抗hla單克隆嵌合免疫球蛋白,使用這種單克隆嵌合免疫球蛋白的方法和試劑盒的製作方法

2023-05-06 14:00:36

抗hla單克隆嵌合免疫球蛋白,使用這種單克隆嵌合免疫球蛋白的方法和試劑盒的製作方法【專利摘要】本發明涉及測定含有抗體的液體介質中抗HLA抗體的量的方法。【專利說明】抗HLA單克隆嵌合免疫球蛋白，使用這種單克隆嵌合免疫球蛋白的方法和試劑盒[0001]本發明涉及測定含有抗體的液體介質中抗HLA抗體的量的方法。本發明也涉及用於實施這種方法的抗I類HLA或抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白。本發明特別涉及適於可以尤其作為用於檢測和量化液體介質、尤其是生物學液體介質的抗HLA抗體的標準反應試劑的所述單克隆嵌合免疫球蛋白。本發明特別涉及具有一方面單克隆抗體的功能和另一方面嵌合結構的所述單克隆嵌合免疫球蛋白。本發明也涉及使用所述單克隆嵌合免疫球蛋白檢測液體介質中的抗HLA抗體的標準化檢測方法和量化液體介質中抗HLA抗體的定量方法。特別地，本發明涉及患者、尤其是接受了移植或等待移植的患者的血清中抗HLA抗體的定量方法。[0002]此外，本發明涉及用於實施所述方法的診斷試劑盒。特別地，本發明涉及適合於能夠定量液體介質、尤其是在患者上取樣的生物學液體的抗HLA抗體的方法和試劑盒，其是精確的、可靠的和快速的。[0003]在器官移植領域中，自1930年代以來已知在供者的組織組（例如由HLA抗原（人類白細胞抗原）所限定的）與受者的免疫系統（尤其是抗體）之間的相容性對於器官移植的成功是必需的。[0004]HLA抗原由是非常免疫原性的兩類膜蛋白：1類HLA分子和II類HLA分子攜帶。因此，個體暴露於同種異體HLA抗原，S卩外人的並不同於其自身的抗原，可以引起針對這些抗原的免疫應答的發展。該免疫應答可以是細胞介導的（同種異體反應性T淋巴細胞）或體液介導的（抗HLA抗體的合成）。[0005]I類HLA抗原由三個基因HLA-A、HLA-B和HLA-C編碼，其多態性由分別為HLA-A、HLA-B和HLA-C的三個等位基因系列負責。II類HLA抗原由基因HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR編碼。[0006]在器官移植中，關鍵的是使向等待移植的患者提供表達該患者早已或已經被免疫的HLA抗原的移植物的危險最小化甚至抑制它。這是因為，在該情況下，幹預超急性的，即在移植後少於24小時的延遲內的體液排斥的危險是重要的。此外，在移植監測的背景下，提早檢出在接受移植物的患者中存在針對移植物的抗原的抗體使得能夠儘可能提早地治療所述接受了移植物的患者以便試圖阻止能夠引起移植物破壞的體液應答的發展。[0007]因此，被移植的患者和等待移植的患者的同種異體免疫的監測對於確保移植物和被移植患者的存活是首要的。[0008]在該背景下，必不可少的是，能夠研究、鑑定和定量在等待移植的患者中和在被移植的患者中的抗HLA抗體。已經開發了許多研究這些抗HLA抗體的技術。[0009]特別地，已知所謂的"補體依賴微量淋巴細胞毒性"技術。該技術包括將患者尤其是移植接受者的血清，在兔補體存在下，呈遞給一系列已知其HLA類型的細胞。如果特異於由這些細胞攜帶的HLA抗原的抗體（Ac)存在於所測試的血清中，並且這些抗體能夠激活補體（IgM類的和IgG-I和IgG-3亞類的抗體），那麼補體依賴的細胞裂解（CDC，補體依賴的細胞毒性）就揭示了抗體的存在。藉助於一組表達不同HLA抗原的細胞，因此可以檢出這些抗體，然後鑑定其特異性。該參考技術使得能夠檢測對於移植物最危險的溶細胞性抗HLA抗體。然而，相對於更近期的技術而言，該技術具有低靈敏性。該技術需要擁有各種各樣的來自己知其HLA表型的供者的淋巴細胞，需要在體外培養大量的HLA類型的細胞系，因此其實施是複雜和繁重的。[0010]也知道更靈敏的技術，例如固體支持物上的免疫酶法測定（ELISA，酶聯免疫吸附測定）。此外，最近出現了在流式細胞術原理上設計的與流式檢測聯合的免疫螢光測定技術。流式免疫螢光測定的原理包括將純化的I類HLA或II類HLA抗原固定在聚苯乙烯珠的表面。識別I類HLA或II類HLA抗原的抗HLA抗體與結合在珠表面的抗原相結合併在洗滌聚苯乙烯珠後，由偶聯至螢光基團的抗IgG二抗進行揭示。二抗通過流式細胞術進行檢測。此外其螢光強度也被定量。[0011]對於檢出試驗，混合使用多個類型的珠，每一類型的珠在表面上攜帶多個HLA抗原，要麼I類的，要麼II類的。這樣一種方法使得能夠檢測抗HLA抗體的存在，然而不能鑑定特異性。[0012]相反，對於抗體特異性的鑑定和表徵，混合使用多個類型的珠，每一類型的珠在表面上攜帶唯一的HLA抗原。[0013]已知用於檢測和鑑定抗HLA抗體的試劑盒。它們包含包被有I類HLA抗原或II類HLA抗原的聚苯乙烯珠和包被有人IgG的聚苯乙烯珠。偶聯至藻紅蛋白的抗人IgG二抗和作為陰性對照的沒有抗HLA抗體的血清也已商業化。這種陰性對照適合於定量二抗在聚苯乙烯珠上的非特異固定。此類試劑盒不包含任何陽性對照，也不包含任何靈敏性對照，也不包含任何使得能夠從所測得的螢光強度開始準確推斷所分析的介質中抗HLA抗體的濃度（例如，以摩爾/升或克/升表示的）的標準物。[0014]此外，沒有校準和/或靈敏性對照的此類試劑盒不能測定分析方法的靈敏性閾值，即能夠確認所觀察到的信號顯著高於測量背景噪音的最小信號值。[0015]為了克服在抗HLA抗體的檢出和/或定量方法中陽性對照的這一缺點，免疫學和組織相容性實驗室使用針對多種HLA抗原免疫的多個個體的多個血清的混合物作為陽性對照。[0016]在這種陽性對照中，被免疫個體的血清的每一種抗體的各自濃度是未知的。這種血清混合物不能將螢光測量強度與血清混合物的特異性抗體的濃度（摩爾/升或克/升）相關聯。因此它不能定量被移植的或等待移植的患者的血清中存在的抗體。因此不得不再評估實際發生超急性體液應答的危險。[0017]這種血清混合物的反應性從一種抗原到另一種是可變的並且其使用不能固定對所研究的每一種HLA抗原的檢測閾值。此外，這種來自患者血清的多克隆抗體混合物以有限量可用並且很快就耗盡。因此，為了結果的標準化，需要用本身以可變的量也可用的在實驗室之間不會變化的另一種混合物代替它。從一個批次到另一個的血清混合物的可變性需要這些批次的頻繁驗證，這些批次從一個批次到另一個既不是可比較的也不是可重現的。[0018]通過使用這種血清混合物，【發明者】人證明了（圖2、3和4)，與每一類型聚苯乙烯珠相關的螢光強度的值取決於由每一類型聚苯乙烯珠所攜帶的I類或II類HLA抗原的性質。此外，該與每一類型聚苯乙烯珠相關的該螢光強度值隨時間，尤其是在五個月內顯示大的變化。該值在1000和20000平均螢光單位之間變化（圖4,陰影線直方圖）。[0019]結果表明，對於所有聚苯乙烯珠所測得的螢光強度的平均值具有大的離差（通過其均方根偏差所計算的），其不能定量液體介質的抗HLA抗體。在作為現有技術標準舉例說明給出的本專利申請圖4(陰影線直方圖）中展示了這種離差。[0020]這種螢光強度測量值離差不能，特別是對於低的螢光強度值，區別低的但表示了低濃度抗HLA抗體的存在的螢光強度值與不能與測量背景噪音相區別的低的螢光強度值。[0021]由於前面所陳述的相同原因，這種在現有技術中作為陽性對照使用的製備物不能精確地測定存在於液體介質中，尤其是在被移植的和等待移植的患者上取樣的血清中的抗體濃度。[0022]本發明旨在通過提供在抗I類HLA抗體或抗II類HLA抗體的血清學分析中，尤其是在器官移植的背景下，作為標準化試劑和陽性對照和靈敏性試劑的單克隆嵌合免疫球蛋白，來克服這些缺點。[0023]本發明旨在通過提供適合於允許患者血清中抗HLA抗體的可靠定量的單克隆嵌合免疫球蛋白來克服前面所述的缺點。