利用液相晶片檢測流感病毒的方法

2023-05-06 19:16:06 1

專利名稱：：利用液相晶片檢測流感病毒的方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測病毒的方法，特別涉及一種利用液相晶片檢測流感病毒的方法。(二)
背景技術：
：流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。自2005年，家禽及人感染流感病毒的病例在世界各地不斷發生，禽流感繼SARS之後給全世界人民造成了巨大的恐慌。控制流感流行的一個關鍵問題就是及時、準確的鑑別診斷，這就需要非常準確並且靈敏的診斷方法。流感病毒屬於正粘病毒(Orthomyxovirus),按核蛋白的可溶性補體結合抗原的不同，流感病毒可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒又根據表面血凝素(HemagglutininHA)及神經氨酸酶(NeuraminidaseNA)抗原性的不同再分為若干亞型，目前已知的HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(Nl-N9)。由於HA、NA的抗原決定簇容易發生某些改變，導致流感病毒的不斷流行，所以鑑別流感病毒的具體亞型是十分重要的。目前有三種流感病毒診斷方法ELISA(酶聯免疫吸附法)、細胞培養法和分子法。每種方法都有它們各自的優勢和缺點(l)ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbantAssay)是抗體檢測，這禾中方法所檢測的流感病人的血清中的抗體是出現臨床症狀10天才有的。ELISA法是特異的，但檢測太遲了。它不能夠提供更多早期的信息以預防疾病的傳播。(2)細胞培養能檢測到活病毒。禽流感標本中的病毒能夠通過被感染細胞的擴增而增殖，並且能被檢測。細胞培養是一個要求嚴格且危險的測試方法，但它只能表明活病毒的存在。而且此類方法花費時間比較長，無法快速的對流感病毒進行檢測和分型。(3)分子法是採用聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR(如逆轉錄PCR、多重逆轉錄PCR、酶免PCR、realtimePCR等)能夠檢測各種標本(血液、排洩物、呼吸分泌物或身體組織)中的流感病毒的遺傳物質。現有的PCR檢測特異性很好，但是缺少敏感性，這是因為在病人的標本中可能沒有病毒，或者由於擴增或檢測失敗而不能鑑別遺傳物質。而一個陰性的檢測不能排除一個病人出現流感病毒的可能。而且它們不能對流感病毒進行快速準確的分型。從疾病預防和治療的觀點來看更為合理的鑑別診斷是非常重要的，我們需要知道誰是真正需要隔離和治療的流感病人。因此開發一種快速的、可靠的、可對流感病毒進行識別和亞型分析，從而可對流感病毒的流行進行識別和監控的檢測方法就非常重要了。液相晶片(Multi-AnalyteSuspensionArray，MASA)是新一代的生物晶片診斷技術平臺。該技術平臺的核心技術是xMAP技術，其原理是把微小的乳膠顆粒(微球)分別染成不同的螢光色，然後再把針對不同檢測物的核酸探針分別以共價方式吸附到不同螢光色的微球上。應用時，先把針對不同檢測物的不同螢光色的微球混合，再加入被檢測物。在懸液中偶聯有特異性探針的微球與病人標本特異性地結合(雜交僅需十幾分鐘)，並加上螢光標記。然後，微球被微量液體傳送系統排成單列通過兩束雷射，一束判定顆粒的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測定微粒上的螢光標記強度從而給被測物定量，所得到的數據經電腦處理後可以直接用來判斷結果。該技術具有高通量、高速度、敏感性高等特點，已在基因分型、組織分型、感染性疾病監測等方面廣泛應用。
發明內容本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種能夠對流感病毒的流行進行識別和監控的利用液相晶片檢測流感病毒的方法，該方法利用液相晶片技術建立一個可識別流感病毒A型及流感病毒B型，並對流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7，H9和N1、N2亞型進行鑑別檢測。