用於標記巰基的試劑、其製備以及用其進行標記的方法

2023-05-06 17:06:41 5

專利名稱：：用於標記巰基的試劑、其製備以及用其進行標記的方法
技術領域：
：本發明涉及一種使用含馬來醯亞胺基團的吖啶化合物來標記巰基(SH)的試劑。更具體地說，本發明涉及以吖啶化合物作為標記物質的一種巰基標記試劑、其生產方法以及用其進行標記的方法。吖啶化合物中含有馬來醯亞胺基團，它能與諸如胺基酸、蛋白質之類(被)分析物中含有的或易於引入的巰基結合，並能產生化學發光。
背景技術：
：吖啶鎓酯、吖啶化合物由於具有高發光效率，可用作化學發光標記物質。這種吖啶鎓酯作為一種化學發光標記在臨床試驗的免疫發光分析中的應用可見諸於，例如歐洲專利公報82636及美國專利4,745,181。已知的吖啶鎓酯包括那些含有親水性結構的，例如鏈端含有鋶離子的(日本專利申請公開(Kokai)平5-255264)、那些間隔部分中含有離子的(日本專利申請公報(Kokai)平5-255263)以及那些以羧基取代吖啶鎓中甲基之類而獲得的化合物(日本專利申請公開(kokai)平6-228102)。這些含親水結構的吖啶鎓酯實際上是打算用來標記氨基的，因此被認為適合用於標記胺基酸、蛋白質之類，故而用於臨床試驗的免疫發光分析。順便指出，臨床試驗的免疫發光分析中的分析物大多是胺基酸及蛋白質。由於這些物質含有許多氨基，上述已知的吖啶鎓化合物具有標記操作容易的顯著優點。然而，它們標記的是大量存在於胺基酸及蛋白質中的氨基。結果，有許多位置要標記。這就給標記工作帶來一致性及可重複性方面的問題、諸如抗體蛋白之類分析物不溶化的問題，以及當對抗體實施標記時，標記化合物與位於抗原識別部位的氨基相結合，從而使其作為抗體的功能減弱或喪失的問題。當分析物為低分子物質時，即只含有有限數目的氨基時，尚有可能控制標記反應並以恆定的摩爾比方便地進行標記。但是，當分析物為高分子物質時，例如抗體蛋白，則氨基的數目就無法準確地測定，其中存在一個缺點允許採用恆定摩爾比進行標記的條件不得不通過反覆試差的辦法臨時做些假定。順便指出，要提供一種用於實際使用的化學發光標記試劑的化合物，重要的是，該化合物應保證標記反應容易進行並且在標記條件下不產生發光或分解。吖啶鎓酯的標記對象範圍很廣，首先是低分子化合物，例如胺基酸，甚至也包括高分子化合物，例如酶及抗體。當分析物的氨基作為上述那樣的基準時，常常在吖啶鎓酯中引入亞胺基，使之與氨基結合起來，正如上面提到的文獻中所公開的那樣。當利用這種亞胺基對氨基進行結合反應時，該反應在鹼性條件下進行得很順利。但是，吖啶鎓化合物是一種不穩定的化合物，它在鹼性條件下能產生發光或分解。因此，既要保持發光活性，又要保證標記的有效進行，勢必要求彼此矛盾的反應條件，因而不易辦到。有鑑於此，一直希望找到一種標記化合物，它能在用於免疫發光分析之類的化學發光標記方法中在溫和的條件下與諸如胺基酸或蛋白質相結合，並在具備高度專一性的同時具有足夠的結合力，還希望提供一種藉助該標記化合物來穩定而精確地檢出分析物的方法。
發明內容為解決上面提到的問題，本發明人首先想到，作為被標記基團採用巰基來替代目前使用的氨基，因為巰基具有良好的反應性，儘管它們通常在胺基酸、蛋白質之類物質中的含量並不多。於是，本發明人發現，用分子中引入了馬來醯亞胺基團的吖啶鎓化合物作為標記此種巰基的巰基標記試劑是有利的，結果使得本發明終獲成功。據此，本發明的一個目的是提供一種含有以下式(I)代表的吖啶化合物的巰基標記試劑其中，A代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q-(CH2)n-其中Q代表基團-S+RX--、基團-N+RR1X--，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，m1代表1～6的數，m2表示0～2的數，n表示1～2的數；R代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基；以及X-代表陰離子。本發明的另一個目的是提供一種含有作為上述吖啶化合物的中間體的巰基標記試劑，該中間體即用下式(II)代表的吖啶化合物其中A』代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q』-(CH2)n-其中Q』代表基團-S-、基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，以及m1、m2及n的含義同上面的規定。本發明的又一個目的是提供製備分別用上面的式(I)及式(II)代表的吖啶化合物的方法。本發明的再一個目的是提供分別用上面的式(I)及式(II)代表的吖啶化合物來標記分析物的方法。實施本發明的最佳方式用式(I)代表的化合物，即按照本發明的化合物，可按照例如下述的方法1或方法2中之一來製備。方法1在按照本發明的吖啶化合物當中，每一個化合物(Ia)，其中A是基團-(CH2)m1-，其中m1的含義如上面所規定，可通過烷基化試劑(III)與用式(IIa)代表的化合物(以下稱「中間體(IIa)」)採用本身為技術上已知的方式按照下列反應式進行反應製成，(插入第8頁的反應式)其中X代表易於轉化為陰離子的消去基團，R及m1的含義同上面的規定。上述反應中使用的烷基化試劑(R-X)的例子是滷代烷基，例如碘甲烷、溴乙烷及碘乙烷、三氟甲烷磺酸甲酯、氟代磺酸甲酯、甲烷磺酸甲酯及對甲苯磺酸甲酯。因此，式(Ia)中的X-最典型地是滷素離子，例如I-或Br-、CF3SO3-、FSO3-或P-CH3C6H4SO3-，R含有1～6個碳原子的烷基，例如甲基或乙基或者芳基。