結合分析，諸如，例如，放射免疫分析(RIA)、ELISA、蛋白印跡、免疫沉澱反應和競爭性抑制分析(見，例如，下文的Janeway等人和美國專利申請公布號2002/0197266A1 )。
[0091]製備抗體的適合的方法是本領域已知的。例如，在，例如K6hler和Milstein, Eur.J.1mmunol.，5: 511-519 (1976), Harlow 和 Lane (編者)，Antibodies: A LaboratoryManual, CSH Press (1988),和 C.A.Janeway 等人(編者),Immunobiology,第 5 版，GarlandPublishing, New York, NY(2001))中描述的標準雜交瘤方法。可選地，其他方法，諸如EBV-雜交瘤方法(Haskard 和 Archer, J.1mmunol.Methods, 74 (2): 361-67 (1984)，和 Roder等人，Methods Enzymol.，121:140-67 (1986)),和曬菌體載體表達系統(見,例如,Huse等人，Science, 246:1275-81 (1989))是本領域已知的。此外，在例如，美國專利5，545，806、5，569，825和5，714，352和美國專利申請公布號2002/0197266A1中描述了在非人動物中製備抗體的方法。
[0092]可通過針對特定重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因轉基因的轉基因小鼠製備抗體。此類方法是本領域已知的並在，例如，美國專利5，545，806和5，569，825和前述的Janeway等人中描述。
[0093]用於產生人源化抗體的方法是本領域眾所周知的並在，例如，前述的Janeway等人，美國專利5，225，539,5, 585，089和5，693，761中被詳細描述。還可使用美國專利5，639，641 和 Pedersen 等人，J.Mol.Biol.，235:959-973 (1994)中描述的抗體表面重塑技術產生人源化抗體。
[0094]可使用常規重組DNA技術工藝(DNA technology technique)產生單鏈可變區片段(sFv)抗體片段，其由包含通過合成肽與抗體輕鏈的V域連接的抗體重鏈的可變(V)域的截短的Fab片段組成(見，例如，前述的Janeway等人)。相似地，可通過重組DNA技術製備二硫鍵穩定的可變區片段(dsFv)(見，例如，Reiter等人，ProteinEngineering, 7:697-704(1994))。然而,本發明的抗體片段不限於抗體片段的這些示例性類型。
[0095]在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段被修飾以包含可檢測的標記物，諸如，例如，放射性同位素、螢光團(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE))、酶(例如，螢光素酶、鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)和元素粒子(例如，金或磁粒子)。
[0096]通過動物、化學合成或重組表達製備本發明的抗體分子之後，可通過本領域已知的用於免疫球蛋白分子的純化的任何方法純化抗體分子，例如，通過層析法(例如，離子交`換、親和力、蛋白A/G免疫沉澱反應層析法和膠柱層析)、離心法、差別溶解度或通過用於蛋白純化的任何其他標準技術。另外，本發明的抗體或其片段可被融合至本文描述的或本領域另外已知的異源多肽序列，以便於純化。
[0097]可採用本發明的抗體製備抗原抗體親和柱，其可被用於抗原的純化。例如，可用多種化學化合物，例如，溴化氰、N-羥基琥珀醯亞胺酯活化凝膠支持體或珠，且抗體可與其結合。更特別地，且舉例來說，可將抗體加至Affigel-10 (BioRad, Hercules, CA),用N-輕基琥珀醯亞胺酯活化的一種凝膠支持體，如此以致抗體與瓊脂糖凝膠珠支持體形成共價連鍵。隨後，用間隔臂(spacer arm)可將抗體通過醯胺鍵耦合至凝膠。隨後用乙醇胺HC1，1M，PH8，猝滅剩餘的經活化的酯。用水洗滌柱，隨後通過0.23M甘氨酸HC1，pH2.6洗滌柱以去除任何未綴合的抗體或異物蛋白(extraneous protein)。隨後在具有適合的洗漆劑的磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)，pH7.3中平衡柱，且樣品物質，即，細胞培養物上清液或細胞提取物，例如，包含癌症特異性抗原的細胞培養物上清液或細胞提取物(例如，使用適合的膜增溶的表面活性劑製備)緩慢經過柱。用PBS/表面活性劑洗滌柱直至光學密度降落至背景水平。隨後用0.23M的甘氨酸-HCl、pH2.6/表面活性劑從柱洗脫蛋白。隨後針對PBS/表面活性劑透析純化的抗原。
[0098]本發明進一步提供了檢測宿主中HCV存在的方法和治療或預防HCV感染宿主的方法。檢測宿主中HCV存在的本發明的方法包含(i)將包含宿主細胞的樣品與本文描述的任何本發明的抗體或其抗原結合片段接觸，從而形成複合物，和(ii)檢測複合物，其中複合物的檢測指示宿主中HCV感染的存在。
[0099]根據實施方案，本發明提供了測試樣品以確認樣品中HCV存在的方法，該方法包含檢測樣品中與本文描述的抗體特異性結合的多肽的存在。
[0100]本發明還提供了用於定位受試者中HCV感染的細胞的方法，HCV感染的細胞特別是表達核心、El、E2、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基和其片段的細胞，該方法包括:Ca)向受試者施用本發明的可檢測標記的單克隆抗體或其結合片段；(b)允許可檢測標記的(例如,放射性標記的；螢光染料標記的或酶標記的,例如,通過ELISA)單克隆抗體或其結合片段與受試者中被感染的細胞結合；和((3)確定經標記的單克隆抗體或其結合片段在受試者中的定位。
[0101]在另外的實施方案中，可用可檢測部分標記本發明的抗體，可檢測部分諸如螢光團、發色團、放射性核素、化學發光劑、生物螢光劑和酶。
[0102]在實施方案中，使用本領域已知的並經實踐的操作說明和技術，用此類試劑標記本發明的抗體。見，例如，Wenzel和Meares, Radioimmunoimagingand Radio immunotherapy, Elsevier, New York, (1983) ；Colcer 等人，Meth.Enzymol.，121:802-816(1986) jPMonoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy, Baldwin 等人，(編者)Academic Press, 303-316 (1985),關於抗體的放射性標記的技術。
