製備用於核酸擴增反應的樣品的方法、核酸擴增方法及固相核酸擴增反應用試劑和微晶片的製作方法

2023-05-06 22:25:36

製備用於核酸擴增反應的樣品的方法、核酸擴增方法及固相核酸擴增反應用試劑和微晶片的製作方法
【專利摘要】本發明提供了製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法包括：將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟。
【專利說明】製備用於核酸擴增反應的樣品的方法、核酸擴增方法及固相核酸擴增反應用試劑和微晶片
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2013年3月29日提交的日本在先專利申請JP2013-075428的優先權，將其全部內容併入本文作為參考。

【技術領域】
[0003]本發明涉及製備用於核酸擴增反應的樣品的方法、核酸擴增方法、以及固相核酸擴增反應用試劑和微晶片。更具體地，本發明涉及製備用於核酸擴增反應的樣品所使用的固相試劑等。

【背景技術】
[0004]核酸擴增反應是重新合成與作為模板的核酸互補的核酸的反應。為進行核酸擴增反應，除用作模板的核酸外，還需要多種試劑(例如，稱為引物的寡核苷酸、或酶)。為進行核酸擴增反應，通過將試劑和用作模板的核酸混合，來製備用於核酸擴增反應的樣品。
[0005]在相關領域中，通過如下程序進行核酸擴增反應:將上述試劑和模板核酸加入微管等並將它們混合在一起，然後將獲得的用於核酸擴增反應的樣品轉移至合適的容器。此外，近年來開發了以例如微晶片的狀態存儲的試劑，其中，預先將核酸擴增反應所需的多種試劑混合。在一些情況下，將此類混合試劑收容於用於核酸擴增反應的基底材料中。
[0006]日本專利申請特開N0.2011-160728公開了 「一種用於核酸擴增反應的微晶片，該微晶片包含:入口，液體通過該入口從外部進入；多個孔，所述多個孔被設置成用作核酸擴增反應的反應位點；以及流道，從入口進入的液體通過該流道供給至每個孔，其中，使反應所需的多種試劑以指定順序層疊並固定於每個孔中」。


【發明內容】

[0007]在上述日本專利申請特開N0.2011-160728中所公開的微晶片中，能夠通過將反應所需的多種試劑固定於孔中，將含有模板核酸的樣品引入所述微晶片，從而簡便地進行核酸擴增反應。此外，為更簡便地進行核酸擴增反應，期望在製備樣品上作出進一步改進。
[0008]本發明中，有利地提供了製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法能夠簡單且精確地進行核酸擴增反應。
[0009]根據本發明的實施方式，提供了製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法包括將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑(binder)的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟。
[0010]在實施方式中，所述方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對所述液體進行稀釋的步驟。
[0011]在實施方式中，所述離子表面活性劑可為陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑可為十二烷基硫酸鈉。
[0012]在實施方式中，所述環糊精的濃度可高於或等於所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
[0013]在實施方式中，所述方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行超聲處理的步驟；並可包括在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行加熱的步驟。
[0014]根據本發明的另一實施方式，提供了核酸擴增方法，所述方法包括如下步驟:將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟；以及擴增所述核酸的步驟。