作為可用於上述反應的溶劑，可舉出乙醚、甲苯、乙腈等例子。中間體(IIa)，即用於製備化合物(Ia)的原料，可通過ω-氨基亞烷基苯基9-吖啶羧化物(IV)與馬來酐(V)在鹼的存在下按照下列反應式進行反應製得，其中m1的含義同上面的規定。具體地說，化合物(II)例如可這樣製備根據《臨床化學》31(10)，1664～1668頁，1985，在以乙酸鈉、碳酸鉀等作為鹼，以乙酸、丙酸等作為溶劑的條件下，在大約80～140℃的溫度下，讓化合物(IV)與化合物(V)進行反應。順便指出，上述中間體(IIa)以通式的形式公開在日本專利申請公開(Kokai)昭62-61969中。但是，該專利公開並未公開任何內容，更不用說可為製備該化合物提供線索的工作實例了。因此，據信該化合物實際上是一種新化合物。方法2在按照本發明的吖啶化合物當中，每一化合物(Ib)，其中A是基團-(CH2)m2-Q』-(CH2)n-，其中Q』、m2及n的含義如上面所規定，是一種新化合物，而作為此種化合物的特定例子可舉出如下結構式的化合物。化合物(Ib)例如可通過烷基化試劑(III)與用式(IIb)代表的化合物(以下稱「中間體(IIb)」)採用本身為技術上已知的方式按照下列反應式進行反應製成。其中Q、Q』、R、X-、m2及n的含義同上面的規定。關於上述反應中使用的烷基化試劑(R-X)的例子，可舉出方法1中所使用的烷基化試劑。因此，式(Ib)中的X-最典型的是滷素離子，例如I-或Br-、CF3SO3-、FSO3-、CH3SO3-或P-CH3C6H4SO3-，R是含有1～6個碳原子的烷基，例如甲基或乙基或者芳基。作為可用於上述反應的溶劑，可舉出乙醚、甲苯、乙腈等例子。再有，中間體(IIb)，即用於製備化合物(Ib)的原料，是一種新化合物。作為此種化合物的特定例子，可舉出用下式代表的化合物。中間體(IIb)可通過下述的方法之一製備。(i)按照下述反應路線，含消去基團的苯酚化合物(VI)與9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)進行反應，製成在分子一端帶有消去基團的吖啶酯衍生物(VIII)；一端含有可能已根據需要用一種保護基團保護起來的伯氨基而在其相反的一端帶有伯或仲氨基的多胺(IX)在合適的鹼的存在下與上述吖啶酯進行反應，製成一端含有可能已根據需要用一種保護基團保護起來的伯氨基的吖啶酯(X)；當有端伯氨基的保護基團時，消去該保護基團，然後以馬來酐(V)與該伯氨基反應生成馬來醯亞胺基團，於是就得到了化合物(IIb』)。其中Ra每一個獨立地是氫原子或氨基保護基團，Y1及Y2代表消去基團，而Q1代表基團-NR1-或基團其中R2及R3的含義同上面的規定，m2及n的含義也同上面的規定。(ii)按照如下反應方案，一端鍵合著用保護基團保護起來的伯氨基的、含有硫醚或聚醚的苯酚衍生物(XI)與9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)進行反應，製成吖啶鎓酯(XII)，解除端氨基的保護之後，讓馬來酐(V)與該端伯氨基反應，使之轉化為馬來醯亞胺基團，於是就得到了化合物(IIb」)。其中Q2代表-S-基或基團-O(CH2CH2O)l-，Ra、Y2、m2及n的含義同上面的規定。在方法(i)中，含消去基團的苯酚化合物(VI)中的苯酚化合物的例子可包括4-(甲苯磺醯氧甲基)苯酚、4-(3-氯丙基)苯酚及4-(2-甲苯磺醯氧乙基)苯酚，而其消去基團的例子可包括甲苯磺醯氧基、甲磺醯氧基以及滷素原子(氯、溴、碘)。另一方面，9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)的例子是醯基滷，例如氯化物及溴化物，酸酐及活性酸酯。而，多胺(IX)的例子可包括N-(2-氨乙基)哌嗪、1，3-二氨基丙烷以及4-(氨乙基)哌啶，其保護基團的例子可包括叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)以及苯鄰二甲醯亞胺。另外，在化合物(VI)與(VII)的反應中以及在化合物(VIII)與(IX)的反應中使用的鹼的例子是三乙胺和吡啶。適用於上述反應的溶劑的例子可包括二氯甲烷、氯仿(氯仿)、乙醚、甲苯及吡啶。為了消去化合物(IX)中的伯氨基的保護基團，脫保護反應可按照本身為技術上已知的方式採用酸催化還原條件或在鹼的存在下，在無溶劑或合適的溶劑中進行。可用的酸的例子可包括三氟化硼(BF3)、三氟乙酸及鹽酸。用於催化還原的溶劑的例子可包括鈀-碳、鈀黑及鉑黑。鹼的例子是肼、氫氧化鈉及氫氧化鉀。溶劑的例子可包括乙醚、二噁烷、甲醇、乙醇、水、乙腈及乙酸。而對在化合物(X)中已根據需要消去保護基團的伯氨基進行的馬來醯亞胺化反應(maleimidation)，可通過在馬來酐及鹼的存在下以及在溶劑中加熱的條件下將該化合物加熱，以馬來酐與該伯氨基反應來實現。適用的鹼的例子可包括乙酸鈉和碳酸鉀。溶劑的例子可包括乙酸及丙酸。另一方面，在說到方法(ii)時提到的含端氨基並具有硫醚或聚醚結構的苯酚衍生物中，該具有硫醚的苯酚衍生物的例子可包括4-(2-氨乙硫代)苯酚及4-(3-氨丙硫代)苯酚，而具有聚醚結構的苯酚衍生物的例子可包括4-(3-(2-氨乙氧基)丙氧基)苯酚及4-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)苯酚。作為上述氨基的保護基團的範例，可舉出Boc、Cbz、苯鄰二甲醯亞胺等基團。另外，可用的鹼的例子可包括三乙胺及吡啶，而溶劑的範例是二氯甲烷、乙醚、甲苯及吡啶。