[0103]在實施方案中，腸胃外遞送抗體或其結合片段，諸如通過靜脈內、皮下或腹膜內施用，例如，注射。為了適合的儲存期和用於施用的相容性，可將本領域已知的適合的緩衝液、載體和其他成分用於配製包含抗體或片段的組合物。這些物質可包括輔助劑諸如緩衝劑和蛋白穩定劑(例如，多糖)。 [0104]更特別地，通過將具有期望純度的抗體或它們的結合片段與任選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版，(編者)A.0sol, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985))混合製備抗體或其結合片段的治療製劑用於呈凍幹形式或呈水溶液形式的儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑以所採用的劑量和濃度對接受者是無毒的，並包括緩衝液諸如磷酸、檸檬酸和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(例如，約10-15個胺基酸殘基或更少)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑諸如EDTA ;糖醇諸如甘露醇或山梨醇；鹽形成抗衡離子諸如鈉；和/或非離子表面活性劑諸如TWEEN? (多乙氧基醚)、PLUR0NICS? (環氧乙烷(EO)和環氧丙烷(PO)的嵌段共聚物)或聚乙二醇(PEG)。還可將抗體或其結合片段捕獲在製備的微膠囊中，例如通過凝聚技術或通過界面聚合(例如，分別地，羥甲基纖維素或明膠-微米膠囊和聚-[甲基丙烯酸甲酯]微米膠囊)、捕獲在膠質藥物遞送系統中(例如，脂質體、白蛋白微米球、微米乳液、納米粒子和納米膠囊)或捕獲在粗乳液中。此類技術在前述的Remington’s PharmaceuticalSciences中被公開。
[0105]待被用於體內施用的抗體或它們的結合片段必須是無菌的。這通過在凍幹和重構之前或之後通過無菌濾膜的過濾容易實現。抗體或其結合片段通常將呈凍幹形式或在溶液中儲存。
[0106]通常將治療抗體組合物放置在具有無菌進入孔的容器中，例如，具有被皮下注射針刺破的塞的靜脈注射用溶液袋或小瓶。根據本發明的抗體或其結合片段的施用途徑是根據已知的方法，例如，通過靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、皮下、病灶內途徑的注射或輸注，通過霧化吸入或鼻內途徑或通過如以下提到的緩釋系統施用。通過輸注或通過快速濃注(bolus injection)連續施用抗體或其結合片段。緩釋製品的適合的實例包括包含蛋白的固體疏水性聚合物的半滲透基質，該基質呈成形的物品(shaped article),例如，膜或微米膠囊形式。緩釋基質的實例包括，如由Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15:167-277(1981)和 Langer, Chem.Tech.，12:98-105(1982))描述的聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯))或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美國專利號3，773，919)、L-穀氨酸和Y L-穀氨酸-乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers, 22:547-556(1983))、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人，前述)、可降解的乳酸乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT?(由乳酸乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)組成的可注射的微米球)和聚-D-(-) -3-羥丁酸(EP133，988)。
[0107]待被治療上採用的抗體的有效量將取決於，例如治療和處理目的、施用的途徑、經受處理或治療的患者年齡、病症和體重和向患者提供的輔助或輔佐治療。因此，如有需要，從業者測定劑量滴度並修改施用途徑以獲得最佳的治療效果將是必要並常規的。典型的每日劑量可從約lmg/kg至直至約100mg/kg或更多的範圍，優選從約0.lmg/kg/天至約IOmg/kg/天，取決於以上提及的因素。典型地，臨床醫師將施用抗體直至到達獲得預期效果的劑量。通過傳統分析容易監測該治療的進展。
[0108]多種佐劑可被用於增加對抗原或疫苗的免疫應答並引起根據本發明的特異性抗體。取決於待被免疫的宿主種類，佐劑可包括，但不限於，弗氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠、諸如氫氧化招，表面活性劑，諸如溶血卵磷脂、複合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔蟲戚血蘭素(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基苯酹和潛在有用的人用佐劑諸如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
[0109]本發明的抗體用於檢測HCV感染的具有對這些抗體特異性的抗原的細胞的體外診斷應用也是有用的。如以上詳細描述的，體外診斷方法包括HCV感染的細胞(例如，在人組織上或從切離的樣本分離的細胞上)的免疫組織或免疫組織化學檢測、或HCV相關抗原的血清學檢測(例如，血液樣品或其他生物體液中)。免疫組織化學技術包括用本發明的一種或多種抗體染色生物樣本，諸如組織樣本，並隨後檢測樣本上包含與相應抗原結合的抗體的抗體-抗原複合物的存在。樣本中此抗體-抗原複合物的形成指示組織中HCV感染的存在。