本發明是通過如下技術方案實現的—種利用液相晶片檢測流感病毒的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)利用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對Genbank中能夠檢索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的NonStructural核酸序列及流感病毒A型的Hl、H2、H3、H5、H7、H9的Hemagglutinin耙基因序列和N1、N2亞型的Neuraminidase耙基因序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對相應基因片段的引物和特異性探針；(2)採用一種改良的巢式PCR方法即使用不同長度的嵌套式引物進行PCR擴增將巢式PCR的內外引物加以改變，縮短外引物長度(1520bp)，同時通過在特異性內引物5，端加一段通用引物(15-20bp)的方法延長內引物長度(3550bp);PCR擴增時先使外引物在低溫退火溫度下做10-15個循環擴增，再在高溫退火溫度下使內引物在外引物擴增的基礎上作6-8個循環擴增，然後使用其中一個5'端用biotin標記的通用引物對上述得到的擴增序列進行30-35個循環擴增；(3)特異性探針5'端進行氨基化處理，與螢光編碼的微球進行偶聯；將PCR擴增產物與偶聯有特異性探針的混合微球溫育雜交，最後用LuminexIOO進行檢測。本發明對Genbank中能夠檢索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的Nonstructural核酸序列及流感病毒A型的HI、H2、H3、H5、H7、H9和Nl、N2亞型進行檢測，這樣的PCR擴增減少了引物非特異性退火，使靶序列得到高效擴增，而次級結構卻很少擴增，提高了擴增效率，特異性強，同時也具有較高的靈敏度。tableseeoriginaldocumentpage4tableseeoriginaldocumentpage5本發明的檢測方法具有較高的特異性及靈敏度，並且檢測速度快，能夠對流感病毒的流行進行識別和監控。具體實施例方式—、引物及探針的合成利用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對Genbank中能夠檢索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的NonStructural核酸序列及流感病毒A型的Hl、H2、H3、H5、H7、H9和Nl、N2亞型核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對相應基因片段的引物和特異性探針。引物使用改良的嵌套式引物，即採用較短的外引物(15-20bp)和5'端加有一段通用引物(15-20bp)的較長的內引物(35-50bp)，通用引物的一個5'端用biotin標記。特異性探針5'端進行氨基化處理，與螢光編碼的微球進行偶聯。最終合成的引物及探針序列如下外引物HI:5，--AGGGCATTTCGCTGACTATGA5，_ATTTATGCTTGGCGGGTGATH2:5，--TGATAGGCTTCTAAGGGTG5，_CTCCGCTCGTATTGTTGTH3:5，--GAATGTRACAATGCCTAAYAA5，_CCAGGTTTYACAATGGTCCH5:5，--GGACAATTTTRAARCCRAATG5，-TTATCGCMCCCAYTGGAGH7:5，--CTGAAACGGTGGAACGAA5，-AGTCATCTGCGGGAAAGCH9:5，--AGRARTATGAGATGGCTGAC5，_CCTGGYTTTARTACYGACCNl:5，--GGRAACAYAATATCARTATGG5，-ACATCCCCTTTGGAACCAN2:5，--GAATTCCTCATCGAACCCTA5'-AGTCCCATTGATACAAACGCInfA:5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAA5'-GGCATTTTGGACAAAKCGTInfB:5'-ACAAATTGAGGTGGGTCC5'-CAGGGTAGTCAAGGGCT內引物HI:5'-acgtgttactegcatagtgcGACTATGAGGAACTGAGGGAGCAAT5'_tcctgtactetcttactgtcGTGATGAACACCCCATAGTACAAGGH2:5'_acgtgttactegcatagtgcTAAGGGTGCCAGAATGGTCCTATAT5'-tectgtactetcttactgtcTTGTTGTACGATCCTTTGGCAACCGH3:5'-acgtgttactegcatagtgcCTAAYAATCNCTARTTGCCTC5'-tectgtactetcttactgtcATGGTCCCATTGGRATGCTYCCH5:5'-acgtgttactegcatagtgcCCRAATGTGGACAAAGTGGAAGAAT5'-tectgtactetcttactgtcYTGGAGGCATACTRGAATTTATAGH7:5'-acgtgttactegcatagtgcGAACGAACAAACGTCTGTGTTTGAC5'-tectgtactetcttactgtcGAAAGCAGCATTGTCTGTGTTTGACH9:5'-acgtgttactegcatagtgcTGGCTGACGGGGHATACAYCAYCC5'-tectgtactetcttactgtcACYGACCTACCAHGGRGCAATTAGNl:5'-acgtgttactegcatagtgcRTATGGCAATTCATCTCTTTGYCC5'-tectgtactetcttactgtcGAACCACACCCACAGGACAACTCN2:5'-acgtgttactegcatagtgcCGAACCCTATTAATGAATGAGTTGG5'-tectgtactetcttactgtcTTGATACAAACGCATTCCGACTCCTInfA:5'-acgtgttactegcatagtgcGTCGAAAGAYACRATCTGGAATGT5'-tectgtactetcttactgtcACAAAKCGTCACTTGTTGTKGTGTCInfB:5'-acgtgttactegcatagtgcGGGTCCACAATGGRATGYTRTG5'-tectgtactetcttactgtcAAGGGCTCTCATRCTYCTGTAG通用引物5，_acgtgttactegcatagtgc5，_biotin_tcctgtactetcttactgtc特異性探針序列HI:5'-NH2-aaaaaCATTCTTTCCCGTCAGCCH2:5'-NH2-GAAATGTTTTACGCTGCTGAGGAGATH3:5'-NH2-CGAGTAACAGTYTCAACARAAAGAAGH5:5'-NH2-TATGCATACAAAATTGTCAAGAARGGH7:5'-NH2-TCAATTCCGCCTGACTCCCTGAGAAH9:5'-NH2-ACCCTRTtCAAGACGCYCAATAYACNl:5'-NH2-AGCATCAATTTTTACACTGAGCAGGN2:5'-NH2-GTCCTGAGGATATTTTGAGACCATGAACInfA:5'—NH2—aaaaaTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAInfB:5'—NH2—aaaCTGGAGTGCTATGAAAGGCTTTC二、PCR擴增本試劑盒採用一步法RT-PCR，反應體系為50iil，其中5XRT-PCRBuffer10iU、d證Mix2ul、RT-PCREnzymeMix(包括reversetranscriptases.禾口HotStarTaqDNAPolymerase)2iil、上文所述所有內外引物xiil(至終濃度0.15iiM)、通用引物x(至終濃度0.8iiM)、RNaseinhibitor5U(可選擇不力口)、RNA模板1—2iig，用RNase—free水補足體積至50iU。反應程序如下:(1)反轉錄50。C30min;(2)起始PCR活化95。C15min;(3)PCR擴增94°C30sec，52°Clmin，72°Clmin，進行10-15個循環；94°C30sec，65。Clmin，72。C1.5min，進行6-8個循環；94。C30sec，50。Clmin，72。Clmin，進行30-40個循環，最後72t:延伸5min。反應產物置於4。C待雜交檢測。三、探針的偶聯取50ii1(1X106個)微球，12000rpm離心1.5min後棄去上清，加入8iiIMES(O.1M，pH4.5)，混勻。再加入2yl探針(用MES稀釋到200yM)、1.25iilEDC(10mg/ml)，混勻後避光放置30min，重複加入EDC—次。然後用500y1Tween20(0.02%V/V)和SDS(O.1%W/V)各洗滌一次，最後用200y1TE(pH8.0)重懸微球，混勻後用血細胞計數器計數，4°C避光保存。四、溫育雜交混合偶聯好不同流感病毒亞型探針的微球，使用1.5XTMAC稀釋至每種微球的濃度是150個/iU。在雜交體系中加入混合微球33iil、RT-PCR產物2iil、TE(pH8.0)15iU。96。C變性5min後，59。