一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒的製作方法
2023-05-06 03:37:31 1
專利名稱：一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種固相酶聯免疫檢測試劑盒，具體涉及一種檢測非人靈長類實驗動物多項病毒的梳式斑點固相酶聯多項病毒檢測試劑盒。
背景技術：
靈長類實驗動物是研究病毒感染性疾病、神經系統疾病及腫瘤等疾病和新藥研發所必需的重要動物模型。隨著研究的深入，對靈長類實驗動物的需求量及其品質的要求也不斷提高。我國科技部已經制定實驗猴健康標準，明確要求普通級動物必須是B病毒陰性，SPF級動物必須是B病毒、包括STLV、SIV、SRV在內的逆轉錄病毒等陰性，但因為缺乏可靠 的檢測方法，靈長類實驗動物健康檢測遠遠跟不上行業發展的需要，因此，提供一種靈敏度高、特異性強、檢測速度快、效率高的猴病毒檢測方法已成為必然的需求。現有的檢測方法主要是玻片法和ELISA方法，該兩種方法一次只能檢測出一種病毒，操作繁瑣，檢測的速度慢、效率低。
發明內容為解決現有技術的不足，本實用新型的目的在於提供一種靈敏度高、特異性強、檢測速度快、效率高的梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒。為達到上述目的，本實用新型是通過以下的技術方案來實現的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部設置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。其中,所述的梳齒為12條,且所述的深孔板為lml96孔,深孔板每排具有12個孔，與12條梳齒一一對應，而所述的梳齒的長度與深孔板的深度相配合。此外，所述的抗原梳的材質為PVC板。所述的塑料平皿的尺寸為12cm*12cm。而所述的硝酸纖維膜上預點的抗原為實驗猴易感的B病毒(BV)、猴T細胞趨向性病毒I型(STLV-I)和猴逆轉錄D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、伊波拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒中的至少一種。此外，還包括一臺用於將染色後的抗原梳成像的成像儀。而通過成像儀將染色後的抗原梳拍成照片，再經過軟體的處理和分析，可以對結果做定量分析。上述抗原梳使用硝酸纖維膜作為病毒抗原的載體，將所需檢測的病毒抗原按順序點布在硝酸纖維膜上，將該硝酸纖維膜貼於PVC板材製成的梳齒上。將梳齒置於加了待檢樣本的稀釋液中，樣本中相關的病毒抗體和硝酸纖維膜上相應的抗原發生特異性結合，然後加入酶標二抗，形成抗原-抗體-酶複合物，最後加入顯色劑顯色一定時間後終止反應，通過所述一系列的反應使得相應的抗原點呈現肉眼可見的斑點，達到定性檢測病毒的目的。[0012]本實用新型的有益效果是本實 用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內，一次性同時檢測出多種病毒抗體，實現了多種病毒同步檢測，減少了每個標本的採樣量。一把抗原梳可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時操作多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。使用硝酸纖維膜作為固相載體，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反應的效率和敏感性，而且可批量加工，且易於保存，穩定性及重複性好，結果可靠，檢測過程不需要特殊儀器設備，結果可以肉眼觀察，並能長期保存，適合養殖場或基層單位使用。
圖I為本實用新型所述的抗原梳的結構示意圖；圖2為本實用新型所述的與圖I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯視圖。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施例對本實用新型作具體的介紹。圖I為本實用新型所述的抗原梳的結構示意圖；圖2為本實用新型所述與圖I所示的抗原梳相匹配的深孔板的俯視圖。如圖I和圖2所示梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，包括抗原梳I、與抗原梳I相匹配的Iml96孔深孔板2和12cm*12cm的塑料平皿(圖中未示出)，所述抗原梳I的材質為PVC板，其上貼附有按順序預點了若干抗原的硝酸纖維膜3。所述抗原梳I有12個梳齒，以及所述的Iml深孔板每排有與所述的梳齒對應個數的12個孔，共八排，梳齒的長度與深孔板的深度相配合，保證深孔板裡面的液體能將抗原梳I的梳齒浸沒。而本實用新型還可以額外配備一臺成像儀，通過成像儀將染色後的抗原梳拍成照片，再經過軟體的處理和分析，可以對結果做定量分析。此外，所述的硝酸纖維膜上所預點的抗原為猴血清中B病毒(BV)、猴T細胞趨向性病毒I型(STLV-I)和猴逆轉錄D型病毒(SRV1，2，5)、麻疹病毒、伊波拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒中的至少一種病毒。而將梳齒置於加了待檢樣本的稀釋液中，即插入到深孔板2的孔中，樣本中相關的病毒抗體和硝酸纖維膜3上相應的抗原發生特異性結合，然後加入酶標二抗，形成抗原-抗體-酶複合物，最後加入顯色劑顯色一定時間後終止反應，通過所述一系列的反應使得相應的抗原點呈現肉眼可見的斑點，達到定性檢測病毒的目的。梳式斑點多項病毒檢測試劑盒對病毒抗原的定性檢測。I.梳式斑點多項病毒檢測試劑盒內的材料及試劑(I) 12*12cm 塑料平皿；(2)96 孔 Iml 深孔板；(3)將所需檢測的病毒抗原按矩陣點於硝酸纖維膜上，具體為如圖I所示圖中每個梳齒上點有九個點，第一和第九個標記點(顏色實際為紫色)為用於定位的甲基紫點33，位於兩者之間的點為病毒的抗原點32及其對照細胞31 ；(4)然後將上述硝酸纖維膜貼於0. 