這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白特別地適合於允許檢測患者中針對移植物抗原的抗體的突然出現，甚至對於非常低濃度的這種抗體。[0024]本發明旨在提供適合於抗HLA抗體檢測方法的標準化的單克隆嵌合免疫球蛋白。特別地，提供使得能夠精確地確定檢測閾值，根據本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白允許生物學家驗證抗體的研究方法。[0025]本發明旨在提供這樣的單克隆嵌合免疫球蛋白，其適合於允許儘可能提早地檢測針對移植物的HLA抗原的抗HLA抗體的突然出現。這種提早檢測特別地使得能夠儘可能快地檢測體液排斥並因此快速地開出治療性地治療所移植的器官的排斥的方案。[0026]本發明旨在提供這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白，其允許對生物學液體中抗HLA抗體的研究方法進行標準化和校準。[0027]本發明還旨在提供這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白，其能夠允許按照合乎醫學分析實驗室認可的新的規定標準，認可抗HLA抗體的檢出、定量和表徵的標準化方法。在法國，醫學分析實驗室，尤其是免疫學實驗室，應當滿足COFRAC(法國認可委員會（Comit6Franfaisd，Accreditation))的15189標準。[0028]本發明也旨在提供至少一種在檢出抗HLA抗體，尤其是通過免疫螢光測定法的試驗中，作為定量校準試劑的單克隆嵌合免疫球蛋白的組合物。[0029]特別地，本發明旨在提供至少一種在通過Luminex?技術檢出抗HLA抗體的試驗中作為定量標準物的單克隆嵌合免疫球蛋白的這樣一種組合物。[0030]本發明也旨在提供至少一種在通過流式細胞術、通過ELISA技術或補體依賴微量淋巴細胞毒性來檢出抗HLA抗體的試驗中作為定量標準的單克隆嵌合免疫球蛋白的這樣一種組合物。[0031]因此，本發明旨在提供這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白和至少一種單克隆嵌合免疫球蛋白的這樣一種組合物，所述單克隆嵌合免疫球蛋白用作定量標準代替來自一個或幾個患者血清的混合物的複雜抗體混合物的。[0032]本發明也旨在提供這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白，其可以大量獲得並且其生產就抗HLA抗體的濃度和組成而言是完全標準化的。[0033]此外，本發明旨在提供這樣一種單克隆嵌合免疫球蛋白的穩定水溶液，所述單克隆嵌合免疫球蛋白濃度對於檢出和/或定量和/或表徵液體介質中抗HLA抗體方法的標準化而言是已知的。[0034]因此，本發明涉及測定包含抗體的液體介質中抗HLA抗體的量的方法，其中：[0035]-製備單克隆嵌合免疫球蛋白的多種溶液（Sn)，尤其是水溶液，每一種溶液（Sn)具有所述單克隆嵌合抗體的確定濃度值（Cn);然後[0036]-使每一種溶液（Sn)與相同確定量的至少一種固定化的HLA抗原相接觸；和[0037]_建立校準曲線，其中每一個確定的濃度值（Cn)與參數的測量值（Vn)相關，所述測量值（Vn)表示與每一種固定化的HLA抗原的確定量有關的單克隆嵌合免疫球蛋白的量(Qn);和[0038]-從確定的濃度值（Cn)和測量值（Vn)對（Cn，Vn)形成作為單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液（Sn)的單克隆嵌合免疫球蛋白確定的濃度（Cn)的函數的測量值（Vn)的校準和變化曲線；和[0039]_計算參數的值，所謂的閾值，在該閾值以外單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度顯著高於〇;[0040]本發明還涉及這樣的方法，其中單克隆嵌合免疫球蛋白由下述構成：[0041]-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和[0042]-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);[0043]其特徵在於：[0044]_每一條重鏈⑶包含：[0045]〇單克隆抗體的重鏈可變區（Vh)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0046]〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（Ch)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，[0047]並且在於：[0048]-每一條輕鏈（L)包含：[0049]〇單克隆抗體的輕鏈可變區（VJ，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0050]〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由K鏈和A鏈組成的組。[0051]在本文本中，表述"I類HLA抗原"和"II類HLA抗原"（HLA為人白細胞抗原），是指其性質是人的抗原。[0052]因此，本發明也在於提供體外定量抗HLA抗體的方法，其中從本發明的至少一種單克隆嵌合免疫球蛋白的溶液開始製作校準曲線，所述單克隆嵌合免疫球蛋白在所述溶液中具有已知的濃度。[0053]這是因為，本發明人已看到在現有技術中不存在用於使得能夠可靠地和可重現地定量評價液體介質中抗I類HLA抗體和抗II類HLA抗體的濃度的已知方法。[0054]有利地和根據本發明，所述參數選自由螢光參數、發光參數和比色法參數組成的組。[0055]有利地和根據本發明，單克隆嵌合免疫球蛋白的確定濃度（Cx)為至多等於KT4g/mL，尤其是在lOig/mL和l(T4g/mL之間。低於l(T4g/mL的任何濃度可以通過稀釋高濃度、特別是l(T4g/mL級別的溶液而獲得。[0056]有利地，製備本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的逐漸增加的稀釋物。使用已知濃度的本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的這些溶液將單克隆嵌合免疫球蛋白溶液（Sn)的每一個濃度（Cn)與參數的測量值（Vn)相關聯，所述參數選自由螢光參數-尤其是是通過定量免疫螢光測定法（用包被有HLA抗原的珠的Luminex?技術）或通過流式細胞術技術（用淋巴細胞進行的）測得的螢光參數-發光參數-尤其是化學發光參數-和比色法參數組成的組。[0057]有利地和根據本發明，在本發明的方法中，選擇由下述組成的組中的每一個特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和每一個特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體：脊椎動物的單克隆抗體，特別是哺乳動物、尤其是小鼠、大鼠、兔、倉鼠和人的單克隆抗體，和非哺乳動物的脊椎動物、尤其是兩棲動物、鳥類特別是雞形目的單克隆抗體。[0058]有利地和根據本發明，所述參數選自由螢光參數、發光參數和比色法參數組成的組。[0059]有利地和根據本發明，所述螢光參數為螢光強度。因此，螢光參數的每一個值（Vn)為螢光強度。