[0015]在實施方式中，所述核酸的擴增可在等溫下進行。此外，所述核酸可以是核糖核酸，並且所述核酸擴增方法可進一步包括在擴增所述核酸的步驟前，使用所述核糖核酸作為模板進行逆轉錄反應的步驟。
[0016]根據本發明的另一實施方式，提供了固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
[0017]在實施方式中，所述環糊精可包含羥丙基基團。
[0018]在實施方式中，可將所述固相核酸擴增反應用試劑混合於含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
[0019]在實施方式中，所述環糊精的濃度可高於或等於所述離子表面活性劑濃度的8倍。
[0020]在實施方式中，所述固相核酸擴增反應用試劑可進一步含有核糖核酸酶H。
[0021]根據本發明的另一實施方式，提供了包含固相核酸擴增反應用試劑的微晶片，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
[0022]在實施方式中，可在所述微晶片中設置的核酸擴增反應的多個反應位點的每一個反應位點中提供所述固相核酸擴增反應用試劑；並且，所述反應位點可通過流道與入口連通，液體通過所述入口進入所述微晶片。
[0023]根據本發明的實施方式，提供了製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法能夠簡單且精確地進行核酸擴增反應。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是根據本發明實施方式的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法的流程圖；
[0025]圖2A和圖2B是示出根據本發明實施方式的微晶片結構實例的示意圖。圖2A是俯視圖，圖2B是沿圖2A的IIB-1IB箭頭線的剖視圖；
[0026]圖3是替代附圖(drawing)的坐標圖(graph),闡述了 SDS濃度與RNase A活性間的關係(實施例3)；
[0027]圖4是替代附圖的坐標圖，闡述了 SDS濃度與血漿中含有的RNase A的活性間的關係(實施例4)；
[0028]圖5是替代附圖的坐標圖，闡述了 SDS濃度與血漿中含有的RNase A的活性間的關係(實施例4)；
[0029]圖6是替代附圖的坐標圖，闡述了在將細菌基因組用作模板核酸的核酸擴增反應中，SDS濃度與Tt值間的關係(實施例5)；
[0030]圖7是替代附圖的坐標圖，闡述了核酸擴增反應中SDS濃度與環糊精濃度間的關係(實施例6);以及
[0031]圖8是替代附圖的坐標圖，闡述了在伴有逆轉錄反應的核酸擴增反應中，RNase H濃度與Tt值間的關係(實施例10)。

【具體實施方式】
[0032]以下描述本發明的優選實施方式。以下描述的實施方式僅用於闡述本發明的典型實施方式，它們並不限定本發明的範圍。
[0033]1.根據本發明實施方式的固相核酸擴增反應用試劑
[0034]根據本發明實施方式的固相核酸擴增反應用試劑(以下也簡稱為「固相試劑」)至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。將按上述順序對所述固相試劑中包含的每種成分進行描述。
[0035](I) DNA 聚合酶
[0036]固相試劑中所含的DNA聚合酶是在核酸擴增反應中用於合成與模板核酸互補的核酸鏈的成分。可基於任意的核酸擴增方法，適當選擇DNA聚合酶。DNA聚合酶的實例包括Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。此外，其中可包括鏈置換型 DNA 聚合酶(chain substitut1n type DNA polymerase)。
[0037](2)環糊精
[0038]固相試劑中所含的環糊精是用於抑制所述固相試劑中所含的酶(例如DNA聚合酶)的活性降低的成分(參見實施例1)。將試劑製成預定的成分，隨後將預定的成分乾燥或凍幹，從而製得固相試劑。存在固相試劑中所含的酶失活的擔心，這依賴於此類製備過程或製備過程後的乾燥狀態。在根據本發明實施方式的固相試劑中，使用含有環糊精的試劑能夠抑制酶活性降低(參見實施例1)。