[0110]可使用本領域已知的技術諸如免疫酶技術，例如，免疫過氧化物酶染色技術、或抗生物素蛋白-生物素技術、或免疫螢光技術實現樣本上抗體的檢測(見，例如，Ciocca等人，Meth.Enzymol.，121:562-79(1986)和 Introduction to Immunology,(第 2 版)，113-117, Macmillan Publishing Company (1986))。血清學診斷技術包括已被分泌或「脫落」進入被認為患有癌症的患者的血清或其他生物體液的腫瘤相關抗原的檢測和定量，如以上提及的。可使用本領域已知的技術，諸如放射性免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測體液中的此類抗原，其中抗體與脫落抗原的反應性被用於檢測體液樣品中該抗原的存在(見，例如，Uotila 等人,J.1mmunol.Methods, 42:11 (1981)和 Fayed 等人，Disease Markers, 14:155-160(1998))。
[0111]在實施方案中，本發明提供了使用ELISA分析檢測來自受試者的生物樣品中對HCV蛋白特異性的循環血清抗體的方法，該方法包括:(a)將具有對HCV蛋白、或所述蛋白的至少一個片段特異性的至少一種抗體的所述至少一種生物樣品與HCV蛋白或其片段接觸，和(b)檢測HCV蛋白或其片段和生物樣品中存在的HCV特異性抗體或其片段之間的抗原-抗體複合物的形成。
[0112]被用於本發明情況中的一種抗體(antibody)或多種抗體(antibodies)本身可與可檢測的標記物連接。此可檢測的標記物允許初始免疫複合物的存在或初始免疫複合物的量被確定。可選地，可通過具有針對第一抗體的結合親和力的第二結合配體檢測結合在初始免疫複合物內的第一添加的成分。在這些情況中，第二結合配體本身通常是抗體，其可被稱為「第二」抗體。持續足夠允許二級免疫複合物形成的一段時間將初始免疫複合物與標記的第二結合配體或抗體接觸。隨後洗滌二級免疫複合物以去除任何非特異性結合的標記的第二抗體或配體，並隨後檢測該二級免疫複合物中剩餘的標記物。
[0113]在實施方案中，提供了檢測患者中HCV感染的存在和程度的方法，該方法包括:確定來自該患者的體液或組織切片的樣品中抗原的水平並將抗原的量與該受試者中感染的存在和程度關聯。在一個實施方案中，通過以下檢測抗原:(1)將對核心31、￡2、吧2、吧3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基和其片段特異性的單克隆抗體添加至樣品或組織切片；(2)添加與過氧化物酶綴合的山羊抗-小鼠IgG抗體；(3)用二氨基聯苯胺和過氧化物固定，和(4 )檢查樣品或切片，其中紅棕色顏色指示細胞具有該抗原。
[0114]在另一個實施方案中，本發明提供了使用核心、El、E2、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基和其片段的IOkD重組形式製備親和純化的多克隆抗體的方法。將常見的前導肽(common leader peptide)轉染進入細菌並表達前導肽,前導肽在水溶液中是適當可溶的。通常從用特定抗原免疫的山羊或兔的血清中獲得多克隆抗體，在實施方案中，抗原是核心、EU E2、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白和它們的亞基和其片段的IOkD重組形式。親和純化抗血清以去除非特異性抗體，增加靈敏性並減少背景。執行進一步的純化以去除相關動物種類中潛在的非特異性反應性，或以減少與其他重鏈和輕鏈共享的反應性。在實施方案中，用可檢測的標誌物，例如，若丹明標記純化的抗體。使用本領域已知的方法，使用經固定並在石蠟中包埋的組織樣品，將純化的多克隆抗體用於檢測抗原。
[0115]另外的方法包括通過兩步法檢測初始免疫複合物。具有針對第一抗體的結合親和力的第二結合配體諸如抗體被用於形成二級免疫複合物，如以上描述的。洗滌之後，持續足夠允許免疫複合物(三級免疫複合物)形成的時間段，將二級免疫複合物與具有針對第二抗體的結合親和力的第三結合配體或抗體接觸。第三配體或抗體與可檢測的標記物連接，允許檢測因此形成的三級免疫複合物。
[0116]可通過注射或通過隨時間推移的逐漸的灌注腸胃外施用本發明的單克隆抗體。可靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、腔內或經皮單獨地或與效應細胞組合施用本發明的單克隆抗體。用於腸胃外施用的製品包括無菌的水溶液或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、和可注射的有機酯諸如油酸乙酯。水載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內媒介物包括液體和營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖的補充劑)和類似的補充劑。還可存在防腐劑和其他添加劑，諸如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，等等。
[0117]在實施方案中，根據本發明的單克隆抗體或其結合片段被用於定量或定性檢測多種皮膚或其他細胞上或中任何HCV蛋白或其片段的存在。這可通過例如採用螢光標記的抗體的免疫螢光技術，與光學顯微術、流式細胞術或螢光計檢測結合實現。另外，根據本發明的抗體或其結合片段可另外在如免疫螢光、免疫電子顯微術或非免疫分析中被組織學上採用，用於細胞上的癌症特異性抗原的原位檢測，諸如用於在監測、診斷或檢測分析中使用。[0118]在又另一個實施方案中，通過從患者中移出組織學樣本並向其應用根據本發明的標記的抗體實現原位檢測。優選通過將標記的抗體或片段覆蓋在生物樣品上應用抗體或其抗原結合片段。通過使用此程序，不僅檢測抗原或保守的變體或肽片段的存在是可能的，而且檢測其在被檢查的組織中的分布也是可能的。本領域普通技術人員將容易認識到廣泛的多種組織學方法中的任一種，例如，染色程序，可被修改以實現此原位檢測。
[0119]在本發明的免疫分析中，可將生物樣品與能夠固定細胞、細胞粒子、膜或可溶性蛋白的固相支持體或載體諸如硝酸纖維素或其他固體支持體或基質接觸，並將固定在其上。隨後用適合的緩衝液洗滌支持體，隨後用可檢測標記的抗體處理支持體。隨後用緩衝液第二次洗滌固相支持體以去除未結合的抗體。隨後通過傳統的方法檢測固體支持體上結合的標記物的量。因此，在本發明的另一個實施方案中，提供了包含與固相支持體結合的單克隆抗體或其結合片段的組合物，諸如本文描述的。