[0060]有利地和根據本發明，通過選自由下列組成的組的技術來測量參數的每一個測量值（Vn):多重定量免疫螢光測定法、流式細胞術、通過固體支持物上的免疫酶法測定方法(ELISA)、競爭結合法和和通過補體依賴微量淋巴細胞毒性的方法。[0061]有利地，在本發明方法的第一個變化形式中：[0062]a)每一個固定化的HLA抗原為固定化在分割狀態顆粒形成的固體支持物的顆粒表面上的HLA抗原；[0063]b)在適合於在固體支持物的HLA抗原與單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液的單克隆嵌合免疫球蛋白之間形成穩定結合的條件下，使固定化的HLA抗原與針對固體支持物的HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液相接觸，然後[0064]c)通過洗滌除去未與固體支持物的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白，然後[0065]d)在適合於在單克隆嵌合免疫球蛋白和二抗之間形成穩定結合的條件下，使與固體支持物的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白與二抗溶液相接觸，所述二抗選自由下列組成的組：螢光二抗、發光二抗和光吸收的和針對單克隆嵌合免疫球蛋白的二抗，然後[0066]e)通過洗滌除去未與單克隆嵌合免疫球蛋白結合的二抗，然後[0067]f)測量與固體支持物的每一個顆粒結合的二抗的至少一個參數並給予該測量一個所述參數的測量值（Vn)，所述參數選自由下列組成的組：螢光參數-尤其是通過定量免疫螢光測定法（用包被有HLA抗原的珠的Luminex?技術）或通過流式細胞術技術（用淋巴細胞進行的）測得的螢光參數-發光參數-尤其是化學發光參數-和比色參數，然後；[0068]g)形成校準曲線；然後，[0069]h)從該校準曲線推斷表明待分析溶液中存在抗HLA抗體的螢光強度閾值。[0070]有利地，在第二個變化形式中和根據本發明，每一個固定化的HLA抗原是存在於至少一個細胞尤其是在體外培養的細胞的表面上的HLA抗原。[0071]有利地，在本發明的方法的該第二個變化形式中：[0072]i)每一個固定化的HLA抗原是存在於至少一個細胞的表面上的HLA抗原；[0073]j)在適合於在細胞的HLA抗原與單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液的單克隆嵌合免疫球蛋白之間形成穩定結合的條件下，使存在於至少一個細胞的表面上的HLA抗原與單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液相接觸，然後；[0074]k)通過洗滌除去未與細胞的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白，然後[0075]1)在適合於在單克隆嵌合免疫球蛋白與二抗之間形成穩定結合的條件下，使與細胞的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白與針對單克隆嵌合免疫球蛋白的二抗的溶液相接觸；然後[0076]m)通過洗滌除去未與單克隆嵌合免疫球蛋白結合的二抗，然後；[0077]n)測量與每一個細胞結合的二抗的至少一個參數並給予該測量一個所述參數的測量值（Vn)，所述參數選自由下列組成的組：螢光參數-尤其是通過定量免疫螢光測定法(用包被有HLA抗原的珠的Luminex?技術）或通過流式細胞術技術（用淋巴細胞進行）測得的螢光參數，發光參數-尤其是化學發光參數-和比色參數，然後；[0078]〇)形成校準曲線；然後，[0079]p)從該校準曲線推斷表明待分析溶液中存在抗HLA抗體的螢光強度閾值。[0080]有利地和根據本發明，分割狀態的固體支持物是基本上球形顆粒形狀和適合於允許其用流式螢光測定法分析的大小。[0081]有利地和根據本發明，通過非線性回歸從螢光強度的測量值確定校準曲線。[0082]有利地和根據本發明，所述液體介質選自由生物學液體尤其是從個體上取樣的血清組成的組。[0083]有利地和根據本發明，所述個體為選自由等待移植的患者和接受了移植的患者組成的組的患者。[0084]有利地和根據本發明，特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體W6/32。[0085]有利地和根據本發明，特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體F3.3。[0086]本發明還提供了單克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗體的檢出方法-尤其是研究方法或鑑定方法_或定量方法中的用途，所述方法選自由多重定量免疫螢光測定法、流式細胞術方法、通過固體支持物上的免疫酶法測定方法（ELISA)和通過補體依賴微量淋巴細胞毒性方法組成的組。[0087]特別地，本發明涉及單克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗體的檢出或定量方法中作為標準化試劑和陽性和靈敏性對照的用途，所述方法選自由多重定量免疫螢光測定法、流式細胞術方法、通過固體支持物上的免疫酶法測定方法和通過補體依賴微量淋巴細胞毒性方法組成的組，其特徵在於：所述單克隆嵌合免疫球蛋白由下列組成：[0088]-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和[0089]-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);[0090]其特徵在於：[0091]-每一條重鏈（H)包含：[0092]〇單克隆抗體的重鏈可變區（Vh)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0093]〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（Ch)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，[0094]和在於：[0095]-每一條輕鏈（L)包含：[0096]〇單克隆抗體的輕鏈可變區（VJ，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0097]〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由K鏈和X鏈組成的組。[0098]因此，在競爭性測定中，使用其中重鏈的恆定部分（Ch)和輕鏈的恆定部分（CJ由人IgA的恆定部分組成的本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白。此類本發明的IgA類單克隆嵌合免疫球蛋白適合於至少部分地抑制患者血清中IgG(或IgM)類抗HLA多克隆抗體的結合。血清IgG的結合被本發明的IgA類單克隆嵌合免疫球蛋白的抑制使得能夠證明IgG與通過下述方法的抗HLA抗體檢出測定中所使用的免疫吸附支持物的結合特異性：具有在Luminex?儀器上的流式讀數的多重免疫螢光測定法、流式細胞術、ELISA技術和補體依賴微量淋巴細胞毒性。[0099]特別地，IgA類單克隆嵌合免疫球蛋白使得能夠區分對應於血清中抗HLAIgG的真正存在的特異信號與對應於IgG吸附在存在HLA抗原的支持物上的非特異性信號。用於抗HLAIgG的研究的本發明的IgA類單克隆嵌合免疫球蛋白的該競爭通過在Luminex?.上的定量免疫螢光測定法得到證實。