[0039]此外，環糊精還具有如下效果:抑制將要描述的含有核酸的液體中所含的離子表面活性劑對核酸擴增反應的抑制作用(參見實施例2)。在含有核酸的液體含有離子表面活性劑的情況下，為獲得抑制效果，優選固相試劑中環糊精的濃度高於或等於所述離子表面活性劑濃度的8倍(參見實施例6)。
[0040]環糊精的實例包括:α-環糊精(葡萄糖數目:6)、環糊精(葡萄糖數目:7)、Y-環糊精(葡萄糖數目:8)，及它們的衍生物。環糊精的衍生物是部分羥基基團被OR基團取代的分子。R的實例包括烴基基團(如甲基和乙基)以及羥烷基基團(如羥乙基基團和羥丙基基團)。
[0041]在根據本發明實施方式的固相試劑中，優選環糊精具有羥丙基基團，例如羥丙基-β-環糊精(ΗΡβ⑶)。由於與β-環糊精相比，HP β⑶具有較高的水溶性，這易於將足夠量的環糊精加至固相試劑，以獲得關於將要描述的離子表面活性劑的效果。
[0042](3)粘合劑
[0043]固相試劑中所含的粘合劑是用於增強所述固相試劑的形狀穩定性的成分。特別是在固相試劑中含有具有高吸溼性(hygroscopicity)的環糊精(如上述HP β⑶)的情況下，難以維持固相試劑的形狀。因此，可通過加入粘合劑維持根據本發明實施方式的固相試劑的形狀。
[0044]只要所述成分不抑制核酸擴增反應，任何成分都可用作粘合劑。粘合劑的實例包括碳水化合物，如蔗糖、葡聚糖、海藻糖和FICOLL ;蛋白或肽，如膠原肽、明膠和BSA ；以及聚合化合物，如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮。可這樣來製備含有粘合劑的固相試劑:將含有上述成分的粘合劑溶解液與含有DNA聚合酶等的液體型或凝膠型試劑混合，隨後將混合物乾燥或凍幹。
[0045](4)核糖核酸酶H
[0046]根據本發明實施方式的固相試劑可含有核糖核酸酶H (RNase H)。RNase H是特異性水解RNA/DNA雜合鏈中的RNA鏈的酶。含有核糖核酸酶H (RNase H)的固相試劑適用於伴有逆轉錄反應的核酸擴增反應，並適用於等溫核酸擴增方法。與分兩步獨立進行反應的情況相比，伴有逆轉錄反應的核酸擴增反應是可通過連續進行逆轉錄反應和核酸擴增反應的迅速檢測RNA的技術。
[0047]在逆轉錄反應中，使用RNA作為模板合成DNA，但合成的DNA處在與用作模板的RNA雜交的狀態。在等溫核酸擴增方法中，由於沒有反應溫度升高而使處在RNA/DNA雜合鏈狀態的核酸變性從而形成單鏈的過程，存在如下擔心:使用合成的DNA作為模板的核酸擴增反應的效率降低。通過將RNase H納入固相試劑，使與所述DNA雜交的RNA降解以使所述DNA成為單鏈，從而可更有效地進行核酸擴增反應。也存在逆轉錄酶具有RNase H活性的情況。然而，與僅使用逆轉錄酶的RNase H活性的情況相比，如果試劑含有RNase H，能夠更有效地進行核酸擴增反應(參見實施例10)。
[0048]除上述成分外，根據本發明實施方式的固相試劑可含有核酸擴增反應所需的成分。固相試劑中含有的此類成分的實例包括dNTP或引物，以及用於穩定核酸擴增反應的緩衝溶液中含有的成分。為了在完成RNA鏈逆轉錄反應的冋時抑制降解,可在固相試劑中納入針對RNase A的抑制劑。此外，上述RNase H的活性不受RNase A抑制劑幹擾。因此，在使用用於伴有逆轉錄反應的核酸擴增反應的固相試劑的情況下，所述固相試劑優選含有RNase A抑制劑和RNase H (參見實施例11)。
[0049]2.根據本發明實施方式的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法
[0050]上述固相核酸擴增反應用試劑可適用於根據本發明實施方式的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法(以下也簡稱為「樣品製備方法」)。圖1是根據本發明實施方式的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法的流程圖。所述樣品製備方法包括將固相試劑(固相核酸擴增反應用試劑)溶解於含有核酸的液體中的步驟(溶解步驟Si)。此外，所述樣品製備方法可包括在所述固相試劑的溶解步驟(溶解步驟Si)前，用含有離子表面活性劑的溶液對所述液體進行稀釋的步驟(稀釋步驟SO)。此外，除所述步驟外，本發明實施方式的核酸擴增方法可包括擴增核酸的步驟(擴增步驟S2)。對圖1中示出的各步驟進行描述。