[0120]固相支持體或載體或基質指能夠結合抗原或抗體的任何支持體。眾所周知的支持體或載體包括玻璃、塑料、尼龍毛、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、右旋糖、尼龍、澱粉酶、膜、樹月旨、天然的和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖、氧化鋁凝膠、輝長巖和磁石。為了本發明的目的，載體的性質某種程度上可以是可溶的或不可溶的。支持體物質可具有幾乎任何可能的結構構型，只要被耦合的分子能夠與抗原或抗體結合。因此，支持體構型可以是球形的、如呈珠狀，圓柱形的、如呈試管的內表面或棒(rod)的外表面狀。可選地，表面可以是平的，諸如薄片、膜、測試條、棒(stick),等等。
[0121]在實施方案中，固體支持體針對用於結合的反應條件是惰性的並可具有反應基團或活化的基團以附著單克隆抗體、抗體的結合片段或結合配偶體。固相支持體作為層析支持體也可以是有用的，諸如碳水化合物聚合物SEPHAR0SE? (交聯的瓊脂糖珠)、SEPHADEX?(交聯的葡聚糖凝膠)或瓊脂糖。事實上，用於結合抗體或抗原的大量的此類支持體是商業可得的並是本領域技術人員已知的。
[0122]可通過眾所周知的方法確定針對給定的抗體的結合活性。關於本發明的癌症特異性抗體，可檢測地標記此類蛋白分子的許多方式是本領域已知的並經實踐的。例如，在實施方案中，可通過將抗體與酶連接可檢測地標記抗體，例如，用於在酶免疫分析(EIA)中使用(Voller 等人，Diagnostic Horizons, 2:1-7 (1978) ;Butler 等人，Meths.Enzymol.，73:482-523 (1981))。與抗體結合的酶與適合的底物、優選地顯色底物反應，以產生例如通過分光光度法、螢光計或通過視覺檢測方法可被檢測的化學部分。可被用於可檢測地標記抗體的酶的非限制性實例包括蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、6 -5-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、a -磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶和乙醯膽鹼酯酶。可通過採用針對酶的顯色底物的色覺檢查(chromometric)方法或通過與相似地製備的標準品或對照相比，底物的酶促反應的程度的視覺比較實現該檢測。
[0123]還可使用螢光化合物標記本發明的抗體或它們的抗原結合片段。當將螢光標記的抗體暴露於適合波長的光時，那麼抗體的存在可由於突光而被檢測。一些最常用的突光標記化合物包括螢光素異硫氰酸酯、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和突光胺。
[0124]在可選的實施方 案中，還可通過將它們耦合至化學發光化合物可檢測地標記本發明的抗體。隨後通過檢測化學反應的過程期間形成的發光的存在確定加化學發光標籤抗體的存在。特定有用的化學發光標記化合物的實例包括，不限於，魯米諾、異魯米諾、熱性吖啶鐵酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、n丫唳鹽和草酸酯。類似地，生物發光化合物可被用於標記本發明的抗體。生物發光是生物系統中發現的化學發光的一種類型，其中催化蛋白增加了化學發光反應的效率。通過檢測發光的存在確定生物發光蛋白的存在。有用的生物發光標記化合物包括螢光素、螢光素酶和水母發光蛋白。
[0125]以下的實施例進一步闡述了本發明，但，當然不應被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。
實施例 [0126]人受試者。TheBaltimore Before and After Acute Study of Hepatitis(BBAASH)定群(cohort)是處於C型肝炎感染危險中的人的前瞻性研究。合格的參與者具有靜脈內藥物使用的歷史或進行中的靜脈內藥物使用並在入選時對抗-HCV抗體是血清反應陰性的。獲得來自每一名參與者的書面同意。入選之後，參與者接受諮詢(counseling)以減少靜脈內藥物使用和其併發症。在設計用於每月隨訪的方案中，抽取血液用於分離血清、血漿和外周血單核細胞(PBMC)。患有急性HCV感染的參與者轉院(refer)進行治療的評價。該研究獲得約翰霍普金斯醫學院(Johns Hopkins School of Medicine)的機構審查委員會(Institutional Review Board)的批准。
[0127]合成編碼序列的重建。包括多蛋白的至少完整的開放閱讀框、從人樣本中獲得且非流行病學冗餘的HCV亞型la (n=390)和Ib (n=296)序列下載自GenBank (登錄號AB016785、AB049087-101、AB154177、AB154179、AB154181、AB154183、AB154185、AB154187、AB154189、AB154191、AB154193、AB154195、AB154197、AB154199、AB154201、AB154203、AB154205、AB191333、AB249644、AB429050、AF009606、AF139594、AF165045、AF165047、AF165049、AF165051、AF165053、AF165055、AF165057、AF165059、AF165061、AF165063、AF176573、AF207752-74、AF208024、AF313916、AF356827、AF483269、AF511948-50、AJ000009、AJ132996-97、AJ238799-800、AJ278830、AY045702、AY460204、AY587844、AY615798、AY695437、AY956463-8、D10749、D10934、D11168、D14484、D50480-82、D63857、D85516、D89815、D89872、D90208、DQ071885, DQ838739, EF032883、EF032886、EF032892、EF032900、EF407411-57、EF407458-504、EF621489、EF638081、EU155213-16、EU155217-35、EU155233、EU155236-381、EU234061、EU234063-65、EU239713、EU239714、EU239715-17、EU255927-99、EU255960-2、EU256000-1、EU256002-97、EU256045、EU256054、EU256059、EU256061-2、EU256064-6、EU256075-103、EU256104、EU256106-7、EU260395-6、EU362882、EU362888-90U