[0100]本發明的IgG類和IgM類單克隆嵌合免疫球蛋白可以用作通過合適的任何技術(補體依賴微量淋巴細胞毒性或在流式細胞術）就在器官移植前進行的器官受者與供者之間的直接相容性（交叉配血）檢驗的陽性對照和靈敏性對照和在檢測免疫吸附支持物上的IgG或IgM類抗體的任何技術（ELISA或在聚苯乙烯珠上的定量免疫螢光測定法）中的陽性對照和靈敏性對照。[0101]本發明也涉及特異於I類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列組成：[0102]-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和[0103]-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);[0104]其特徵在於：[0105]-每一條重鏈⑶包含：[0106]。單克隆抗體的重鏈可變區（Vh)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0107]O人免疫球蛋白的重鏈恆定區（Ch)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，[0108]和在於：[0109]-每一條輕鏈（L)包含：[0110]〇單克隆抗體的輕鏈可變區（')，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0111]。人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由K鏈和X鏈組成的組。[0112]有利地，形成特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體，以便可以識別在所有I類HLA抗原上的共同表位。[0113]有利地和根據本發明，特異於I類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白選自由下列組成的組：[0114]-包含至少一條序列SEQID_N01所示輕鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白，和[0115]-包含至少一條選自由下列組成的組的重鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQID_N02的重鏈、序列SEQID_N03的重鏈和序列SEQID_N04的重鏈。[0116]本發明也涉及特異於II類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列組成：[0117]-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和[0118]-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);[0119]其特徵在於，其選自由下列組成的組：[0120]-包含至少一條序列SEQID_N05所示輕鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白，和[0121]-包含至少一條選自由下列組成的組的重鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQID_N06的重鏈、序列SEQID_N07的重鏈和序列SEQID_N08的重鏈。[0122]有利地，形成特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體，以便可以識別在基本上所有II類HLA抗原上的共同表位。[0123]有利地，本發明的特異於I類或II類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白是指這樣的免疫球蛋白，其中[0124]〇重鏈和輕鏈在其恆定部分的性質是人的。特別地，重鏈恆定部分選自由IgA重鏈的恆定部分、IgG重鏈的恆定部分和IgM重鏈的恆定部分組成的組，並且輕鏈的恆定部分選自由K鏈和A鏈組成的組，和[0125]〇輕鏈和重鏈的可變部分選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組。在這種單克隆嵌合免疫球蛋白中，人抗體重鏈恆定部分（C0)與人抗體輕鏈恆定部分（CJ一起佔單克隆嵌合免疫球蛋白質量的60%這樣的級別。此外，這種單克隆嵌合免疫球蛋白為單克隆抗體，即特異於唯一一個單態性表位。[0126]有利地，每一個單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的脊椎動物生物-尤其是非人類脊椎動物生物-的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的脊椎動物生物-尤其是非人類脊椎動物生物-的單克隆抗體組成的組。[0127]在整個文本中，"非人類脊椎動物生物"，理解為除了人以外的高等有機活生物體。這種脊椎動物生物特別地具有免疫系統。這種脊椎動物生物特別地選自由非人類哺乳動物-尤其是小鼠、大鼠、兔和倉鼠-兩棲動物和鳥類-尤其是雞形目-組成的組。這種非人類脊椎動物生物特別地為實驗室動物。然而，這種單克隆抗體可以選自由人單克隆抗體組成的組。[0128]有利地和根據本發明，每一個特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和每一個特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體選自由下列組成的組：脊椎動物的單克隆抗體，特別地哺乳動物尤其是小鼠、大鼠、兔、倉鼠和人的單克隆抗體，和非哺乳脊椎動物尤其是兩棲動物、鳥類特別是雞形目的單克隆抗體。[0129]有利地和根據本發明，特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體W6/32。[0130]有利地和根據本發明，特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體F3.3。[0131]此外，本發明涉及至少一種以水性組合物的本發明單克隆嵌合免疫球蛋白的穩定溶液。[0132]本發明也涉及至少一種本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的這種水溶液，所述水溶液具有預先確定濃度的所述單克隆嵌合免疫球蛋白。[0133]本發明也涉及單克隆嵌合免疫球蛋白，其適合於可以允許測定包含抗體的液體介質的抗HLA抗體的量。[0134]另一方面，本發明擴大到體外定量液體介質的抗HLA抗體的試劑盒，所述試劑盒包含確定量的至少一種本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白和用於實施本發明方法的說明書。[0135]因此，本發明涉及體外定量液體介質的抗HLA抗體的試劑盒，所述試劑盒包含預先確定量的至少一種單克隆嵌合免疫球蛋白，其包含：[0136]-兩條多膚鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和[0137]-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);[0138]其特徵在於：[0139]-每一條重鏈包含：[0140]〇單克隆抗體的重鏈可變區（Vh)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0141]〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（Ch)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，[0142]和在於：[0143]-每一條輕鏈包含：[0144]〇單克隆抗體的輕鏈可變區（VJ，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和[0145]〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由K鏈和A鏈組成的組；[0146]所述試劑盒也包含用於施行本發明方法的說明書。