在不存在其輔因子的情況下具有凝血活性的因子ix變體及其治療出血障礙的用途的製作方法

2023-05-06 06:19:51 5

專利名稱：在不存在其輔因子的情況下具有凝血活性的因子ix變體及其治療出血障礙的用途的製作方法
在不存在其輔因子的情況下具有凝血活性的因子IX變體 及其治療出血障礙的用途本發明涉及凝血級聯的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶的變體，優選因子IX (F. IX)的變體，其中該變體的特徵在於在不存在其輔因子的情況下具有凝血活性。本發明還 涉及這些變體用於治療和/或預防出血障礙中的用途，尤其是血友病A和/或血友病B或 由F. VIII的抑制性抗體引起或使其並發的血友病。本發明還涉及具有期望性質並且因此 可被剪裁用於各種特性治療用途的因子IX (F. IX)的其它變體。發明背景 凝血因子IX
凝血因子IX (F. IX)在凝血級聯中起著核心的作用。F. IX是胰蛋白酶樣維生素-K依 賴性絲氨酸蛋白酶，其作為單鏈無活性酶原在血漿中循環(Dikipio等，1977; Davie等， 1991)。因子IX通過因子XIa活化或通過VIIa-組織因子以Ca2+依賴性的方式活化。該活 化需要通過經活化的因子VII (F. VIIa)-組織因子複合物或活化的因子XI (F. XIa)切割兩 個肽鍵(Fujikawa等，1974; Lindquist等，1978)以移除；35殘基活化肽。F. IX是多結構域蛋白質。在N-端γ -羧基穀氨酸(GLA)結構域之後是兩個表皮 生長因子樣(EGF)重複、活性肽(AP)和具有胰蛋白酶樣活性部位的C-端絲氨酸蛋白酶結 構域(Dikipio等，1978)。這一結構域結構定義了凝血因子的絲氨酸蛋白酶家族(Furie 和Furie，1988)，所述家族還包括因子II (F. II)、因子VII (F. VII)、因子X (F. X)、因 子XI (F. XI)、因子XII (F. XII)以及蛋白C (PC)。在這一家族中，F. DCa具有獨特的蛋 白水解性質。F. DCa與F. VIIIa在磷脂表面上形成複合物使針對天然底物F. X的反應性增 加至IO6倍，然而幾乎沒有觀察到具相應的F. X序列的肽的切割(McRae等，1981)。活化的因子IX (F. IXa)然後在依賴於鈣離子、膜表面(磷脂)和非酶蛋白輔因 子、活化的因子VIII (F. Villa)存在的反應中活化因子X (F. X) (Davie等，1991)。F. DCa在止血中的重要性通過在F. IX基因中攜帶有突變的個體的出血障礙血友 病B的發生得以反映(Gianelli等，1998)。F. DCa在缺乏其輔因子F. VIIIa的情況下對天 然或合成底物僅顯示出很少的蛋白水解活性。F. VIIIa的結合導致F. X蛋白水解活性升高 至IO6倍，而對肽底物的活性保持很少的影響(Duffy和Lollar，1992 ； McRae等，1981)。 F. IXa調節的後者的底物依賴性活性在相關的凝血酶活化的PC(輔因子蛋白S)、F. Xa (輔 因子Va)、F. Vila (輔因子組織因子)和FIIa (輔因子血栓調節蛋白)中都類似地觀察 到了，它們在其輔因子的存在下，達到顯著的活性或與它們天然底物的特異性的改變(Marm 等2003)。所有的凝血絲氨酸蛋白酶共享廣泛的結構和功能同源性。此外，凝血因子IXa (F. IXa)和(F. Xa)均僅在磷脂表面與輔因子一起才有效 地切割天然底物。Hopfner等(1997)在大腸桿菌coli)中研究了截短的F. IXa (rf9a) 和F. Xa (rflOa)變體，以鑑定F. IXa的醯胺分解活性為F. Xa的1/104的差異的決定因素。 基於F. IXa和F. Xa的晶體結構，隨後在rf9a和rf IOa之間交換四個特徵性活性位點成分 (即基於糜蛋白酶編號的Glu219、148-環、Ile213、99_環)。此外，結合所有四個突變基本 上將F. Xa的性質引入了 rf9a中，即具有F. Xa底物選擇性的醯胺分解活性增加至130倍。