[0051](I)溶解步驟
[0052]在溶解步驟SI中，將上述固相試劑溶解於含有核酸的液體中，所述核酸用作核酸擴增反應中的模板核酸。在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，所述核酸是來源於動物、植物、真菌、細菌、病毒等的核酸。所述核酸可以是任何單鏈核酸和雙鏈核酸，並可以是任何DNA和RNA。此外，對所述核酸的分子量也沒有特別的限定。樣品中含有的核酸可以是處於被細胞膜包圍的狀態，或是處於存在於顆粒中的狀態(如細菌細胞中存在的細菌基因組)，而非直接分散在所述樣品中。
[0053]在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，可使用任何含有核酸的液體，只要所述液體含有上述核酸。然而，優選核酸包含於此類溶劑中:所述液體中的核酸在該溶劑中幾乎不降解、並且該溶劑不含有抑制核酸擴增反應的成分。溶劑的實例包括多種緩衝溶液(如Tris緩衝溶液)和水。含有核酸的液體可以是生物體來源的樣品或其稀釋液。生物體來源的樣品的實例包括全血、血漿、血清、腦脊液、尿、精液、拭樣(swab)(具有鼻和喉的擦拭液(swabbed liquid)、鼻粘液、痰等的拭樣)、唾液等。此外,含有核酸的液體可以是凝膠型液體。
[0054]在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，由於固相試劑含有DNA聚合酶，能夠通過將固相試劑溶解於含有核酸的液體中，來容易地製備用於核酸擴增反應的樣品。此外，由於所述固相試劑中含有環糊精，抑制了固相試劑中含有的DNA聚合酶的活性降低。據此，在根據本發明實施方式的使用固相試劑的樣品製備方法中，能夠簡單地製備樣品並精確地實施核酸擴增反應。
[0055](2)稀釋步驟
[0056]在圖1示出的稀釋步驟SO中，將上述含有核酸的液體用含有離子表面活性劑的溶液稀釋。所述離子表面活性劑的實例包括陽離子表面活性劑(如十六烷基三甲基溴化銨和十四烷基三甲基溴化銨)和陰離子表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉(SDS)和脫氧膽酸鈉)。作為離子表面活性劑，優選陰離子表面活性劑，更優選SDS。
[0057]通過用含有離子表面活性劑的溶液稀釋含有核酸的液體，能夠抑制所述液體中含有的核酸降解酶的活性。特別是，在液體中含有的核酸是RNA的情況下，存在如下擔心:RNA被RNase A降解，逆轉錄反應不能進行。由於這一原因，優選樣品製備方法在溶解步驟SI前包括稀釋步驟S0。此外，甚至在所述液體中含有的核酸是細菌基因組等的情況下，也優選樣品製備方法包括稀釋步驟S0。這是由於在將要描述的加熱步驟中，可簡單地進行溶菌。
[0058]通過在含有核酸的液體中加入離子表面活性劑(如SDS)，能夠表現出上述效果。另一方面，存在如下擔心:核酸擴增反應中離子表面活性劑抑制DNA聚合酶活性並使得核酸擴增反應的效率降低。由於根據本發明實施方式的固相試劑中含有環糊精，因此即使在所述液體中含有離子表面活性劑的情況下，也能夠包合離子表面活性劑。據此，即使在所述液體含有離子表面活性劑的情況下，也難以抑制核酸擴增反應。為表現出通過環糊精而帶來的包合離子表面活性劑的效果，例如，優選環糊精的濃度高於或等於十二烷基硫酸鈉濃度的8倍(參見實施例6)。
[0059]在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，能夠使用離子表面活性劑以降低核酸降解或從細胞中提取出基因組(如細菌基因組)。此外，使用包含於固相試劑中的環糊精，即使在使用離子表面活性劑的情況下，也能夠有保證地進行核酸擴增反應。據此，使用根據本發明實施方式的樣品製備方法，能夠簡單並有保證地進行核酸擴增反應。
[0060](3)擴增步驟