C雜交15min，再加入70ylSA-PE，52。C雜交10min，最後上機檢測。五、實驗結果1、cutoff值的確定分離流感病毒亞型的核酸，然後按照上文所述比例在單獨的反應管中分別加入核酸模板、引物完全混合物、RT-PCR反應試劑進行反應。RT-PCR產物與交聯有特異性探針的微球混合物溫育雜交，然後上機檢測。在這個多重檢測中，每組微球實際上就是一個微小的系統。檢測的最終信號強度，以及背景值被許多因素所影響，例如寡核苷酸探針偶聯到微球上的的效率；多重反應中靶序列擴增的效率；以及檢測過程中雜交的效率等等，所以每種流感病毒亞型的cutoff值必須分別被確定。這裡，我們把cutoff值定義為所有不包含靶病原體的樣品檢測結果的平均值加上標準偏差的5倍，認為高於cutoff值的為陽性結果，指示特定流感病毒亞型的存在。樣品1-4是陰性對照，其中RT-PCR空白反應中不包含核酸模板，Control反應中加入的是不含任何亞型流感病毒的RT-PCR產物(下同)。表一7tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage92、特異性實驗結果為了驗證本試劑盒檢測方法的特異性，我們在一個反應管中加入多個亞型流感病毒的核酸用於多重擴增和隨後的檢測(將表一中確定的Cutoff值用在該檢測中)。由下表可見，用本試劑盒提供的方法，在多重引物及多個靶序列存在的情況下靶序列可以被特異性地擴增，並且最終檢測的信噪比比較高，可以獲得較高的檢測特異性。表二tableseeoriginaldocumentpage93、靈敏度、重複性實驗結果為了檢驗本試劑盒檢測方法的靈敏度，對於每種亞型的流感病毒RNA而言，製備五個梯度10ng、lng、100pg、10pg、lpg。為了觀察測定的可重複性，每一個梯度做三個重複。對於每種靶標，按照表一確定的cutoff值。表三結果顯示，隨著模板RNA量的降低，檢測的螢光強度值也隨之降低，檢測的低限為lOpg，具有較高的靈敏度，並且本實驗的重複性也較好。tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14權利要求一種利用液相晶片檢測流感病毒的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)利用生物信息學知識和相關的生物信息學軟體，對Genbank中能夠檢索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的NonStructural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9的Hemagglutinin靶基因序列和N1、N2亞型的Neuraminidase靶基因序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對相應基因片段的引物和特異性探針；(2)採用一種改良的巢式PCR方法即使用不同長度的嵌套式引物進行PCR擴增將巢式PCR的內外引物加以改變，縮短外引物長度(15～20bp)，同時通過在特異性內引物5』端加一段通用引物(15-20bp)的方法延長內引物長度(35～50bp)；PCR擴增時先使外引物在低溫退火溫度下做10-15個循環擴增，再在高溫退火溫度下使內引物在外引物擴增的基礎上作6-8個循環擴增，然後使用其中一個5』端用biotin標記的通用引物對上述得到的擴增序列進行30-35個循環擴增；(3)特異性探針5』端進行氨基化處理，與螢光編碼的微球進行偶聯；將PCR擴增產物與偶聯有特異性探針的混合微球溫育雜交，最後用Luminex100進行檢測。全文摘要本發明公開了一種利用液相晶片檢測流感病毒的方法。該檢測方法對所有流感病毒A型、流感病毒B型的NonStructural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亞型進行同源性分析，設計出針對相應基因片段的引物和特異性探針；採用一種改良的巢式PCR方法即使用不同長度的嵌套式引物進行PCR擴增；特異性探針5』端進行氨基化處理，與螢光編碼的微球進行偶聯；將PCR擴增產物與偶聯有特異性探針的混合微球溫育雜交，最後用Luminex100進行檢測。本發明的檢測方法具有較高的特異性及靈敏度，並且檢測速度快，能夠對流感病毒的流行進行識別和監控。文檔編號G01N21/64GK101717830SQ20091001993公開日2010年6月2日申請日期2009年3月20日優先權日2009年3月20日發明者張凱寧,張國寧,李豔豔,汪朝暉,王華林申請人:山東艾克韋生物技術有限公司