在酶學上，F. IXa的特徵在於其非常低的醯胺分解活性，這在輔因子即因子VIIIa (F. Villa)的存在下也沒有提高，這使得F. DCa與所有其他凝血因子相區分。F. IXa-F. VIIIa複合物的活化需要其大分子底物因子X(F. X)。靠近活性位點的99-環部分地解釋了 F. DCa較差的活性，因為其採取了幹擾典型底物在亞位點S2-S4結合的構象。Sichler等 (2003)公開了殘基Lys-98和Tyr_99 (糜蛋白酶編號)與F. 1 的醯胺分解特性密切相關。 用較小的殘基替換Tyr-99不僅導致整體降低的活性，還導致了在Sl中受損的結合。用較 小且不帶電的殘基替換Lys-98增加了活性。同時誘變Lys-98、Tyr-177和Tyr_94 (rf9-Y94F/K98T/Y177T,糜蛋白酶編號))產生了具有升高至7000倍的活性及經改變的對因子 敘的特異性的酶。Sichler等Q003)得出結論，這些殘基對低因子DCa活性負責。Sichler 等認為，該三聯突變rf9- Y94F/K98T/Y177T(糜蛋白酶編號)很可能模擬了生理上 由輔因子和底物結合所誘導的構象改變。血友病
最著名的凝血因子病症是血友病。血友病是一類遺傳性病症的名稱，所述病症損害了 機體控制血液凝固、或凝聚的能力。血友病A是最常見的形式，其由因子VIII(F. VIII)基 因的突變所引起，所述突變導致了 F. VIII的缺陷。該遺傳是X-連鎖隱性基因，因此，雄性 受到影響，而雌性是攜帶者或非常少的顯示溫和表型。5000雄性中有1個受到影響。血友 病B也稱為因子IX (F. IX)缺陷，其為第二常見的血友病類型，但是血友病B遠不如血友 病A常見。這些遺傳缺陷可降低正常凝結過程所需的凝血因子的血漿凝血因子水平。當血管 受到損傷時，確實會形成臨時性結痂，但是缺乏的凝血因子阻礙了維持血塊所需的纖維蛋 白的形成。因此，血友病患者不會比正常人更強烈地出血，但是會出血長得多的時間。在嚴 重的血友病患者中，甚至很小的創傷也將導致血液的喪失持續數天、數周或甚至不能完全 癒合。這裡嚴重的危險是由於缺乏F. VIII的正常小流血需要長時間來痊癒。在諸如大腦 或內部關節區域，這可能是致命的或會使生命衰弱。外部創傷的流血是正常的，但是後期再 流血和內部流血的發生率升高，尤其是流入肌肉、關節或流入封閉的空間。主要的併發症包 括關節積血、出血、胃腸道出血和月經過多。儘管沒有對血友病的療法，但其可通過規則地輸注缺陷凝血因子(即，血友病A中 的F. VIII，或血友病B中的F. IX)而得以控制。在西方國家，對於血友病的護理的通常標準落入以下兩種類型之一 (i)預防或請求式。預防包括以規則的方案輸注凝血因子，以保持高到足以預防自發流血發作的 凝血水平。請求式治療包括一旦出現出血發作時對其進行治療。然而，一些血友病患者產生了針對給予他們的替代因子的抗體(抑制劑)，因此必 須升高該因子的量或必須給予非人替代產品，諸如豬F. VIII或其經修飾的變體，例如參見 WO 01/68109 Al (Emory University)。如果作為循環的抑制劑的結果使得患者變得對替代凝血因子具耐性，這可用重組 人因子 VII (NovoSeven )來克服，也參見 EP 1 282 438 Bl 和 EP 1 282 439 Bl (Novo Nordisk) 0目前這一方法的限制是因子Vila分別與因子VIII (10至14小時)或因子IX (18 至30小時)相比短的、且取決於製備的短半衰期0至3小時)，這使得使用因子VIIa的預 防治療有困難。此外，在長時間間隔應用已經活化的蛋白酶(例如因子Vila)的風險可能攜帶風險，包括血栓形成風險、血管內皮的恆久活化以及血管損傷的風險、促-凝血信號傳 導可能促進腫瘤生長或轉移的風險，等等。WO 02/40544 A2公開了在肝素結合結構域包含突變的突變型人因子IX，與野生型 F. IX相比，其降低了該突變型人F. IX對肝素的親和力，並且公開了它們在血友病B的治療 幹預中的用途。基因治療