[0147]本發明還涉及測定包含抗體的液體介質的抗HLA抗體的量的方法、單克隆嵌合免疫球蛋白、其用途和用於該測定的試劑盒，其特徵在於全部地或部分地組合上文或下文提及的特徵。[0148]本發明的其他目的、特徵和優點將在下文說明書而出現，其參考了僅作為非限制性實施例給出的代表本發明優選實施方案的附圖，其中：[0149]-圖1為按照陰性對照處理的17個類型珠的螢光強度的時間變化圖示；[0150]-圖2為作為時間函數的現有技術陽性對照的12個類型的攜帶I類HLA抗原的珠的螢光強度變化圖示；[0151]-圖3為作為時間函數的現有技術陽性對照的5個類型的II類HLA抗原珠的螢光強度變化圖示；[0152]-圖4為本發明陽性對照和現有技術陽性對照的螢光強度的比較直方圖：[0153]〇圖4A為在12個類型的用現有技術陽性對照（陰影線直方圖）和用本發明陽性對照（實心直方圖）處理的I類HLA珠上測得的螢光強度的直方圖表示；[0154]〇圖4B為在5個類型的用現有技術陽性對照（陰影線直方圖）和用本發明陽性對照（實心直方圖）處理的II類HLA珠上測得的螢光強度的直方圖表示；[0155]-圖5為本發明的I類和II類的嵌合單克隆免疫球蛋白在T淋巴細胞和B淋巴細胞上固定的流式細胞術分析；[0156]-圖6A為對應於12個類型的用本發明陽性對照處理的I類HLA珠的疊加的12條劑量/應答曲線的線圖表示。本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度以Ug/mL表示；[0157]-圖6B為對應於圖6A的12個類型的用本發明陽性對照處理的I類HLA珠的平均劑量/應答曲線的線圖表示。本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度以Ug/mL表示；[0158]-圖7A為對應於5個類型的用本發明陽性對照處理的II類HLA珠的疊加的5條劑量/應答曲線的線圖表示。本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度以Ug/mL表示；[0159]-圖7B為對應於圖7A的5個類型的用本發明陽性對照處理的II類HLA珠的平均劑量/應答曲線的線圖表示。本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度以Ug/mL表示；[0160]-圖8A為在鹽水緩衝液（白色方塊）中和在60g/L的人白蛋白溶液中（黑色菱形）保存的本發明的抗I類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白的劑量/應答曲線的比較線圖表示；[0161]-圖8B為在鹽水緩衝液（白色方塊）中和在60g/L的人白蛋白溶液中（黑色菱形）保存的本發明的抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白的劑量/應答曲線的比較線圖表示；[0162]-圖9為抗I類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgGlK[W6/32])輕鏈並且相應於序列SEQID_N01的肽序列；[0163]-圖10為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]重鏈並且相應於序列SEQID_NO2的膚序列；[0164]-圖11為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[W6/32]重鏈並且相應於序列SEQID_NO3的膚序列；[0165]-圖12為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgMK[W6/32]重鏈並且相應於序列SEQID_NO4的肽序列；[0166]-圖13為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]輕鏈並且相應於序列SEQID_NO5的肽序列；[0167]-圖14為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[F3.3]重鏈並且相應於序列SEQID_NO6的肽序列；[0168]-圖15為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]重鏈並且相應於序列SEQID_NO7的膚序列；[0169]-圖16為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgMK[F3.3]重鏈並且相應於序列SEQID_NO8的膚序列。[0170]實施例1-本發明的IgG/抗I類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgGlK[W6/32])的獲得[0171]抗體W6/32在Barnstable等人在1978的出版物（BarnstableCJ，BodmerWF,BrownG,GalfreG,MilsteinC,WilliamsAF,ZieglerA.,1978,Celle,14(I),9-20.ProductionofmonoclonalantibodiestogroupAerythrocytes,HLAandotherhumancellsurfaceantigens-newtoolsforgeneticanalysis)中首次描述。該抗體由來自小鼠骨髓瘤細胞系（不分泌小鼠免疫球蛋白的細胞系P3-NSI/lAg4-l)與針對人細胞免疫的小鼠淋巴細胞的細胞融合的小鼠雜交瘤分泌。已顯示該抗體與在I類HLA分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)上的公共表位反應。被識別的表位是構象表位，其取決於I類的a重鏈與￠2微球蛋白之間的結合。所述表位需要￠2微球蛋白3位的精氨酸和a鏈121位的賴氨酸的存在（LadaskyJJ，ShumBP,CanavezF，Sei^nezHN，ParhamP.，（1999)，Immunogenetics,49(4),312-320.Residue3ofbeta2_microglobulinaffectsbindingofclassIMHCmoleculesbytheW6/32antibody)〇[0172]第一步，克隆並測序編碼抗體W6/32的重鏈和輕鏈的轉錄物。[0173]藉助於兩個引物通過PCR擴增重鏈mRNA的DNA拷貝（cDNA)，兩個引物一個特異於編碼前導肽的區域，另一個靶向編碼恆定部分的CHl結構域的5'部分。[0174]為擴增輕鏈cDNA，使用靶向前導肽的外顯子的引物和靶向KC結構域的5'部分的引物。將兩條鏈的cDNA片段克隆在大腸桿菌（Ecoli.)中。對克隆的片段測序。序列比對使得能夠建立具有98%相同性閾值的重鏈與輕鏈cDNA的一致性（consensus)。編碼可變部分的區域通過與存在於IMGT?(國際免疫遺傳學信息系統）的資料庫中的序列的比較來決定。