伯氨基的脫保護及馬來醯亞胺化反應可按照類似於上面關於方法(i)中所述方法進行。下面，將講述用本發明的化合物(I)與胺基酸或蛋白質中的巰基進行反應來標記該物質的方法。例如，要用本發明的化合物(I)來標記抗體，首先用胃蛋白酶消化該抗體，得到F(ab』)2，然後在溫和的還原條件下將其還原，製備成Fab』。然後，本發明化合物(I)中的馬來醯亞胺基團與溶液中的Fab』的巰基發生反應，從而完成了標記。Fab』與本發明化合物(I)之間的反應進行的條件為Fab』與本發明化合物(I)按1∶1～1∶10的摩爾比進行反應，在pH5～7的，優選地在pH6～6.5的、1～37℃，優選地4～10℃的溫度的含水溶液中，反應時間為10分鐘～72小時，優選地約48小時，同時使用大約1～5毫摩爾的EDTA保護巰基免遭反應溶液中的溶解氧的氧化。採用本發明化合物(I)的標記反應通常是在pH等於或低於7的含水介質中進行的。如果分析物微溶或不溶於水，則標記反應可按照下述的方式進行。即，向分析物在少量能與水充分混溶的惰性溶劑(以下稱「惰性溶劑」)中的溶液內加入水，從而製備成分析物的含水溶液。在該溶液中，混入化合物(I)的含水溶液以便使馬來醯亞胺與巰基間的反應在pH值等於或小於7之下進行。該反應是由於分析物對本發明化合物(I)中的馬來醯亞胺基團的不飽和鍵發生親核加成而進行的。即使在分析物中除了巰基外還含有氨基，但氨基的親核性受到了抑制，因而不會生成與氨基的反應產物，因為該反應是在pH等於或小於7之下進行的。正因為如此，本發明的化合物可當作一種對巰基有選擇性的試劑。標記反應中使用的惰性溶劑，例如是N，N-二甲基乙醯胺、二甲亞碸、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)、1，4-二噁烷以及吡啶。標記之後，被標記的分析物可藉助例如凝膠色譜法、離子交換色譜法、親合色譜法或高性能液體色譜法等分離方法分離出來。就是說，採用上述方法，在恆定摩爾比的條件下進行標記是可行的。即使當分析物不含巰基時，本發明的標記方法仍然適用，此時可在溫和的條件下利用S-乙醯基巰基琥珀酐或類似的試劑將巰基引入到分析物的羥基、氨基和/或類似基團上既可。在這種情況下，引入巰基的數量應使得能夠對分析物與巰基之間的比例作出估計。因此，適用於本發明的標記方法的分析物可以是任何物質，只要該物質含有巰基或者可以引入巰基既可。即使如胺基酸這樣的低分子物質也可以採用本發明的化合物(I)以類似於上述的方式在溫和的條件下進行標記。象上面那樣獲得的被標記物質能夠在已知的吖啶鎓酯發光的條件下，例如通過在鹼性條件下加入過氧化氫等，而被導致發光。利用化學發光檢測劑探測到所發出的這種光，就可判定該物質的存在。而且，根據化學發光的數量，可測出被標記物質的數量。因此本發明的標記方法可應用於藥物在活體內分布的示蹤，以及用於諸如診斷之類的各種要求痕量檢測的領域中的定性分析及定量分析。下面，講述有關利用本發明的化合物(I)的標記方法的具體應用實例。作為本發明標記方法的一個應用，例如有一種測定樣品中某種分析物的方法，該方法包括利用分析物與一種已被結合在載體上的某物質之間的結合反應從而專一地與分析物結合在一起將分析物捕獲，正如所謂化學發光免疫檢驗夾心(immunoassaysandwich)方法中那樣；繼而使得一種也能專一地與該分析物結合併且以本發明的化合物(I)做過標記的物質與上面被捕獲的分析物相結合；然後測定其發光強度。還有一種測定樣品中分析物的方法，正如在所謂化學發光競爭免疫檢驗中所使用的那樣，包括用本發明的化合物(I)來標記分析物；預先加入規定濃度的該被標記分析物；然後在利用一種反應，即樣品中分析物及被標記分析物同時與一種同這兩種分析物都能專一結合的物質競相結合的反應的情況下測定發自被標記分析物的發光強度。在這些情況下，有專一結合能力的物質的組合的例子可包括抗原與抗體、核酸與其互補的順序、效應物(分子)與受體分子、酶與抑制劑、抗生物素蛋白與生物素，以及含糖鏈的物質與其對應的外源凝集素。作為另一種應用，例如在所謂柱後(post-column)高性能液相色譜法中的分析物測定方法中的應用，包括採用本發明化合物(I)來標記分析物；用上述的例如色譜法等分離方法分離出被標記分析物；然後利用化學發光檢測器測定該分析物。在上述諸標記方法中，本發明的化合物(I)能克服傳統上已知的吖啶鎓酯的種種缺點，這些缺點是例如被標記分析物不溶化的問題、氨基所潛在的失活，甚至對分析物在生物活性方面的要求，恆定結合摩爾比之下結合困難、難以在結合反應中確立可重複性以及在結合反應條件下就過早發光及分解。作為本發明進一步的應用實例，可提及下述方法。即，同時也用於本發明化合物(I)的合成的中間體(II)，預先與一種含巰基的分析物進行反應(以下稱「預標記」)。然後讓一種適當的N-烷基化試劑反應，繼而在鹼性條件下，令足夠量的化學發光劑，例如過氧化氫，發生作用。用化學發光檢測器檢測造成的化學發光以測定該分析物。在式(II)代表的吖啶酯中，馬來醯亞胺端基具有對巰基的結合活性。而且，它可作為穩定的化合物分離出來。因此，可使之預先結合到含巰基的物質上。上述的用中間體(II)對分析物進行預標記反應中的結合方法、預標記分析物的分離方法等等，可按照與使用化合物(I)基本上相同的方式來進行。上述的預標記分析物可通過它與烷基化試劑(III)在適當溶劑中的反應，進一步轉化為吖啶鎓酯標記的分析物。烷基化試劑(III)的可用例子包括滷代烷，例如碘甲烷、碘乙烷及溴乙烷、三氟甲烷磺酸甲酯、氟代磺酸甲酯、甲烷磺酸甲酯以及對甲苯磺酸甲酯，正如上面也提到的。而，可用溶劑的例子除上述標記反應中所使用的溶劑之外還有四氫呋喃及乙腈。