血友病對於基因治療方法是理想的，因為所需要凝固作用是在血流中循環的，並且因 此可在機體的每一處基礎地表達。此外，對具有嚴重形式疾病的患者的預防治療的研究已 證實了循環凝血因子超過1%的最小提升已經能夠改善臨床結果並且避免多數由該疾病引 起的損害，即關節破壞。已經開發了數種基因治療方法，但測試仍在早期臨床階段。最有希 望的方法是當前的使用腺相關病毒載體(AAV)治療血友病B。肌肉內注射AAV至患有血友病的人的骨骼肌中是安全的，但是為達到治療的因子 IX水平需要較高的劑量。然而，劑量增加在這一方法中是不可能的，因為形成抑制抗體的風 險取決於每一注射位點的肌肉中表達的F. IX抗原量。在血友病B狗模型中的估測得到了這 樣的結論，為了在人體中獲得約1%的F. IX表達水平將需要超過400次肌肉內注射(Arruda 等，2004)。因此，這一方法不能用於人。這一方法的效力受到F. IX在肌肉細胞外空間中 滯留的妨礙，以及受到肌肉以高表達率合成完全活性F. IX的有限的能力的妨礙。為克服這 些限制，Schuettrumpf等Q005)構建了編碼F. IX變體的AAV載體，用於血友病B小鼠中 的肌肉或肝臟定向表達。肌肉內注射AAV-F. IX-K5A/V10K (F. IX編號)(對細胞外基質具 有低親和力的變體)後，循環F. IX水平是野生型(WT)F. IX的2-5倍高，而蛋白質比活保持 類似。在載體分別遞送至骨骼肌或肝臟後，F. IX-R338A的表達產生了為F. IX-WT的2或6 倍高的比活的蛋白。在通過尾剪除測試的攻擊時，F. IX-WT和變體形式在體內提供了有效的 止血。重要的是，肌內注射AAV-F. IX變體沒有在對F. IX-WT耐受的小鼠中引發針對F. IX 的抗體形成。除了所提到的首先由Chang等(1998)描述的R338A變體之外，已經還描述了 具有更高F. IX比活的另一變體V86A (Chang等，2002)。與血友病B相比，對血友病A的基因治療策略的應用更為複雜，這是由F. VIII比 F. IX更高的免疫原性和更大的大小導致的。因此，本領域需要提供改進的用於治療和/或預防出血障礙，尤其是血友病A和/ 或B的工具和方法。因此，本發明的目標是改進現有技術中存在的用於治療和/或預防出血障礙的方 法和工具，並且因此本發明的目的是提供允許有效、特異性和靶向治療和/或預防出血障 礙，尤其是血友病A和/或B的經改進的方法和工具。根據本發明，這一目的通過提供凝血級聯中的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶的變 體得以解決，其中該變體的特徵在於在不存在其輔因子的情況下具有凝血活性。凝血因子VII (F. VII)、IX (F. IX)和X (F. X)以及輔因子抑制蛋白C(其降解輔 因子F. Va和F. Villa)以及凝血酶是凝血級聯中的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶。維生素 K是對肝Y -谷胺醯基羧化酶重要的因子，其將羧基加到因子II (凝血酶)、VII、IX和X，以 及蛋白S、蛋白C和蛋白Z的穀氨酸殘基上(在Gla結構域中)。如上面所討論的那樣，包括因子II (F. II)、因子VII (F. VIII)、因子IX (F. IX)、因子X (F.X)和蛋白C (PC)的凝血因子絲氨酸蛋白酶家族由特定的結構域結構所定義 (Furie 和 Furie, 1988)。絲氨酸蛋白酶由在該酶的活性位點存在絲氨酸殘基來表徵。所提到的蛋白以酶原 形式循環，並通過活性部位的切割得以活化。在所有維生素K-依賴性凝血蛋白酶之間存 在高同源性。它們中的若干種僅在組裝於由蛋白酶、輔因子和磷脂膜組成的複合物中時才 顯示出活性的升高。輔因子結合的分子效果及結合位點在這些蛋白之間是類似的。