2mm厚原帶膠的PVC板上,再切為長4cm、寬6mm的梳齒，將沒有抗原的一端夾在兩塊厚0. 4mm原帶膠的長12cm、寬Icm的PVC板之間，就製成了抗原梳1，4°C乾燥保存。(5)鹼性磷酸酶標記的羊抗猴IgG 二抗購自KPL ；(6)快紅購自 Sigma ;(7)萘酹購自 Sigma ;(8)配Ix磷酸鹽緩衝液(PBS，0. 01 M, pH 7. 2 7. 4)，室溫保存；(9)在1000 ml PBS中加入I ml 100%吐溫，充分混勻，得0. 1%PBST洗滌液，室溫保存；(10)取適量BSA粉末，加入Ix PBS配成含1%BSA的樣本稀釋液，4°C保存； (11)配 Tris 緩衝液(0. 2 M, pH 8. 0)，室溫保存；(12)配0. 1% EDTA反應終止液，室溫保存；2.操作步驟(I)將抗原梳I從冰箱拿出，平衡20-30分鐘至室溫。(2)將待檢血清樣本按照I :100的比例用1%BSA稀釋於Iml深孔板中。(3)將稀釋好的血清震蕩混勻，再將抗原梳I插入Iml深孔板2的樣本稀釋液中，室溫反應30分鐘。(4)孵育結束後，取出抗原梳1，置於加入洗滌液的12*12cm塑料平皿中，置於搖床上中速搖動，每個塑料平皿可放置1-3把梳子，洗滌5遍，每遍I分鐘。(5)將鹼性磷酸酶標記的二抗(羊抗猴IgG)按所需濃度稀釋混勻後加入平皿中，置室溫(20-25 °C)孵育30分鐘。(7)倒出二抗溶液，加入洗滌液，在搖床上中速搖動。洗滌5遍，每遍I分鐘。(8)稱取30 mg快紅溶於10 ml Ix Tris緩衝液中，4mg萘酚溶於10 ml超純去離子水(或蒸餾水)。將顯色液混勻後加入塑料平皿中，染色5分鐘。將抗原梳轉移至含20ml終止液的塑料平皿中，反應I分鐘，然後用水衝洗抗原梳I片刻，置於空氣中自然晾乾，最後判讀結果。染色後，病毒抗體陽性的點呈紅色(可視點)，病毒抗體陰性的抗原點無著色。3.結果判定，可以選用3. I和/或3. 2所述方式進行判讀。3. I肉眼判讀陽性⑵若對照細胞點無色或顏色很淡，但病毒抗原點顏色達試劑盒中提供的陽性對照點深度或更深，則判為陽性；陰性(N):若病毒抗原點無色，或顏色很淺且與相應對照細胞點接近，判為陰性。3. 2對檢測結果做定量分析。取獲得的帶有免疫斑點的抗原梳I,通過成像儀將免疫梳I成像,再用Image J軟體進行處理和分析。即可對所檢測的病毒抗體做定量分析。本實用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內，一次性同時檢測出B病毒、STLV、SIV、SRV、麻疹病毒、伊波拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒等多種病毒抗體中的任意數種，實現了多種病毒同步檢測，減少了每個標本的採樣量。一把抗原梳I可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時檢測多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。預點了若干病毒抗原的硝酸纖維膜可批量加工，且易於保存，穩定性及重複性好，結果可靠。上述實施例不以任何形式限制本實用新型，凡採用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術方案，均落在本實用新型的保 護範圍內。
權利要求1.一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳的一端部設置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。
2.根據權利要求I所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，所述的梳齒為12條。
3.根據權利要求I或2所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，所述的抗原梳的材質為PVC板。
4.根據權利要求I所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，所述的深孔板為lml96孔，且深孔板每排具有12個孔，而所述的梳齒的長度與深孔板的深度相配合。
5.根據權利要求I所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，所述的塑料平皿的尺寸為12cm*12cm。
6.根據權利要求I所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於所述的硝酸纖維膜上預點的抗原為實驗猴易感的B病毒、猴T細胞趨向性病毒I型和猴逆轉錄D型病毒、麻疹病毒、伊波拉病毒、猴痘病毒、狂犬病毒、猴病毒40及猴泡沫病毒中的至少一種病毒抗原。
7.根據權利要求I或2任一權利要求所述的一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於還包括一臺用於將染色後的抗原梳成像的成像儀。
專利摘要本實用新型公開了一種梳式斑點酶聯免疫多項病毒檢測試劑盒，其特徵在於，包括抗原梳、與抗原梳相匹配的深孔板和塑料平皿、所述抗原梳設置有多個平行的梳齒，所述的梳齒上貼附有按順序預點了若干項病毒抗原的硝酸纖維膜。本實用新型提供的檢測試劑盒，可在兩小時內，一次性同時檢測出多種病毒抗體，實現了多種病毒同步檢測，減少了每個標本的採樣量。一把抗原梳可以同時檢測12份樣本，一次實驗可以同時操作多把抗原梳，大大提高了檢測的速度和效率。使用硝酸纖維膜作為固相載體，可以增加抗原吸附量，提高了免疫反應的效率和敏感性，而且可批量加工，且易於保存，穩定性及重複性好，結果可靠。
文檔編號G01N33/543GK202393769SQ201120511078
公開日2012年8月22日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者時長軍 申請人:蘇州西山生物技術有限公司