當反應後吖啶鎓酯標記的分析物以晶體形式從所使用的溶劑中沉澱出來時，可用過濾將其分離出來。當它不沉澱時，可用柱色譜將其分離出來。以中間體(II)進行預標記反應之後，反應產物用烷基化試劑(III)進一步進行N-烷基化處理。如此標記的分析物產生的化學發光及其應用等等與有關化合物(I)所述內容相近。順便指出，採用中間體(II)的標記方法，考慮到在結合反應之後要用烷基化試劑(III)進行標記，故不適用於那些除了巰基之外還含有其他對烷基化試劑具有活性的基團的分析物。在這種情況下，需要採取諸如用保護基團等措施將這些活性基團保護起來。下面，將結合以下的實施例更具體地說明本發明。但是，應當記住，本發明既不限於，也不受這些實施例的限制。實例14-(2-甲苯磺醯氧乙基)苯酚(1)的合成4-羥苯乙醇(3.2克)溶於50毫升吡啶中，在冰的冷卻下向其中徐徐加入4.0克甲苯磺醯氯。讓反應混合物的溫度升至室溫，然後在此溫度下攪拌2小時。接著，濾除不溶物並在減壓下蒸出吡啶。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得3.4克化合物(1)(收率59％)。實例29-吖啶羧酸氯化物的合成(2)亞硫醯氯(20毫升)加入到2.2克9-吖啶羧酸中，隨後在回流下加熱5小時。在減壓下蒸除亞硫醯氯之後，再加入20毫升二氯甲烷。在減壓下反覆蒸餾兩次，於是得到2.4克化合物(2)(收率化學計算值)。實例34-(2-甲苯磺醯氧乙基)苯基9-吖啶基羧化物(3)的合成在30毫升吡啶中，溶入2.4克從實例2中得到的化合物(2)。在水冷卻及攪拌下，徐徐加入2.9克從實例1得到的化合物(1)。室溫下攪拌2小時後，減壓下蒸除吡啶。再加入氯仿，然後在減壓下反覆蒸餾兩次。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得2.7克化合物(3)(收率54％)。實例44-(2-(4-氨甲基哌啶-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(4)的合成在30毫升DMF中，溶入2.9克從實例3得到的化合物(3)，然後加入0.59克4-氨甲基吡啶。獲得的混合物在室溫下攪拌，在冰冷卻下向其中加入0.60克叔丁醇(t-Buok)。得到的混合物在室溫下攪拌5小時。減壓下蒸除DMF，將殘餘物溶解在氯仿中。用水洗滌如此得到的溶液，然後在無水硫酸鎂上空乾燥。減壓下蒸除溶劑。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿/甲醇＝7/3)分離並提純殘餘物，於是獲得0.41克化合物(4)(收率18％)。實例54-(2-(4-((馬來醯亞胺-1-基)甲基)哌啶-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(5)的合成在20毫升乙酸中，加入0.41克從實例4得到的化合物(4)、0.30克馬來酐及0.30克乙酸鈉，接著在回流下加熱3小時。然後，在減壓下蒸除乙酸。向殘餘物中加入水，再用氯仿萃取。萃取液置於硫酸鎂上空乾燥，在減壓下蒸除氯仿。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得0.22克化合物(5)(收率43％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(CDCl3)δ8.3(m，4H)，8.0-7.6(m，4H)，7.3(s-狀，4H)，6.7(s，2H)，3.4(d，J＝7，2H)，3.1-2.5(m，6H)，2.2-1.5(m，7H)。MASS(質譜)(FAB)520(M+1)。實例64-(2-(4-(馬來醯亞胺-1-基)甲基-1-甲基-哌啶鎓(piperidinium)-1-基)乙基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(6)的合成在20毫升甲苯中，溶入0.22克從實例5得到的化合物(5)，在室溫及攪拌下向其中加入0.30克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室溫下攪拌1小時後，放置過夜。過濾後得到的紅色沉澱物用甲苯洗滌並在空氣中乾燥，於是得到30毫克化合物(6)(收率9.2％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亞碸)-d6)δ8.8-8.0(m，8H)，7.5(s-狀，4H)，6.8(s，2H)，5.1(s，3H)，3.3(s，3H)，3.7-3.0(m，10H)，2.0-1.6(m，5H)。MASS(質譜)(FAB)550(M+1)。實例74-(2-氨乙基硫基)苯酚(7)的合成在30毫升乙醇中，加入1.2克4-巰基苯酚、2.1克2-溴乙胺鹽酸化物及1.4克碳酸鉀，接著在室溫下攪拌3小時。加水，得到的混合物用乙醚萃取。萃取液在硫酸鎂上空乾燥，然後在減壓下蒸除乙醚，於是得到1.7克混合物(7)(收率化學計算值)。實例84-(2-N-Boc-氨乙基硫基)苯酚(8)的合成在30毫升乙腈中，溶入1.7克從實例7得到的化合物(7)。加入無水Boc(2.4克)，繼而攪拌1小時。減壓下蒸除溶劑後，加入吡啶。然後，在減壓下蒸除吡啶，於是得到2.7克化合物(8)(收率化學計算值)。實例94-(2-N-Boc-氨乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(9)的合成在30毫升吡啶中，溶入2.4克從實例2得到的化合物(2)，在水冷卻及攪拌下向其中徐徐加入2.7克從實例8得到的化合物(8)。