EU362911、EU482831-2、EU482833、EU482834-89、EU482839、EU482849、EU482859、EU482860、EU482874、EU482875、EU482877、EU482879-81、EU482883、EU482885-6、EU482888、EU529676-81、EU529682、EU569722-23、EU595697-99、EU660383-85、EU660386、EU660387、EU660388、EU677248、EU677253、EU687193-95、EU857431、EU862823-24、EU862826-27、EU862835、FJ024086、FJ024087、FJ024274-76、FJ024277、FJ024278、FJ024279、FJ024280-82、FJ181999-201、FJ205867-69、FJ390394-95、FJ390396-8、FJ390399, FJ410172, L02836、M58335、M84754、U01214、U16362、U45476、U89019、X61596)。[0128]在下文中，為了描述本發明的目的，將390條亞型Ia序列數據集稱為「原始數據集」。使用 MUSCLEv3.0 (Nucleic Acids Res.32:1792-1797 (2004))比對序列並使用 BioEditv7.0.5.3108(mbi0.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/BIOEDIT/bioedit.html (2005年2月20日訪問))修飾序列。為了避免任何單個系統發生的特應性，我們使用允許系統發生重建和祖先序列重建作為概率分布的軟體程序，例如，應用於來自全基因組比對的位置 869-1292 (核心/El)和 8276-8615 (NS5B)的 MrBayesv3.2 (Bioinformaticsl9:1572-1574(2003))構建了 2種獨立的系統發生樹(位置編號基於參考基因組H77 ；Genbank登錄號AF009606)。選擇這些區段是因為它們被證明最具系統發生信息。在下文，它們在本發明中被稱為「Simmonds」區。運行MrBayeSV3.2的3千萬次迭代並確認關於使用Tracervl.5 (Rambaut A,可從作者獲得，[beast, bi0.ed.ac.uk/Tracer])從兩個 Simmonds區推斷的系統發生樹的參數的收斂。兩個Simmonds區產生不同的樹，由於大量的可能的樹，這是預料之中的；儘管如此，這兩個數據集的分析以相似的模型參數收斂在一起。另外，HCV中的重組是罕見的。因此，可假定相同的系統發生樹或相同的進化歷史對基因組的全長都將是正確的。
`[0129]使用用Simmonds區重建的兩種系統發生樹,推斷了關於每一個HCV-1a編碼區的祖先序列。獲得祖先序列作為每一個位置的概率分布，如此以致存在觀察每一個鹼基的概率(probability of observing each base)。
[0130]合成的HCV基因組的計算準備。使用本發明的方法的實施方案衍生了 Bolela。
[0131]1.關於基因組中每一個核苷酸位置i，如果兩種樹對最大後驗概率(MPP)殘基達成一致，那麼選擇該位置的概率Pi為兩個MPP中較大的。將這些位置定義為一致。
[0132]2.關於不一致的位置(其中MPP殘基未達成一致)，基於兩種樹，將含有不一致位置的密碼子k的聯合概率指定為Pck(核心-El)和pck(NS5B)。關於此類密碼子內一致的殘基，在前一步驟中計算的Pi被用於計算聯合概率。
[0133]3.選擇來自兩種樹的具有較高的聯合MPP的密碼子代表該密碼子位置。這一基於密碼子的分析分辨了其中密碼子中不止一個位置是不一致的情況並適應6倍簡併的密碼子。
[0134]4.為了確定用於密碼子MPP的嚴格的閾值，關於MPP值的二階導數的方差小於10_6的密碼子MPP的分布中的拐點，被發現為0.9837，對應於單個殘基MPP>0.99。
[0135]5.基於任一種樹，具有大於或等於0.9837的MPP的每一個密碼子被接受作為祖先且其組成位置被定義為已分辨。
[0136]6.協方差分析被用於檢查仍未分辨的位置。每一個位點獨立地進化的系統發生樹重建的基本假定忽略了共變和相互作用位點。為了將此類位點考慮在內，確定了鹼基對的觀察的和預期的頻率並如方程I中顯示的計算卡方度量並調整卡方度量用於使用Holm-Bonferroni方法的a =0.05的多重比較。
[0137]X Jj- = (ojj-ejj) /ejj (I)
[0138]使用經調整的卡方度量，鑑定了與未分辨的位置i顯著共變的所有已分辨的位置j。在正相互作用的情況下(0ij>eij)，選擇包含正相互作用的殘基的MPP密碼子。關於負相互作用(QijGij),淘汰具有負相互作用鹼基的所有密碼子並從剩餘部分中選擇MPP密碼子。
[0139]7.在仍未分辨的位點處，選擇MPP密碼子即使小於0.9837(如在實例x中指出的，這很少有必要)。
[0140]5』和3』 UTR序列重建。儘管5』 UTR和3』 UTR是非編碼區，但它們在病毒的複製中是必要的。然而，在390條序列中，只有6條具有完整測序的5』 UTR區及4條具有完整測序的3』UTR區。因此，我們使用另外的序列以更好地設計非編碼區。5』-UTR(n=257)和3』-UTR(n=46)序列來自從BBAASH定群中急性感染的受試者產生的克隆序列。我們發現我們的5』UTR的90%的共有序列與源自具有完整序列的6條序列的共有序列並還與H775』UTR相同。基於由Kolykhalov等人的分類，將3』UTR序列分為4個部分。我們確定了關於第一部分的90%的共有序列，其是基因型中具有顯著可變性的短序列。關於3』 UTR的第二區段，我們確定同聚物尿嘧啶束(tract)的中值長度為51個殘基，其也是用於複製的有利的長度。我們選擇了用於第三區段的中值長度的區段，主要由U夾雜著C殘基組成的多聚嘧啶束。最後(3』末端)部分是具有98個鹼基的保守序列，關於其我們使用了用來自不相關研究的15條另外的序列確定的90%共有序列。