[0061]在擴增步驟S2中，使用在上述溶解步驟SI中將固相試劑溶解於其中的液體，對所述液體中含有的核酸進行擴增。在擴增步驟S2中，能夠從現有的核酸擴增方法中適當地選擇方法來進行核酸擴增反應。核酸擴增方法的實例包括實施溫度循環的聚合酶鏈式反應(PCR)0此外，還可使用不帶溫度循環的多種等溫擴增方法。等溫擴增方法的實例包括環介導等溫擴增(LAMP)方法和轉錄-逆轉錄協同(TRC)方法。在根據本發明實施方式的核酸擴增方法中，優選等溫下進行核酸擴增的等溫擴增方法，例如，作為等溫擴增方法優選LAMP方法。
[0062](4)逆轉錄反應步驟
[0063]在液體中含有的核酸是核糖核酸(RNA)的情況下，樣品製備方法可包括在擴增步驟S2前使用核糖核酸作為模板進行逆轉錄反應的步驟。逆轉錄反應和核酸擴增反應可獨立進行或在一個反應位點連續進行，例如，進行逆轉錄反應-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或進行逆轉錄反應_LAMP(RT-LAMP)。在連續進行兩個反應的情況下，優選固相試劑除DNA聚合酶外還含有逆轉錄酶。
[0064](5)超聲處理步驟
[0065]根據本發明實施方式的樣品製備方法可包括在溶解步驟SI前，對所述液體的稀釋液進行超聲處理的步驟。在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，超聲處理步驟是任選的。然而，例如， 在作為模板的核酸在細胞中、類似於細菌基因組的情況下，通過進行超聲處理能夠破壞細胞膜，從而容易將核酸釋放於稀釋液中。由於這一原因，與核酸留存在細胞中的情況相比，因為核酸可容易地與引物或試劑中的其它成分接觸，所以核酸擴增反應變得更有效。
[0066]在稀釋液的超聲處理步驟中，可使用現有的超聲波發生器。例如，可使用接觸式超聲波發生器，如喇ΠΛ型(horn-type)超聲勻楽;機。此外,也可使用不與樣品接觸的非接觸式超聲設備。可基於超聲波發生器的性能或液體的性質選擇合適的超聲波頻率。
[0067](6)加熱步驟
[0068]根據本發明實施方式的樣品製備方法可包括在溶解步驟SI前，對所述液體的稀釋液進行加熱的步驟。在根據本發明實施方式的樣品製備方法中，加熱步驟是任選的。然而，例如，在作為模板的核酸在細胞中、類似於細菌基因組的情況下，與超聲處理一樣，能夠通過加熱稀釋液進行溶菌。此外，即使作為模板的核酸來自於病毒，例如，在病毒具有包膜的情況下，使用加熱步驟能夠將病毒基因組從包膜中分離並將病毒基因組擴散於液體中。
[0069]進行加熱步驟時，為更有保證地進行上述細胞膜的溶解或包膜的分離，優選在稀釋步驟SO中，將病毒基因組稀釋於含有離子表面活性劑(如SDS)的液體中。在加熱步驟中，稀釋液中SDS的濃度優選高於或等於0.01%並低於1%，更優選高於或等於0.1%並低於1%(參見實施例5)。3.微晶片
[0070]上述根據本發明實施方式的固相試劑適用於使用微晶片的核酸擴增反應。圖2A和圖2B闡明了根據本發明第一實施方式的微晶片。圖2A是微晶片M的俯視圖，圖2B是沿圖2A的IIB-1IB箭頭線的剖視圖。微晶片M設置為具有三層基底層11、12和13 (參見圖2B)。此外，微晶片M提供有孔21-25作為核酸擴增反應的多個反應位點。在圖2A和圖2B中，與流道連通的五個孔分配有相同的附圖標記。
[0071]微晶片M提供有固相核酸擴增反應用試劑(固相試劑)R，所述固相試劑R至少含有RNA聚合酶、環糊精和粘合劑。如圖2B所示，優選在微晶片M中設置的多個反應位點(孔23)中提供固相試劑R。此外，如圖2A所示，反應位點(孔21-25)通過流道31-35與入口 4連通，液體通過所述入口 4進入所述微晶片M。根據本發明實施方式的微晶片M的形狀不限於圖2A和圖2B所示的形狀，並可基於微晶片的應用目的來合適地設計孔21-25的數量等。
[0072]根據本發明第一實施方式的微晶片M在其內部提供有固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。由於這一原因，通過含有核酸的液體從外部進入，能夠在微晶片中製備用於核酸擴增反應的樣品。
[0073]此外，由於固相試劑R含有環糊精，因此能夠抑制固相試劑R中含有的DNA聚合酶的活性降低，並能夠在微晶片M中有保證地進行核酸擴增反應。