[0175]根據情況，已在5'處添加了編碼輕鏈或重鏈的前導肽的序列並且修飾了3'處的序列以便產生用於輕鏈DNA的BsiWI限制位點和用於重鏈的NheI限制位點。這些限制位點適合於允許這些核酸序列插入克隆載體pFUSE-CLIg和pFUSE-CHIg(InVivoGen，Toulouse,France)中。已合成了如此限定的序列，然後將其克隆入包含編碼人K鏈恆定結構域的部分（KmOl同種異型；Genbank登錄號J00241)或者編碼人IgGl的恆定部分的表達載體中。表達載體的限制位點使得能夠與編碼免疫球蛋白鏈的恆定部分的區域符合讀框地插入可變部分的cDNA。[0176]如此獲得了兩個表達載體，一個編碼組合了抗體W6/32的輕鏈可變部分與人CK結構域的嵌合輕鏈（[W6/32]VL鏈-人Ck)，另一個組合了抗體W6/32的重鏈可變部分和人CY1結構域（[W6/32]VL-人CY1)。[0177]將這兩個載體通過轉染引入CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）。為此，首先將細胞通過編碼輕鏈的載體然後通過編碼重鏈的載體進行轉染。表達載體包含細胞毒性藥物的抗性因子，從而允許有效地選擇雙轉染的細胞。在選擇期之後，將雙轉染的細胞通過有限稀釋進行克隆並通過夾心ELISA技術在克隆上清液中揭示人IgGlK的存在。使經如此揭示的生產克隆通過有限稀釋經歷多輪克隆，以便選擇下文命名為Hu-IgGlK[W6/32]最有效分泌嵌合IgGlK的克隆。[0178]分泌在轉染CHO細胞的培養上清液中的Hu-IgGlK[W6/32]通過在結合至S6pharose?:珠的葡萄球菌蛋白A上的捕獲-洗脫進行純化。IgGlK在酸性pH下在pH2的甘氨酸緩衝液中洗脫。洗脫液已通過濃度為750mM的磷酸氫二鈉水溶液即時緩衝。將Hu-IgGlK[W6/32]的溶液保存在4°C下或在_80°C下。[0179]單克隆嵌合免疫球蛋白（IgGl-抗I類HLA)Hu_IgGlK[W6/32]輕鏈的肽序列表示在圖9中並且相應於序列SEQID_N01。單克隆嵌合免疫球蛋白（IgGl-抗I類HLA)Hu-IgGlK[W6/32]重鏈的肽序列表示在圖10中並且相應於序列SEQID_N02。[0180]本發明的單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]的結合特異性的驗證在通過密度梯度從EDTA管中取樣的人血液分離的T淋巴細胞或B淋巴細胞上進行。將細胞用抗-⑶3、抗-⑶19和抗-⑶45抗體標記。在⑶45+淋巴細胞群中確定T(⑶3+)和B(⑶19+)淋巴細胞。[0181]在外周血人單核細胞（T淋巴細胞或B淋巴細胞）存在下保溫單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]，然後連續三次洗滌所述人單核細胞，接著在磷酸鹽緩衝液（PBS)中三次洗滌。通過羊抗人FeY抗體揭示固定在人單核細胞上的單克隆嵌合免疫球蛋白的固定。結果在圖5中顯示並且指示抗體Hu-IgGlK[W6/32]固定在B淋巴細胞（圖5A)上和T淋巴細胞（圖5C)，而抗體Hu-IgGlK[F3.3]固定在B淋巴細胞上（圖5B)但不在T細胞細胞上（圖OT)。[0182]實施例2-單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]的特異性[0183]接著通過使用由oneLambda?yAv司銷售的商業試劑盒，通過多重定量螢光測定技術測定了單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]的特異性。該測定建立在間接免疫螢光反應基礎之上並且使用了包被有各種不同組的HLA抗原的膠乳珠。能夠識別存在於膠乳珠上的HLA抗原的抗體通過與藻紅蛋白偶聯的抗人IgG抗體進行揭示。通過在;Luminex?儀器上的流式細胞術對每一個珠量化螢光。特異於每一個珠類型的螢光標記物使得能夠利用多種多樣的珠（可通過其螢光識別），每一個珠包被有給定的HLA抗原的混合物。這使得能夠證明所有I類珠以基本上相同的強度被識別（圖4A，I類珠）。這使我們能夠得出結論：單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]識別存在於所有I類HLA分子上的公共表位。[0184]競爭實驗能夠證明，由小鼠的雜交瘤分泌的小鼠單克隆抗體W6/32抑制單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[W6/32]的固定。[0185]實施例3-本發明IgA2和IgM同種型的抗I類HLA嵌合單克隆抗體（Hu-IgA2K[W6/32]和Hu-IgMK[W6/32])的獲得[0186]在另兩個表達載體中克隆的W6/32重鏈可變部分（VH[W6/32])，首先使得能夠產生嵌合U鏈（W6/32的可變部分和人ii重鏈的恆定部分（Genbank登錄號：AY510104.1)，另一方面產生嵌合a2鏈（W6/32的可變部分和人a2重鏈的恆定部分，同種異型A2m(l)(Genbank登錄號J00221)。使用這兩個載體轉染預先用允許嵌合輕鏈VL[W6/32]_人K表達的載體轉染的CHO細胞系的細胞。我們如此分離了分泌大量單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[W6/32]的CHO細胞的克隆和分泌單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgMK[W6/32]的另一克隆。按照供應商建議，嵌合IgA在與M肽（InvivoGen，Toulouse,France)偶聯的瓊脂糖支持物上純化，嵌合IgM在與蛋白L(InvivoGen，Toulouse,France)偶聯的瓊脂糖支持物上純化。[0187]單克隆嵌合免疫球蛋白（IgA2-抗I類HLA)Hu-IgA2K[W6/32]重鏈的肽序列表示在圖11中並且相應於序列SEQID_N03。[0188]單克隆嵌合免疫球蛋白（IgM-抗I類HLA)重鏈的肽序列表示在圖12中並且相應於序列SEQID_N04。[0189]單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[W6/32]和Hu-IgMK[W6/32]的反應性已通過Luminex?;技術用Labscreenmixed?試劑盒（OneLambda?')以及作為突光二抗的與藻紅蛋白偶聯的羊抗人IgA抗體或羊人抗IgM抗體進行了驗證。[0190]實施例4-本發明抗II類HLA單克隆抗體（Hu-IgGlK[F3.3])的獲得[0191]按照其原理，獲得抗II類HLA單克隆抗體的方法與獲得抗I類HLA單克隆抗體(W6/32)的方法是可比較的。[0192]抗體F3.3(Elsasser，D.，Valerius，T.，Repp，R.，Weiner，G.J.,Deo,Y.，Kalden，J.R.,vandeWinkel，J.G.,Stevenson，G.T.,Glennie，M.J?和Gramatzki，M.,(1996)，Blood,87(9),3803-3812.HLAclassIIaspotentialtargetantigenonmalignantBcellsfortherapywithbispecificantibodiesincombinationwithgranulocytecolony-stimulatingfactor)由小鼠雜交瘤的唯一克隆產生。抗體F3.3識別至少一個存在於所有表達II類HLA分子的人細胞表面上的公共表位。特別地，抗體F3.3識別所有DR抗原，所有DP抗原和所有DQ2抗原。