得到的混合物在室溫下攪拌2小時後，減壓下蒸除吡啶。再加氯仿，並在減壓下蒸餾兩次。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得3.2克化合物(9)(收率68％)。實例104-(2-氨乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(9)的合成向1.9克從實例9得到的化合物(9)中加入20毫升三氟乙酸，繼而在室溫下攪拌30分鐘。減壓下蒸除三氟乙酸，於是得到1.4克化合物(10)(收率化學計算值)。實例114-(2-(馬來醯亞胺-1-基)乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(11)的合成在20毫升乙酸中，加入1.4克從實例10得到的化合物(10)、1.0克馬來酐及1.0克乙酸鈉，然後在回流下加熱3小時。減壓下蒸除乙酸。殘餘物中加水。用氯仿萃取得到的混合物。萃取液在硫酸鎂上空乾燥，並在減壓下蒸除氯仿。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)提純殘餘物，於是獲得1.1克化合物(11)(收率63％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(CDCl3)δ8.3(m，4H)，8.0-7.6(m，4H)，7.3(s-狀，4H)，6.7(s，2H)，3.8(t，J＝7，2Hz)，3.2(t，J＝7，2Hz)。MASS(質譜)(FAB)455(M+1)。實例124-((2-(馬來醯亞胺-1-基)乙基)甲基鋶)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(12)的合成在20毫升甲苯中，溶入0.90克從實例11得到的化合物(11)。在室溫下攪拌的情況下，加入1.0克三氟甲烷磺酸甲酯，接著在室溫下攪拌1小時。隨後讓反應混合物靜置過夜。過濾後收集紅色沉澱物，用甲苯洗滌並在空氣中乾燥，於是得到1.1克化合物(12)(收率71％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亞碸)-d6)δ9.0-8.0(m，8H)，7.6(d，J＝7，2H)，7.4(d，J＝7，2H)，6.7(s，2H)，5.1(s，3H)，3.8(t，J＝7，2H)，3.7(s，3H)，3.2(t，J＝7，2H)。MASS(質譜)(FAB)467(M+1)。實例132-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙醇(13)的合成在30毫升乙腈中，溶入2.1克2-氨乙氧基乙醇.加入無水Boc(4.8克)，接著攪拌1小時。減壓下蒸除溶劑後，加入吡啶。繼而在減壓下蒸除吡啶，於是得到3.7克化合物(13)(收率化學計算值)。實例142-(2-甲苯磺醯基氧乙氧基)-N-Boc-乙胺(14)的合成在50毫升吡啶中，溶入3.7克從實例13得到的化合物(13)，在冰冷卻及攪拌下向其中徐徐加入4.0克甲苯磺醯氯。讓得到的混合物溫度升至室溫，在此溫度下混合物攪拌2小時。濾除不溶物，並在減壓下蒸除吡啶。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得5.5克化合物(14)(收率76％)。實例154-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙氧基)苯基苄基醚(15)的合成在30毫升DMF中，溶入2.0克對苄基氧苯酚，向其中加入1.2克叔丁醇鉀。得到的混合物在室溫下攪拌30分鐘後，加入3.9克從實例14得到的化合物(14)。如此得到的混合物在室溫下攪拌3小時。減壓下蒸除DMF之後，將殘餘物溶解在乙醚中。得到的溶液用稀鹽酸洗滌一遍、水洗滌兩遍，然後再用氯化鈉飽和水溶液洗滌一遍。該溶液在硫酸鎂上空乾燥之後，在減壓下蒸除乙醚。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)提純殘餘物，於是獲得3.2克化合物(15)(收率83％)。實例164-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙基氧)苯酚(16)的合成在40毫升乙酸中，溶入3.0克從實例15得到的化合物(15)，向其中加入2.0克鈀黑。隨後，得到的混合物在氫氣氛及室溫下攪拌2小時。濾除鈀，在減壓下蒸除濾液。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿/甲醇＝9/1)分離並提純殘餘物，於是獲得2.4克化合物(16)(收率化學計算值)。實例174-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(17)的合成在30毫升吡啶中，溶入2.4克從實例2得到的化合物(2)。在水冷卻及攪拌下，徐徐加入從實例16得到的化合物(16)。如此得到的混合物在室溫下攪拌2小時後，減壓下蒸除吡啶。再加氯仿，並在減壓下進行兩次蒸餾。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)分離並提純殘餘物，於是獲得2.1克化合物(17)(收率47％)。實例184-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(18)的合成在2.1克從實例17得到的化合物(17)中加入三氟乙酸(20毫升)，接著在室溫下攪拌30分鐘。