[0074]此外，由於固相試劑R含有粘合劑，所述試劑的形狀得以穩定。由於這一原因，即使在固相試劑R提供於多個反應位點(孔21-25)中的情況下，固相試劑R的形狀是一致的。因此，能夠抑制關於由於液體進入微晶片M造成固相試劑R溶解的變化。此外，相比於製備用於核酸擴增反應的樣品並隨後使其進入反應位點的情況，通過在核酸擴增反應的反應位點提供固相試劑R，能夠校準(align)核酸擴增反應的起始時間。據此，能夠精確改進使用微晶片M進行的核酸擴增反應。
[0075]可如下設置本發明的實施方式:
[0076](I)製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法包括:將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟。
[0077](2)根據上述(I)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對所述液體進行稀釋的步驟。
[0078](3)根據上述(2)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述離子表面活性劑是陰離子表面活性劑。
[0079](4)根據上述(3)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
[0080](5)根據上述(4)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述環糊精的濃度高於或等於所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
[0081](6)根據上述(2)- (5)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行超聲處理的步驟。
[0082](7)根據上述(2)- (5)的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括:在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行加熱的步驟。
[0083](8) 一種核酸擴增方法，所述方法包括如下步驟:將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟；以及擴增所述核酸的步驟。
[0084](9)根據上述(8)的核酸擴增方法，其中，所述核酸的擴增在等溫下進行。
[0085](10)根據上述(8)或(9)的核酸擴增方法，其中，所述核酸是核糖核酸；以及，所述核酸擴增方法進一步包括在擴增所述核酸的步驟前，使用核糖核酸作為模板進行逆轉錄反應的步驟。
[0086](11) 一種固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
[0087](12)根據上述(11)的固相核酸擴增反應用試劑，其中，所述環糊精包含羥丙基基團。
[0088](13)根據上述(11)或(12)的固相核酸擴增反應用試劑，其中，將所述固相核酸擴增反應用試劑混合於含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
[0089](14)根據上述(12)和(13)的固相核酸擴增反應用試劑，其中，所述環糊精的濃度高於或等於所述離子表面活性劑濃度的8倍。
[0090](15)根據上述(11)- (14)的固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑進一步含有核糖核酸酶H。
[0091]( 16) 一種微晶片,所述微晶片包含固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
[0092](17)根據上述(16)的微晶片，其中，在所述微晶片中設置的核酸擴增反應的多個反應位點的每一個反應位點中提供所述固相核酸擴增反應用試劑；並且，所述反應位點通過流道與入口連通，液體通過所述入口進入所述微晶片。