F. DCa 調節的後者的底物依賴性活性在相關的凝血酶活化的PC(輔因子蛋白S) ,F. Xa (輔因子 Va) ,F. VIIa (輔因子組織因子)和FIIa (輔因子血栓調節蛋白)中都類似地觀察到了，它 們在其輔因子的存在下，達到顯著的活性或與它們天然底物的特異性的改變(Hockin等， 2002)。因此，凝血級聯中的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶的變體優選選自VII (F. VII)、 因子IX (F. IX)、因子X (F. X)、蛋白C或凝血酶的變體。術語「變體」優選指胺基酸替換、添加(插入)或缺失變體，或天然存在的蛋白的 衍生物。變體還包括包含經修飾的胺基酸、非天然胺基酸或肽模擬物(P^tidomimetic)或 其它可模擬肽鍵/結構的化合物的胺基酸序列。變體還可以包含用其它分子的一部分替換 或偶聯、或與其它分子偶聯。胺基酸替換包含通過其它胺基酸的或通過等構物(isostere，擁有與蛋白質氨基 酸的相近結構和空間相似性的經修飾的胺基酸)的保守及非保守替換、胺基酸添加或等構 物添加。保守胺基酸替換通常涉及相同類胺基酸之間的替換。這些類包括，例如 -具有不帶電極性側鏈的胺基酸，諸如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨
酸；
-具有鹼性側鏈的胺基酸，諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸； -具有酸性側鏈的胺基酸，諸如天冬氨酸和穀氨酸；以及
-具有非極性側鏈的胺基酸，諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸以及半胱氨酸。因子IX的變體蛋白
在本發明的優選的實施方案中，提供了維生素K-依賴性絲氨酸蛋白酶因子IX (F. IX) 或活化的因子XI (F. IXa)的變體，其中該F. IX變體的特徵在於其在不存在其輔因子的情 況下具有凝血活性，其中該輔因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)。本專利申請中的因子IX (F. IX)是指由Kurachi和Davie, 1982描述的人F. IX蛋 白和cDNA。對於mRNA/cDNA 的 Ref seq NM_000133 (SEQ ID NO. 1 )禾口 對於蛋白質序列的 Refseq NP_000124 (SEQ ID NO. 2)。SEQ ID NO. 2的胺基酸序列含有信號肽和F. IX的前肽。實際的編號從-46 (Met) 開始；+ 1是Tyr。在F. IX的基因以及胺基酸序列中存在多個天然存在的多態性。以下顯示了來自 King's College London ^ifil^^f B(Hemophilia B Mutation Database)白勺歹Ij 表(例如參見 http://www. kcl. ac. uk/ip/petergreen/haemBdatabase. html)。例如，最常
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權利要求
1.因子IX(F.IX)或活化的因子IX(F. IXa)的變體，其特徵在於其在不存在其輔因子 的情況下具有凝血活性，其中所述的輔因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)， 優選包 含至少 一個選 自 255 至 269, 383 ISl, 290, 388, 34, 25, 353 35S, 338,.3.77,. 4 86, 217, 277的位置上的胺基酸替換， 和/或99-環的修飾，更優選選自 IC265T； K265A, !3S3V, V1SH, 1290L, E388G, N34D, F25Y, F353Y, R358A, R338A, R33IL, S377W, G4Y. V86A, V2I7L, ￡277A的胺基酸替換，和 / 或99-環的修飾。