編碼抗體F3.3可變部分的完整序列在GenBank?J：可獲得（登錄號：對於輕鏈，AY058910[VL]，和對於重鏈，AY058911[VH])。[0193]合成可變部分的序列，同時對於重鏈，克隆入克隆載體pFUSE_CHIg(InvivoGen,Toulouse,France)中，對於輕鏈，克隆入pFUSE_CLIg(InvivoGen，Toulouse,France)中。載體（pFUSE-CHIg)允許產生嵌合重鏈VH[F3.3]-人CyI，載體（pFUSE-CLIg)允許產生輕鏈VL[F3.3]-人Ck。使用這兩個表達載體轉染實施例1中所述的CHO細胞系的細胞。[0194]此外，已將可變部分VH[F3.3]克隆在允許產生嵌合重鏈VH[F3.3]-人Cii和VH[F3.3]-人Ca2的表達載體中。[0195]抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgGlK[F3.3])輕鏈的肽序列表示在圖13中並且相應於序列SEQID_N05。[0196]抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgA2K[F3.3])重鏈的肽序列表示在圖14中並且相應於序列SEQID_N06。[0197]抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgGlK[F3.3])重鏈的肽序列表示在圖15中並且相應於序列SEQID_N07。[0198]抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白（Hu-IgMK[F3.3])重鏈的肽序列表示在圖16中並且相應於序列SEQID_N08。[0199]針對II類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]、Hu-IgA2K[F3.3]和Hu-IgMK[F3.3]由被合適載體轉染的CHO細胞產生。嵌合IgGl在蛋白AS6pharose上純化。嵌合IgA在肽M-瓊脂糖（InvivoGen，Toulouse,France)上純化。嵌合IgM在蛋白L-瓊脂糖（InvivoGen，Toulouse，France)上純化。[0200]通過在例如實施例1所述的人單核細胞上的流式細胞術通過間接免疫螢光技術驗證了本發明單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]的結合特異性。結果在圖5中展示並且表明本發明的抗體Hu-IgGlK[F3.3]對人細胞強烈地反應，尤其是B淋巴細胞（圖5B)和T淋巴細胞（圖ro)。[0201]此外，通過在Luminex?上的多重定量免疫螢光測定技術藉助於Labscreenmixed?和Labscreensingleantigen?.試劑盒（OneLambda?:)研究了本發明的抗II類HLA單克隆嵌合免疫球蛋白的特異性。[0202]將抗體Hu-IgGlK[F3.3]固定在試劑盒Labscreenmixed?的攜帶II類HLA抗原的所有珠上和試劑盒LabscreensingleantigenclassII?的攜帶HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ2抗原的所有珠上。[0203]通過競爭實驗已證明，單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]和Hu_IgA2K[F3.3]識別相同的表位。單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[F3.3]的反應性通過Luminex?技術用Labscreenmixef^l(One-Lambda?丨）試劑盒進行了研究，使用了與藻紅蛋白偶聯的羊抗人IgA抗體作為單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[F3.3]固定的揭示齊U。揭示了單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[F3.3]的反應性與單克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGlK[F3.3]的反應性是相同的。[0204]實施例5-抗HLA抗體的體外定量方法[0205]在通過本發明的免疫螢光法體外定量包含抗體的液體介質的抗HLA抗體的方法中，作為非限制性例子，使用了Labscreenmixed?實驗室試劑盒（LSM12,OneLambda?Inc.，USA)，其包含：[0206]-與純化的和以混合物的I類HLA抗原（HLA-A、HLA_B和HLA-C)共價連接的聚苯乙烯珠；[0207]-與純化的II類HLA抗原（HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)共價連接的聚苯乙烯珠；[0208]-與IgG連接的聚苯乙烯珠，所謂的陽性對照珠；[0209]_沒有表面抗原的聚苯乙烯珠，所述的陰性對照珠。這個實驗室試劑盒(Labscreenmixed?丨）包含檢出抗I類HLA抗體和抗II類HLA抗體的聚苯乙烯珠水性懸浮液。該懸浮液的聚苯乙烯珠包含多種類型的聚苯乙烯珠，每一個類型的聚苯乙烯珠通過螢光標記物與其他類型的聚苯乙烯珠相區別並且包含攜帶不同的I類HLA抗原和II類HLA抗原的聚苯乙烯珠。實際上，每一個類型的聚苯乙烯珠在聚苯乙烯珠的表面上具有達六個HLA-A抗原（I類），六個HLA-B抗原（I類），六個HLA-C抗原（I類）或六個HLA-DQ抗原(II類），六個HLA-DR抗原（II類），六個HLA-DP抗原（II類）。[0210]實驗室試劑盒（Labscreenmixed?丨）包含12個類型的I類聚苯乙烯珠和5個類型的II類珠，其中17個類型的聚苯乙烯珠的每一個的螢光強度能夠同時被測量。因此，計算與同一組HLA抗原連接的每一個類型的聚苯乙烯珠的螢光強度的平均值。在該聚苯乙烯珠混合物之中，某些沒有I類HLA抗原和II類HLA抗原並且作為陰性對照。[0211]此外，在抗HLA抗體的檢出反應中，實驗室試劑盒（Labscreenmixed?)的使用需要陰性對照血清（LabScreenN6gativeControl(LSNC)血清）。該血清特徵為：好像沒有抗I類HLA抗體和抗II類HLA抗體地來製備它。[0212]將在與用陰性對照處理的12個類型的攜帶I類抗原的珠的每一個和與5個類型的攜帶II類抗原的珠的每一個相關的在五個月時間內所觀察到的螢光強度的平均值在下表1中給出。[0213]表1【權利要求】1.測定包含抗體的液體介質的抗HLA抗體的量的方法，其中：-製備單克隆嵌合免疫球蛋白的多種溶液（Sn)，每一種溶液（Sn)具有所述單克隆嵌合抗體的確定濃度值（Cn);然後-使每一種溶液（sn)與相同確定量的至少一種固定化的HLA抗原相接觸；和_建立校準曲線，其中使每一個確定濃度值（Cn)與參數的一個測量值（Vn)相關聯，所述測量值（Vn)表示與每一種固定化的HLA抗原的確定量有關的單克隆嵌合免疫球蛋白的量（Qn);-從確定濃度值（Cn)和測量值（Vn)對（Cn，Vn)形成作為單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液（Sn)的單克隆嵌合免疫球蛋白的確定濃度（Cn)函數的測量值（Vn)的校準和變化曲線；和-計算參數的值，所謂的閾值，在該閾值以外單克隆嵌合免疫球蛋白的濃度顯著高於〇；其中單克隆嵌合免疫球蛋白由下述構成：-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);其特徵在於：-每一條重鏈（H)包含：〇單克隆抗體的重鏈可變區（VH)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，和在於：-每一條輕鏈（L)包含：〇單克隆抗體的輕鏈可變區（')，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由k鏈和A鏈組成的組。