[0141]HCV偽粒子(HCVpp)系統。合成了編碼核心的最後27個胺基酸、隨後為El和E2區的Bolela核苷酸序列的區(Blue Heron, Bothell, WA)並隨後使用Gateway克隆技術將其亞克隆進入表達載體pcDNA3.2/V5/Dest (Invitrogen, Carlsbad, CA)。在克隆之後將E1E2區測序並顯示無錯誤。如描述的產生包含螢光素酶報告基因的偽粒子(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.AlOO: 7271-7276 (2003) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.AlOl: 10149—10154 (2004)；Clin.1nfect.Dis.41:667-675(2005))。簡要地，將表達 Bolela E1E2 的質粒與包含包膜缺陷的(env-defective) HIV前病毒基因組和螢光素酶報告基因的pNL4_3.Luc.R-E-質粒一起共轉染進入HEK293T細胞。在轉染後48和72小時收集包含HCVpp的上清液。與表達Bolela E1E2的偽粒子並 行製備表達來自H77和來自另一個亞型la HCV病毒(ppla46)的E1E2糖蛋白的偽粒子和不表達E1E2的偽粒子(模擬對照)用於感染性的比較。持續5小時使用連續兩倍稀釋的偽粒子感染96孔板的重複的孔(duplicate wells)中的Hep3B肝癌細胞，隨後更換培養基，並在感染後72小時測量螢光素酶活性。用Cell Culture LysisReagent (Promega, USA)裂解細胞並使用 Luciferase Assay Reagent (Promega, USA)和Centro LB960Chemiluminometer (Berthold, Germany)測量螢光素酶活性。
[0142]⑶81阻斷實驗。於37°C持續I小時將Ifep3b細胞與小鼠抗-人⑶81單克隆抗體(100 u g/ml,克隆 1.3.3.22，Santa Cruz Biotechnology)或小鼠 IgGl 同種型對照(SantaCruz Biotechnology, USA) 一起孵育，並如以上評價HCVpp感染。
[0143]被人血漿中和。熱滅活的血漿或血清經包含10%FBS的MEMl:4稀釋，並於37°C持續I小時與每一個文庫HCVpp —起孵育(最終HCVpp稀釋，1:100)，添加至96孔板的重複的孔中的Hep3b肝癌細胞並於37°C持續5小時孵育，隨後更換培養基。如以上測量螢光素酶活性。以相對光單位(RLU)測量在血漿或血清樣品存在下的HCVpp感染(RLU測試)對在正常人血清(Gemini Bio-Products, West Sacremento, CA)和匯集自血清反應陰性的BBAASH參與者的血漿存在下的平均感染(RLU對照)。中和百分數計算為[1-(RLU測試/RLU對照)]xlOOo
[0144]多樣性分析。使用VarPlot 版本 1.2 (從作者在 sray.med.som.jhm1.edu/scroftware/VarPlot可得)產生多樣性圖。使用20個密碼子的窗口大小(以反映T細胞表位的上限)和I的步長產生圖。使用Nei和Gojobori模型計算非同義(Nonsynonymous)和同義(synonymous)距離(Mol.Biol.Evol.3:418-426 (1986))。使用 VisSPAvl.6 (sray.med.som.jhm1.edu/SCRoftware/VisSPA/)繪製 E1E2 像素比對(圖 2b)。[0145]Bolela基因組序列已被儲存在Genbank中登錄號#JQ791196下。
[0146]實施例1
[0147]El和NS5B區的樹產生在比對中9992個核苷酸位點的9763個處一致(~98%)的祖先序列(缺口算作字符)。將為0.9837或更高的MPP的密碼子閾值應用在剩餘68/3012(2.2%)未分辨的密碼子的任一樹中。在這68個未分辨的密碼子中，42個是在同義密碼子之間的選擇，並且26個是在非同義密碼子之間的選擇。協方差網絡(network)被用於分辨歧義(ambiguities)。
[0148]實施例2
[0149]共變位置。在這68個未分辨的密碼子中，4個是基於與基因組中已分辨的位置的依賴關係而確定(H77位置1157、1611、2120和6554)。所有的四個位置(1157、1611、2120和6554)都導致同義變化。位置1611和6554與跨基因組的多個位點(分別地50和3)連鎖，而位置1157和2120與另一個分辨的位置連鎖。由於協方差僅是統計檢測，生物相互作用是關於以後研究的一個問題。
[0150]實施例3
[0151]Bolela的代表性特徵。確定Bolela的完整的代表性序列之後，預期確保Bolela代表核苷酸或蛋白HCV亞型Ia序列的任何組而非僅代表來自重建其的序列。為了確認這一點，兩個另外的數據集被用於確認。第一數據集來自Yusim等人(J.Gen.Virol.91:1194-1206(2010))的文章並收集自Los Alamos HCV資料庫。該數據集包含143條序列，其中136條存在於原始數據集中；然而，該報導的作者矯正(curate)該數據集以避免重複取樣連鎖序列。該數據集被稱為Yusim數據集。被稱為E1E2數據集的第二個數據集，包含214條E1E2序列；這些序列獲自我們正在進行的BBAASH定群。後一個數據集中的序列與GenBank中或來自LANL資料庫的任何全長序列都不相關。鄰接樹(neighbor joiningtrees)顯示Bolela —致地從中心分支,表明其代表Yusim和E1E2兩種數據集(圖1)。
[0152]基於全基因組成對比較，Bolela具有與亞型Ia序列比與原始數據集中任何其他序列更大的相似性(非同義距離中平均值和中值分別下降39%和44%，圖2a)。在跨越基因組的20個密碼子(接近T細胞表位的大小的上限)的滑動窗口中，Bolela的相似性總體大於98% (平均值和中值相似性分別為98.4%和98.9%)。不會令人驚訝的是，Bolela和亞型Ia的循環基因組之間最低的相似性在高變區I (HVRl)中，其中相似性低至73% (亞型Ia分離物(isolate)中在相同位置的相似性為64%)。將Bolela序列與原始數據集的共有序列、H77、HCV-1和Ib序列比較顯示HVR-1中的高可變性(如由星號顯示的，圖2b)。