2.權利要求1的變體因子IX，其包含位置沈5上的胺基酸替換或胺基酸替換K265T，其與至少一個選自 383, 181, 290, 388, 34, 25, 353, 358, 338 377, 4,16,21 和 / 或 277 的位置上的胺基酸替換 結合；優選位置265上的胺基酸替換或胺基酸替換K265T，其與選自G4Y. V86A, V217L和/或E277A的胺基酸替換結合。
3.權利要求1或權利要求2的變體因子IX，其中所述的變體的特徵在於在不存在輔因子F. VIII的情況下具有凝血活性， 其包含至少一個選自265、383、181和四0的位置上的胺基酸替換， 優選包含位置265上的胺基酸替換或胺基酸替換K265T，其與選自383、181和/或290 位置上的胺基酸替換結合，更優選包含位置265上的胺基酸替換或胺基酸替換K265T，其與選自I383V、V181I和/ 或I290L的胺基酸替換結合。
4.權利要求2或權利要求3的變體因子IX，其中位置265上的胺基酸替換選自K265T、 K265A、K265G、K265V、K265N和 K265D。
5.權利要求1至4任一項的變體因子IX，其中所述的變體的特徵在於其在不存在輔因子F. VIII的情況下具有凝血活性，但是 與野生型相比、優選與變體因子IX K265T或與權利要求3的變體因子IX相比具有降低的 輔因子F. VIII存在下的活性，其包含至少一個在選自265、383、388、34、25、353和/或358的位置上的胺基酸替換， 優選包含胺基酸替換K265T，其與在選自383、388、34、25、353和/或358位置上的氨基 酸替換結合，更優選包含胺基酸替換K265T，其與選自I383V、E388G、N;34D、F25Y、F;353Y和/或R358A的胺基酸替換結合， 或包含至少一個在選自265、383、181、290、388、34、25、353和/或358位置上的胺基酸替換，優選包含胺基酸替換K265T，其與選自383、181、290、388、34、25、353和/或358的位置上的胺基酸替換結合，更優選包含胺基酸替換K265T，其與選自I383V、V181I、I290L、E388G、N34D, F25Y、 F353Y和/或R358A的胺基酸替換結合。
6.因子IX(F.IX)的變體，其特徵在於與野生型相比，其具有升高的在其輔因子存在下 的凝血活性，其中所述的輔因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)，其優選包含至少一個在選自338、377、4、86、217和/或277的位置上的胺基酸替換，更優選地包含至少一個選自R338A、R338L、S377W、G4Y、V86A、V217L和/或E277A的胺基酸替換。
7.權利要求1、2或6任一項的變體因子IX，其中所述變體的特徵在於其在不存在輔因子F. VIII的情況下具有凝血活性，並且具 有與野生型相比升高的在輔因子F. VIII存在下的凝血活性，其包含至少一個在選自沈5、338、377、4、86、217和/或277的位置上的胺基酸替換， 優選包含胺基酸替換K265T，其與在選自338、377、4、86、217和/或277的位置上的氨基肽替換結合，更優選包含胺基酸替換K265T，其與選自R338A、R338L、S377W、G4Y、V86A、V217L和/或 E277A的胺基酸替換結合， 或包含至少一個在選自265、383、181、290、338、377、4、86、217和/或277的位置上的胺基酸替換，優選包含胺基酸替換K265T，其與在選自383、181、290、338、377、4、86、217和/或277 的位置上的胺基酸替換結合，更優選地包含胺基酸替換K265T，其與選自I383V、V181I、I290L、R338A、R338L、S377W、 G4Y、V86A、V217L和/或E277A的胺基酸替換結合。
8.權利要求1至7任一項的變體因子IX，選自
9.權利要求1至7任一項的變體因子IX，選自變體K265T或具有在位置265上的胺基酸替換的變體(優選選自K265T、K265A、K265G、 K265V、I^65N 和，優選與位置181和/或383上的胺基酸替換(優選V181I和/或I383V)結合， 更優選