減壓下蒸除三氟乙酸，然後加水。得到的混合物用碳酸氫鈉中和，然後借過濾收集沉澱物。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿/甲醇＝9/1)分離並提純濾液，於是獲得1.7克化合物(18)(收率化學計算值)。實例194-(2-(2-(馬來醯亞胺-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(19)的合成在40毫升乙酸中，加入1.7克從實例18得到的化合物(18)、1.2克馬來酐及1.2克乙酸鈉，繼而在回流下加熱3小時。反應混合物冷卻後，在減壓下蒸除乙酸。向殘餘物中加水，得到的混合物用氯仿萃取。萃取液置於硫酸鎂上空乾燥，然後在減壓下蒸除氯仿。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)提純殘餘物，於是獲得0.81克化合物(19)(收率42％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(CDCl3)δ8.3(m，8H)，7.4-7.0(m，4H)，6.8(s，2H)，4.2(m，2H)，3.9(m，2H)，3.8(s-狀，4H)。MASS(質譜)(FAB)483(M+1)。實例204-(2-(2-(馬來醯亞胺-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(20)的合成在50毫升甲苯中，溶入0.81克從實例19得到的化合物(19)，在室溫及攪拌下向其中加入0.60克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室溫下攪拌1小時，然後靜置過夜。借過濾收集到黃色沉澱物，用甲苯洗滌，然後在空氣中乾燥，於是得到0.39克化合物(22)(收率37％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亞碸)-d6)δ9.0-8.0(m，8H)，7.4(d，J＝7，2H)，7.1(d，J＝7，2H)，6.8(s，2H)，5.1(s，3H)，4.2(m，2H)，3.9(m，2H)，3.8(s-狀，4H).MASS(質譜)(FAB)497(M+1)。實例214-(2-(馬來醯亞胺-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(22)的合成在20毫升乙酸中，加入0.71克4-(2-氨乙基)苯基9-吖啶羧化物(21)、0.60克馬來酐及0.60克乙酸鈉，接著在回流下加熱3小時。反應混合物冷卻後，在減壓下蒸除乙酸。向殘餘物中加水，然後得到的混合物用氯仿萃取。萃取液在無水硫酸鎂上空乾燥，然後在減壓下蒸除氯仿。藉助矽膠柱上的色譜法(洗脫液氯仿)提純殘餘物，於是獲得0.14克化合物(22)(收率95％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(CD3OD)δ8.2-7.6(m，8H)，7.4(s，4H)，6.8(s，2H)，3.8(t，J＝8，2H)，3.0(t，J＝8，2H)。MASS(質譜)(FAB)423(M+1)。實例224-(2-(馬來醯亞胺-1-基)乙基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(23)的合成在20毫升甲苯中，溶入0.17克上述的馬來醯亞胺(22)。在室溫及攪拌下向該溶液中加入0.10克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室溫下攪拌1小時後靜置過夜。然後，過濾收集析出的黃色沉澱物，再用甲苯洗滌。沉澱物在空氣中乾燥，於是得到0.12克化合物(23)(收率51％)。該物質的分析數據如下NMR(核磁共振)(CD3OD)δ8.9-8.0(m，8H)，7.4(s，4H)，6.8(s，2H)，5.1(s，2H)，3.8(t，J＝8，2H)，3.0(t，J＝8，2H)。MASS(質譜)(FAB)437(M+)。實例23抗人體血紅蛋白抗體的標記(1)向3毫升含有0.1摩爾氯化鈉的0.1摩爾乙酸鈉緩衝溶液(pH4.5)中加入10毫克提純的抗人體血紅蛋白兔多克隆抗體。向該溶液中加入並溶解0.4克由豬胃液轉化而來的提純胃蛋白酶粉末。溶液在37℃下恆溫48小時，於是，兔IgG的Fc部分便被消化了。通過採用0.1摩爾含有5毫摩爾EDTA、作為洗脫液的磷酸鈉緩衝溶液(pH6；以下稱「pH6緩衝液」)以及「Superdex200Column(分離色譜柱)」(Pharmacia公司產品)進行凝膠過濾，消化混合物被分級，於是就得到含5毫克F(ab』)2在3毫升pH6緩衝液中的溶液。向溶液中加入2-巰基乙胺(24毫克)，得到的混合物在37℃下恆溫24小時，F(ab』)2便還原為Fab』。通過「SephadexG25Column(分離色譜柱)」(Pharmacia公司產品；洗脫液pH6緩衝液)進行凝膠過濾，於是就得到含2毫克Fab』在3毫升pH6緩衝液中的溶液。使用一部分該溶液，通過測定4-巰基吡啶的數量對巰基進行了定量，該物質是通過4，4』-二硫吡啶與Fab』的巰基之間的化學計量反應而獲得的，定量是利用324納米波長處的吸收作出的。結果，據發現每分子Fab』含有一個巰基。(2)接著，將0.5毫升含有0.04毫克實例6中合成的化合物(6)的pH6緩衝液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab』的pH6緩衝液中。