[0153]將Bolela胺基酸序列的所有9_mer與Yusim數據集中的序列比較以展示潛在的表位覆蓋。將9-mer用於該比較是基於由作為在HCV感染的自發清除中免疫控制的關鍵組成部分的效應CD8+T細胞識別的典型的MHC I類-限制的表位長度。無論與Yusim數據集或與原始數據集比較，Bolela都提供了用於HCV多蛋白的78%準確匹配的9-mer覆蓋(數據未顯示，方法先前在Yusim中被描述)。在E1E2數據集的高度多樣化的El和E2區中，Bolela提供了 58%準確匹配的9-mer覆蓋。隨後,Yusim數據集被通過單個蛋白比較(compared byindividual proteins)並確認了高度異質區(heterogeneous region)諸如 El 和 E2 具有比更保守的區諸如核心和NS4B更少的被Bolela覆蓋。在所有情況下，Bolela都提供了大於參考序列H77的9-mer覆蓋。當在I或2個位置處的錯配是允許的時Bolela匹配全基因組比較上的所有9-mer的99%。概括地說，發現Bolela匹配基因組的每一個位置處的所有模式(最頻繁觀察到的)9_mer的95%，而Yusim數據集中單個序列具有80%的中值模式的9-mer 覆蓋(圖 3a)。
[0154]實施例4
[0155]比較9-mer覆蓋的明顯的局限性是並非所有的9-mer都被識別作為T細胞表位。為了將重點放在表位覆蓋上，從與至少一個分析中的陽性結果相關的免疫表位資料庫(www.1mmuneepitope.0rg/)中選擇所有已知的亞型la T細胞表位(⑶4和⑶8 二者)。在資料庫中的548個表位中，只有338個表位存在於Yusim數據集的至少一半的序列中(排除AF271632和AX100563由於它們分別與HCV-1和H77連鎖)。Bolela具有這338個表位的最高(100%)覆蓋(圖3b)。常用作HCV免疫學中的抗原的HCV-1和H77分別僅匹配這338個表位的317和316個(~93%)。圖3b顯示關於Yusim數據集中所有序列的表位覆蓋的分布。當存在於80%的序列中的表位被包括時，Bolela提供94%覆蓋而H77和HCV-1則分別提供87%和91%覆蓋(數據未顯示)。應注意的是因為HCV-1和H77是在這些表位源自其中的許多研究中被用作抗原的主要分離物，它們的覆蓋可能部分由於分析偏差。最終，變體表位的幹擾素Y ELISpot分析顯示Bolela基因組中的變體比包括H77和簡單的共有區的其他序列更具一致的免疫原性(數據未顯示)。
[0156]實施例5
[0157]Bolela偽粒子.當被用於假型慢病毒粒子時，測試的約75%的個體E1E2分離物具有低感染性(小於背景之上的5個標準差)(圖4)。包膜基因的多樣性極其高，20-密碼子窗口中具有36%的平均非同義多樣性(圖2)。作為該多樣性和我們的方法的結果，Bolela具有我們所檢查的基因組中唯一的HVRl 序列(ETHVTGGSAARATAGFAGLFTPGAKQN)(SEQ ID NO: 3)，且使用 BLAST (blast, ncb1.nlm.nih.gov)和 HMMER (hmmer.janeIia.0rg)檢索該妝序列未顯示任何相同的序列。為了測試功能儘管具有關於感染性的這些負預測因子(negativepredictors), Bolela的E1E2序列被用於構建慢病毒偽粒子。令人驚訝地，HCVpp-BoIeIa以與高感染性且充分被表徵的分離物HCVpp-H77可比的高效率感染Hep3B靶細胞(圖4)。用抗-⑶81抗體阻斷Bolela HCVpp導致感染性至少10倍下降(p=0.0008)而同種型對照抗體則未改變感染性(P=0.85 ;圖4)。發現低於閾值的RLU值(圖4)是重現性低的，具有高變異性。儘管亞型la HCVpp的比較組排除包含終止密碼子、移碼突變或其他明顯的缺陷的那些，明顯的是存在使得那些克隆的許多是較少感染性的其他生物或人工特徵。重要地，本實驗的目的是確定Bolela E1E2究竟是否是有功能的，儘管其合成起源和HCV包膜的高可變性；該E1E2在HCVpp系統中是感染性的是非常意外的。另外，Bolela HCVpp容易被人血清中和。觀察到30%的BBAASH受試者抑制至少85%的進入且來自BBAASH定群的90%的受試者(40中的36)抑制至少50%的Bolela HCVpp進入，而正常人血清和合併的HCV-血清反應陰性的血清是非中和的。
[0158]這一概念驗證研究顯示Bolela包膜E1E2異二聚體能夠正確摺疊並組裝。由於HCV El和E2基因對於宿主細胞進入是至關重要的，它們也是抗體介導的病毒中和的重要的靶。由於其缺少明顯的免疫驅動的逃逸突變，Bolela可代表研究HCV適合性的決定簇(determinants)的理想的平臺。
[0159]實施例6
[0160]初步分析已顯示來自Bolela的表位是測試的任何分離物中最具免疫原性的。在其中Bolela表位與傳統共有區不同的那些情況下(測試的15個中的2個)，相比於來自循環和共有序列的相應的表位，來自慢性感染的患者的T細胞更好地識別Bolela表位(數據未顯示)。由於Bolela代表流行的毒株，其包含阻礙病毒適合性(viral fitness)的逃逸突變是不太可能的。例如，Bolela序列具有位置1444處的Y，而該位置處的F則被認為是造成NS31436-1444表位引起較不穩固的T細胞應答的逃逸突變。另外，Bolela包含在NS31406-1416處的KLVALGINAV(SEQ ID NO:4)序列。該表位的3種變體已顯示具有減弱的T細胞應答，而沒有MHC結合能力的變化，使得逃逸是對於這些變體的最可能的解釋。
[0161]實施例7
[0162] 使用本發明以上描述的方法，製備了兩條另外的合成的HCV基因組多核苷酸序列。該序列是關於第二 HCV亞型la(SEQ ID NO: 5)和其分辨的胺基酸序列(SEQ ID NO:6),以及HCV亞型Ib (SEQ ID NO: 7)和其分辨的胺基酸序列(SEQ ID N0:8)。
[0163]本文所引用的所有的參考文獻，包括出版物、專利申請和專利在此通過引用被併入，其程度如同每一個參考文獻被單獨和特定地指明通過引用被併入，且在本文整體地列出。