10.權利要求1至9任一項的變體因子IX，包含其它的化合物或部分，其優選與該變體 共價連接，諸如蛋白質、標記和/或聚合物。
11.編碼權利要求1至10任一項的變體因子IX的核酸，優選與啟動子和/或終止子序列可操作地連接，其更優選為表達質粒、基因治療構建物、病毒或非病毒載體或用於基因修復的模板。
12.藥物組合物，其包含至少一種權利要求1至10任一項的因子IX(F.IX)的變體，或 至少一種權利要求11的核酸，以及任選地可藥用載體和/或賦形劑。
13.權利要求1至10任一項的因子IX(F.IX)的變體、權利要求11的核酸或權利要求 12的藥物組合物，用於診斷、預防和/或治療疾病。
14.權利要求13的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物，其中所述的疾病是出血 障礙或出血，其中所述的出血障礙優選是血友病A、由針對因子F. VIII或F. VIIIa的抑制性抗體引 起或使其並發的血友病、血友病B，和/或其中所述的出血障礙或出血是其中使用了旁路試劑的出血障礙，包括例如新生 兒凝血病；嚴重肝病；高風險外科手術；外傷血喪失；骨髓移植；血小板減少和血小板功能 障礙；口服抗凝藥的緊急逆轉；因子V、VII、X和XI的先天性缺陷；以及具有血管性血友病 因子抑制劑的血管性血友病；與大傷相關的血喪失；腦出血；血小板功能障礙。
15.權利要求13或14的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物，其用於細胞治療、 基因治療、蛋白質輸注治療。
16.權利要求13至15任一項的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物，其中所述的因子IX(F. IX)的變體是變體D65T或如權利要求3、4、5或7任一項定義的，並且其中所述的疾病是血友病A或由針對因子F. VIII或F. VIIIa的抑制性抗體引起 或使其並發的血友病。
17.權利要求13至15任一項的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的變體如權利要求3至7任一項所定義，並且其中所述的疾病是血友病B。
18.權利要求13至16任一項的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的變體如權利要求5所定義，用於最小化血栓形成的風險。
19.權利要求13至18任一項的因子IX(F.IX)的變體、核酸或藥物組合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的變體如權利要求3、4、5或7所定義，用於診斷、預防和/或治療血友病A、或由針對因子F. VIII的抑制性抗體引起或使其並 發的血友病或血友病B。
20.篩選抗凝劑、優選直接抑制F.DCa的物質的方法，包括應用權利要求1至10任一項 的變體因子IX。
全文摘要
本發明涉及凝血級聯的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶的變體,優選因子IX(F.IX)的變體，其中該變體的特徵在於在其輔因子不存在的情況下具有凝血活性。本發明還涉及這些變體用於治療和/或預防出血障礙中的用途，尤其是血友病A和/或血友病B或由針對F.VIII的抑制性抗體引起或使其並發的血友病。本發明還涉及具有期望性質並且因此可被設計用於各種特異性治療用途的因子IX(F.IX)的其它變體。
文檔編號C12N9/64GK102112608SQ200980129669
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月28日 優先權日2008年7月28日
發明者E.塞弗裡德, J.塞特魯姆普夫 申請人:巴登－符滕堡－黑森Drk－獻血服務有限責任公司