換句話說，將二者合在一起，使得Fab』與化合物(6)在二者的結合反應中的摩爾比為1∶5。得到的混合物在4℃下恆溫48小時，於是Fab』便用化合物(6)標記好了。反應後，通過「SephadexG25Column」(Pharmacia公司產品；洗脫液pH6緩衝液)將過量加入的化合物(6)分離掉，於是得到0.5毫克溶於3毫升pH6緩衝液的標記抗體(標記抗體A)。根據Fab』的E280摩爾吸收係數及化合物(6)的E260摩爾吸收係數對標記抗體進行了定量。據發現，在如此得到的標記抗體A中Fab』與化合物(6)按1∶1的摩爾比彼此結合在一起。以類似的方式，將0.5毫升含有0.04毫克實例12中合成的化合物(12)的pH6緩衝液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab』的pH6緩衝液中，反應後，進行了凝膠過濾，於是得到0.5毫克溶於3毫升pH6緩衝液的標記抗體(標記抗體B)。同樣地，將0.5毫升含有0.03毫克實例20中合成的化合物(20)的pH6緩衝液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab』的pH6緩衝液中，反應後，進行了凝膠過濾，於是得到0.5毫克溶於3毫升pH6緩衝液的標記抗體(標記抗體C)。又是象上面一樣，將0.5毫升含有0.04毫克實例23中合成的化合物(23)的pH6緩衝液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab』的pH6緩衝液中，反應後，進行了凝膠過濾，於是得到0.5毫克溶於3毫升pH6緩衝液的標記抗體(標記抗體D)。據發現，在如此得到的標記抗體B、標記抗體C及標記抗體D中，Fab』與化合物(12)、Fab』與化合物(20)及Fab』與化合物(23)都是按1∶1的摩爾比彼此結合在一起的。實例24用標記抗體對人體血紅蛋白的檢驗製備了含0.15摩爾氯化鈉的、每0.1毫升pH7的0.05M磷酸鹽緩衝液(以下簡稱「PBS」)含5微克提純抗人體血紅蛋白小鼠單克隆抗體的溶液。將該溶液按每次0.1毫升的量逐一轉移到微滴板的一個個孔中。溶液在4℃下放置24小時，於是該單克隆抗體就以固相形式被吸收到孔內表面上。該固相抗體板接受以0.1毫升含有1毫克牛血清清蛋白的PBS的阻斷(blocking)處理。另外，提純的人體血紅蛋白溶解在PBS中，分別得到每毫升溶液含0、0.2、1、5、25及125微克/毫升濃度的溶液。取0.1毫升等量的上述溶液的等分試樣分別倒入微滴板的一個個孔中。溶液在4℃下放置24小時，於是樣品中的人體血紅蛋白就被固相抗體俘獲。用PBS洗滌每一個孔以去除未結合的人體血紅蛋白之後，向每一個孔中傾入0.1毫升含有5微克在實例23中製備的標記抗體A的PBS。讓PBS溶液在4℃下放置24小時，以便讓反應進行。用PBS洗滌每一個孔，在去除未結合的標記抗體A之後，加入0.05毫升0.1N氫氧化鈉及0.04毫升0.5％過氧化氫，使之發光。用「LuminusCT-9000D」(Dia-Iatron公司製造)測定發光，這是一種用於測定化學發光的微滴板讀取器。發光的數量按2秒鐘間隔內的積分值衡量。以同樣的方式用標記抗體B、標記抗體C及標記抗體D分別進行了人體血紅蛋白的檢驗。上述檢驗的結果一併載於下面的表1中。表1從表1明顯可見，標記抗體A、標記抗體B、標記抗體C及標記抗體D所產生的發光量都隨著人體血紅蛋白的濃度提高而增加，因此，這些標記抗體可用於人體血紅蛋白的定量。工業拓展前景本發明的化合物(I)及(II)對分析物的標記依靠的都是巰基與馬來醯亞胺基團之間的穩定結合併且是在溫和條件下進行的。由於標記是在這樣的溫和條件下進行的，標記抗體等的抗原識別部位等不會受到損害，而且，吖啶酯既不會因發光而消耗，也不會因分解而失活。此外，本發明的標記方法依靠在胺基酸或蛋白質中的含量頗少的巰基。這就使得有可能對分析物進行特定的標記，它帶來的突出優點就是可以做到在分析物與化學發光物質之間以恆定的結合摩爾比進行結合。當本發明的標記方法應用於，例如抗體Fab』時，以本發明的化合物(I)(或中間體(II))對整個Fab』進行標記，即使加入的該化合物有些過量，仍舊得到按1∶1摩爾比的標記結果，因為Fab』只含有一個巰基。況且，參與結合反應的巰基與Fab』的生物活性部位無關，故而Fab』抗原識別部位不會受到損害。因此，分析物的定性或定量分析根據化學發光的數量就能很容易做到。本發明的標記方法尤其適用於藥物在活體內分布的示蹤以及各種診斷領域，這些領域都要求對痕量物質進行檢測。權利要求1.一種巰基標記試劑，含有用下式(I)表示的吖啶化合物其中A代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q-(CH2)n-其中Q代表基團-S+RX--、基團-N+RR1X--，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，m1代表1～6的數，m2表示0～2的數，n表示1～2的數；R代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基；以及X-代表陰離子。2.一種巰基標記試劑，含有用下式(II)表示的吖啶化合物其中A』代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q』-(CH2)n-其中Q』代表基團-S-、基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，以及m1、m2及n的含義同上面的規定。