[0164]在描述本發明的上下文中(特別是在以下的權利要求的上下文中)術語「一(a)」和「一(an)」和「該(the)」和類似指示物的使用被解釋為包括單數和複數二者，除非本文另外說明或根據上下文明顯矛盾。除非另外注釋，術語「包含(comprising)」、"具有(having)」、「包括(including)」和「包含(containing)」被解釋為開放式的術語(即，指「包括，但不限於」)。除非本文另外說明，本文所列舉的值的範圍僅意圖作為分別提及落入該範圍的每一個單獨的值的速記方法，且每一個單獨的值如同本文分別列舉其一樣被併入本說明書。本文所描述的所有方法可以以任何適合的順序被執行，除非本文另外說明或另外根據上下文明顯矛盾。除非另外聲稱，本文提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，「諸如」)的使用，僅意圖更好地闡述本發明並不造成對本發明範圍的限制。本說明書的任何語言都不應被解釋為表明任何未要求保護的要素對本發明的實施必不可少。
[0165]本文描述了本發明的優選的實施方案，包括本發明人已知關於實施本發明的最佳實施方式。當閱讀前文描述後，那些優選的實施方案的變化形式可對本領域普通技術人員變得明顯。本發明人預期技術人員視情況採用此類變化形式，且本發明人打算本發明以除了如本文所特定描述的之外被實施。因此，本發明包括此處所附權利要求中所列舉的主題的被適用法律所允許的所有的修改和等同物。此外，除非本文另外說明或另外根據上下文明顯矛盾，本發明包含以上所描述的要素以其所有可能變化形式的任何組合。
【權利要求】
1.一種編碼合成的C型肝炎病毒亞型Ia的基因組(Bolela)的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其部分或片段，或其互補序列。
2.—種分離的宿主細胞，所述分離的宿主細胞包含分離的根據權利要求1所述的核酸分子。
3.根據權利要求2所述的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
4.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子與在SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列或與其互補序列特異性雜交。
5.根據權利要求4所述的核酸分子，所述核酸分子是長度為約10和約30之間的核苷酸的寡核苷酸引物。
6.用於PCR的寡核苷酸引物對，其中第一條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列特異性雜交的分離的核酸分子且第二條引物是長度為約10和約30之間的核苷酸的與SEQ ID NO:1中展示的核苷酸序列的互補序列特異性雜交的分尚的核酸分子。
7.一種分離的多肽，所述分離的多肽由根據權利要求1所述的核酸或其部分或片段編碼。
8.根據權利要求7所述的分離的多肽，所述分離的多肽包含SEQID N0:2的胺基酸序列。
9.一種病毒粒子,所述病毒粒子包含: a)SEQ ID NO:1的核心序`列的最後27個胺基酸，隨後為El和E2區的胺基酸序列；和 b)報告兀件。
10.根據權利要求9所述的病毒粒子，其中所述報告元件包括螢光素酶多蛋白或其功能部分。
11.一種HCV抗原，所述HCV抗原包括編碼根據權利要求7或8所述的多肽的15至100之間的連續的胺基酸的多核苷酸分子。
12.根據權利要求11所述的HCV抗原，其中所述多核苷酸分子編碼來自根據權利要求7所述的多肽的核心、El和/或E2區的胺基酸。
13.一種抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分與根據權利要求1所述的核酸分子或根據權利要求7或8所述的分離的多肽特異性結合。
14.根據權利要求13所述的抗體，所述抗體是人抗體分子或人源化抗體分子。
15.根據權利要求13或14所述的抗體，所述抗體被可檢測的標記物標記。
16.一種測試樣品以確認所述樣品中HCV的存在的方法，所述方法包括檢測所述樣品中與根據權利要求13至15中任一項所述的抗體特異性結合的多肽的存在。
17.一種治療被HCV感染的受試者的方法，所述方法包括: 以足夠刺激所述受試者中針對根據權利要求11或12中任一項所述的抗原的免疫應答的量向所述受試者施用包含所述抗原的藥物組合物，如此以致所述免疫應答足夠降低所述受試者中HCV的病毒載量。
18.—種製備合成的HCV病毒多核苷酸的方法,所述方法包括: a)獲得兩條或更多條HCV多核苷酸序列； b)使用適合的比對程序比對所述多核苷酸序列；C)使用適於所述比對的兩種系統發生信息區的Bayesian或最大似然方法製備來自b)中所述比對的兩種或更多種系統發生樹，進行足夠數目的迭代以確認系統發生樹的參數的收斂； d)使用兩種系統發生樹並推斷用於HCV基因組的剩餘部分的祖先序列，其中用於估計的程序必須推斷所述祖先序列作為每一個位置的概率分布，產生關於每一個鹼基的概率； e)以以下方式(方法I&II)推斷最終的代表性序列: 關於所述基因組中每一個核苷酸位置i，如果兩種樹對最大後驗概率(MPP)殘基達成一致，那麼選擇該位置的概率Pi為這兩個MPP中較大的，並將這些位置定義為一致； 關於每一個不一致的位置(其中所述MPP殘基未達成一致)，(方法I)直接轉到步驟d或(方法II)基於兩種樹計算包含所述不一致的位置的密碼子k的聯合概率； 關於此類密碼子內的一致的殘基，在前一步驟中計算的Pi被用於計算聯合概率； 選擇來自所述兩種樹的具有較高聯合MPP的密碼子以代表該密碼子位置； f)確定用於密碼子/核苷酸MPP的嚴格的閾值，其中關於MPP值的二階導數的方差小於10-6的密碼子/核苷酸MPP的分布中的拐點被用作用於分辨密碼子/核苷酸的閾值，其中具有大於或等於基於任一種樹的所述閾值的MPP的每一個密碼子/核苷酸被視作祖先且其組成位置被定義為已分辨； g)使用協方差分析以檢查仍未分辨的位置，其中確定鹼基對的觀察的和預期的頻率並如方程I中顯示的計算卡方度量並調整所述卡方度量用於使用Holm-Bonfeironi方法的a=0.05的多重比較； X ij2 = (oij-eij)/eij (I) h)使用經調整的卡方度量，鑑定了與未分辨的位置i顯著共變的所有已分辨的位置j，在正相互作用的情況下(oi j>eij)，選擇包含正相互作用殘基的MPP密碼子/核苷酸，關於負相互作用(oij〈eij)，淘汰具有負相互作用鹼基的所有密碼子/核苷酸並從剩餘部分中選擇MPP密碼子，和 i)和合成所述合成的HCV多核苷酸或其片段或部分。
【文檔編號】A61K39/12GK103649316SQ201280032765
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年5月2日 優先權日:2011年5月2日
【發明者】斯圖爾特·坎貝爾·雷, 蘇普裡婭·穆恩肖, 林·劉 申請人:約翰霍普金斯大學