2.根據權利要求1的方法，其特徵在於，在由脊椎動物的單克隆抗體組成的組中選擇每一個特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和每一個特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體。3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於，所述參數選自由螢光參數、發光參數和比色法參數組成的組。4.權利要求3的方法，其特徵在於，所述螢光參數為螢光強度。5.根據權利要求1至4之一的方法，其特徵在於：a)每一個固定化的HLA抗原為固定化在由顆粒形成的分割狀態的固體支持物顆粒表面上的HLA抗原；b)在適合於在固體支持物的HLA抗原與單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液的單克隆嵌合免疫球蛋白之間形成穩定結合的條件下，使固定化的HLA抗原與針對固體支持物的HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白的每一種溶液相接觸，然後C)通過洗滌除去未與固體支持物的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白，然後d)在適合於在單克隆嵌合免疫球蛋白和二抗之間形成穩定結合的條件下，使與固體支持物的HLA抗原結合的單克隆嵌合免疫球蛋白與二抗溶液相接觸，所述二抗選自由下列組成的組：螢光二抗、發光二抗以及光吸收並針對所述單克隆嵌合免疫球蛋白的二抗，然後e)通過洗滌除去未與單克隆嵌合免疫球蛋白結合的二抗，然後f)測量與固體支持物的每一個顆粒結合的二抗的至少一個參數並給予該測量一個所述參數的測量值（Vn)，所述參數選自由下列組成的組：螢光參數、發光參數和比色參數，然後g)形成校準曲線，然後h)從該校準曲線推斷指示待分析溶液中抗HLA抗體的存在的螢光強度閾值。6.根據權利要求1至5之一的方法，其特徵在於，所述每一種固定化的HLA抗原為存在於至少一個細胞的表面上的HLA抗原。7.根據權利要求1至6之一的方法，其特徵在於，所述特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體W6/32。8.根據權利要求1至7之一的方法，其特徵在於，所述特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體F3.3。9.單克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗體的檢出或定量方法中作為標準化試劑以及陽性和靈敏性對照的用途，所述檢出或定量方法選自由多重定量免疫螢光測定法、流式細胞術方法、固體支持物上免疫酶測定方法和通過補體依賴微量淋巴細胞毒性方法組成的組，其特徵在於：所述單克隆嵌合免疫球蛋白由下列構成：-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);其特徵在於：-每一條重鏈（H)包含：〇單克隆抗體的重鏈可變區（VH)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，和在於：-每一條輕鏈（L)包含：〇單克隆抗體的輕鏈可變區（')，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的特異單克隆抗體和特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由k鏈和A鏈組成的組。10.特異於I類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列構成：-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);其特徵在於：-每一條重鏈（H)包含：0單克隆抗體的重鏈可變區（VH)，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的重鏈恆定區（CH)，所述人免疫球蛋白選自由IgA、IgG和IgM組成的組，和在於：-每一條輕鏈（L)包含：〇單克隆抗體的輕鏈可變區（')，所述單克隆抗體選自由特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體組成的組，和〇人免疫球蛋白的輕鏈恆定區（CJ，所述人免疫球蛋白輕鏈選自由k鏈和A鏈組成的組。11.根據權利要求10的特異於I類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其特徵在於，其選自由下列組成的組：-包含至少一個序列SEQID_NO1的輕鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白，和-包含至少一個選自由下列組成的組的重鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQID_NO2的重鏈、序列SEQID_NO3的重鏈和序列SEQID_NO4的重鏈。12.特異於II類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列構成：-兩條多肽鏈，分子量在40kDa和60kDa之間的所謂重鏈（H)，和-兩條多肽鏈，分子量在20kDa和30kDa之間的所謂輕鏈（L);其特徵在於，其選自由下列組成的組：-包含至少一個序列SEQID_N05的輕鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白，和-包含至少一個選自由下列組成的組的重鏈的單克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQID_NO6的重鏈、序列SEQID_N07的重鏈和序列SEQID_N08的重鏈。13.根據權利要求10或11之一的特異於I類HLA抗原的單克隆嵌合免疫球蛋白，其特徵在於，每一個特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體選自由脊椎動物的單克隆抗體組成的組。14.根據權利要求10、11或13之一的單克隆嵌合免疫球蛋白，其特徵在於，所述特異於I類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體W6/32。15.根據權利要求12的單克隆嵌合免疫球蛋白，其特徵在於，所述特異於II類HLA抗原的單態性表位的單克隆抗體為抗體F3.3。16.定量液定介質的抗HLA抗體的試劑盒，所述試劑盒包含確定量的至少一種根據權利要求10至15之一的單克隆嵌合免疫球蛋白和用於施行根據權利要求1至8之一的方法的說明書。【文檔編號】C07K16/28GK104379600SQ201380009823【公開日】2015年2月25日申請日期:2013年2月15日優先權日:2012年2月16日【發明者】A·布朗謝,N·孔日,J-G·提哈比,D·德羅古申請人:保爾·薩巴梯埃-土魯斯第三大學,土魯斯大學醫療中心,安維沃根公司