3.一種製備下式(Ia)所代表的吖啶化合物的方法其中X-代表陰離子，R代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基，m1代表1～6的整數，它包括使下式(III)代表的烷基化試劑R-X(III)其中R的含義同上面的規定，X代表易於轉化為陰離子的消去基團，作用於下式(IIa)代表的吖啶化合物其中m1的含義同上面的規定。4.一種製備下式(IIa)所代表的吖啶化合物的方法其中m1代表1～6的整數，它包括使下式(IV)代表的ω-氨基亞烷基苯基9-吖啶羧化物其中m1的含義同上面的規定，與馬來酐在鹼的存在下發生反應。5.一種由下式(Ib)代表的吖啶化合物其中Q代表基團-S+RX--、基團-N+RR1X--，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)；R代表1～6個碳原子的烷基或芳基；X-代表陰離子；m2表示0～2的數；以及n表示1～2的數。6.一種作為式(Ib)代表的吖啶化合物的中間體的吖啶化合物，以下式(IIb)代表其中Q』代表基團-S-、基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，m2代表0～2的數；以及n代表1～2的數。7.一種製備下式(Ib)所代表的吖啶化合物的方法其中Q代表基團-S+RX--、基團-N+RR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)；R代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基；X代表易轉換成陰離子的消去基團；m2表示0～2的數；以及n表示1～2的數，它包括使下式(III)代表的烷基化試劑R-X(III)其中R及X的含義同上面的規定，作用於下式(IIb)代表的吖啶化合物其中Q』代表基團-S-、基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)；m2及n的含義同上面的規定。8.一種製備下式(IIb』)所代表的吖啶化合物的方法其中Q1代基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)；m2代表0～2的數；以及n代表1～2的數，它包括使一種下式(VI)代表的含消去基團的苯酚化合物其中Y1代表消去基團，m2的含義同上面的規定，與9-吖啶羧酸衍生物發生反應，該羧酸衍生物可用下式(VII)代表其中Y2代表消去基團，結果獲得用下式(VIII)代表的化合物其中Y1及m2的含義同上面的規定；然後讓如此得到的化合物與下式(IX)代表的多胺在適當的鹼存在下進行反應H-Q1-(CH2)n-N(Ra)2(IX)其中Q1及n的含義同上面的規定，Ra中每一個獨立地是氫原子或氨基保護基團，而且化合物式(IX)的一端含有伯氨基，所述伯氨基任選的由一個或兩個保護基團保護著，伯氨基或仲氨基在其相反端，結果獲得由下式(X)代表的9-吖啶酯其中Q1、Ra、m2及n的含義同上面的規定；然後，當一個或兩個端伯氨基的保護基團存在時，消去該一個或兩個保護基團；最後，使馬來酐作用與之發生反應。9.一種製備由下式(IIb」)代表的吖啶化合物的方法其中Q2代表基團-S-或基團-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，m2表示0～2的數，n代表1～2的數，該方法包括使下式(XI)代表的苯酚衍生物其中Q2、m2及n的含義同上面的規定；Ra中每一個獨立地是氫原子或氨基保護基團，而且該衍生物含有硫醚或聚醚結構，該結構的一端含有由一個或兩個保護基團保護起來的伯氨基，與下式(VII)代表的9-吖啶羧酸衍生物進行反應其中Y2代表消去基團，結果獲得下式(XII)代表的吖啶酯其中Q2、Ra、m2及n的含義同上面的規定；在脫去端氨基的保護以後，使馬來酐與之發生反應。10.一種分析物的標記方法，它包括使下式(I)代表的吖啶化合物其中A代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q-(CH2)n-其中Q代表基團-S+RX--、基團-N+RR1X--，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)，m1代表1～6的數，m2表示0～2的數，n表示1～2的數；R代表含有1～6個碳原子的烷基或芳基；以及X-代表陰離子，與所述分析物中的巰基起反應。11.一種分析物的預標記方法，它包括使下式(II)代表的吖啶化合物其中A』代表如下基團-(CH2)m1-或者-(CH2)m2-Q』-(CH2)n-其中Q』代表基團-S-、基團-NR1-，其中R1代表含有1～6個碳原子的烷基、基團其中R2及R3可以相同或不同並且每一個獨立地是基團-(CH2)k-(k1～3的數)或者是-O(CH2CH2O)l-(l1～3的數)；以及m1、m2及n的含義同上面的規定，與所述分析物中的巰基起反應。全文摘要包含通式為(Ⅰ)的吖啶化合物或其中間體的用於標記巰基的試劑;製備吖啶化合物的方法;以及用它們標記分析物的方法;其中A是－(CH文檔編號C07D401/14GK1194642SQ97190552公開日1998年9月30日申請日期1997年3月14日優先權日1997年3月14日發明者今井一洋,江藤博通,小番健志,成田雅申請人:愛詩愛詩製藥株式會社