[0093]實施例
[0094]實施例1
[0095]1.驗證由環糊精所產生的對核酸擴增反應用試劑的活性的維持
[0096]對通過將環糊精加入核酸擴增反應用試劑(含有DNA聚合酶)是否使得所述核酸擴增反應用試劑的活性得以維持進行了驗證。
[0097]材料和方法
[0098]實施例1中使用的固相試劑的組成在表1中示出。作為環糊精，在實施例1中使用羥丙基-β-環糊精(HP β CD)。作為粘合劑，使用溶解有下列物質中任何一種以上物質的粘合劑溶液:蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、海藻糖、膠原肽、明膠、BSA、FICOLL和聚乙烯吡咯烷酮。將Bst DNA聚合酶Lg Frag (NEW ENGLAND B10LABS)用作DNA聚合酶。將含有HP β CD、粘合劑溶液和DNA聚合酶的試劑溶液混合，以達到表1中示出的預定濃度，將混合物分配至容器中並凍幹，以獲得試驗例1-6的固相試劑。此外，作為比較例1，還製備了不含有HP β CD及粘合劑的試劑溶液，並將其凍幹。此外，作為比較例2，將不含有粘合劑的試劑溶液與HP β⑶混合，並將混合物凍幹。
[0099]表1
[0100]
比較例試驗例
_ I I Υ~ I I 2 I 3 I 4 I 5 I 6
HPpCD 濃度(w/v%) 0.0 3.6 —3.0 3.0 Τβ~ 3.6 3.6~X6~ 粘合劑濃度(w/v%) 0.0 0.0 _5.7 5.7 42~ 4.8 ~48~?6~
直到反應開始的時間(％) 不反『+17 ~10 +36 ~m~ +60 +3 +--
固相狀態X |χ|ο|ο|ο|ο|ο|δ
[0101]將上述比較例1-2以及試驗例1-6溶解於含有模板核酸的液體中，以使用LAMP方法進行核酸擴增反應。用與擴增的核酸鏈特異性雜交的淬滅(quenching)探針對擴增的核酸鏈進行檢測。淬滅探針的末端結合有螢光物質。在淬滅探針中，如果淬滅探針未與核酸鏈雜交，結合的螢光物質發光；但是如果淬滅探針與核酸雜交，螢光物質則淬滅。通過測定螢光的變化，能夠檢測核酸的擴增。
[0102]結果
[0103]實施例1的結果在表1中示出。在表1中，直到反應開始的時間表明直到核酸擴增反應開始的時間，對應於Tt值(分鐘)，該時間基於螢光物質的淬滅信號的拐點。關於直到確定使用LAMP方法進行的核酸擴增反應開始時所需的時間，將使用由相同組分構成且未凍幹的試劑進行核酸擴增反應時的時間(Tt值)作為參比，將相對於該時間(Tt值)的增加以比例(％)表不。此外，固相狀態表明凍幹後試劑的狀態。「X」表明試劑並未成為固相狀態Δ 」表明試劑成為固相狀態,「O」表明固相狀態長時間維持。
[0104]如表1所示，在不含有ΗΡβ CD的比較例I中無法檢出核酸擴增。另一方面，在含有HPiiCD的比較例2和試驗例1-6中進行了核酸擴增，儘管與試劑未凍幹的情況相比，直到核酸擴增反應開始花費了較長時間。結果證實，當加入HPiiCD時，甚至凍幹試劑中DNA聚合酶的活性也得到維持。
[0105]此外，如表1所示，在不含粘合劑的比較例2中，即使將試劑凍幹仍難以使試劑成為固相。另一方面，證實了在含有粘合劑的試驗例1-6中所述試劑成為了固相。上述結果證實，環糊精和粘合劑是維持試劑中含有的DNA聚合酶的活性以及將試劑維持在固相狀態所必需的。
[0106]實施例2
[0107]2.驗證環糊精對加入了 SDS的核酸擴增反應溶液的效果
[0108]在實施例2中，對加入環糊精是否使SDS對核酸擴增反應的影響降低進行了驗證。
[0109]材料和方法
[0110]實施例2中使用的試劑的組成在表2中示出。作為環糊精，在實施例2中使用羥丙基-β -環糊精(HP β⑶)。將以預定濃度加入有SDS和環糊精的RT-LAMP反應試劑設置為試驗例1-3。此外，作為比較例1，僅製備RT-LAMP反應試劑。此外，將含有濃度為0.4%的SDS的LAMP反應試劑設置為比較例2。分別將上述比較例1-2以及試驗例1_3與模板核酸混合，以使用LAMP方法進行核酸擴增反應。使用類似於實施例1的淬滅探針對擴增的核酸鏈進行檢測。
[0111]結果
[0112]實施例2的結果在表2中示出。在表2中，直到反應開始的時間如實施例1所述。如表2所示，證實了通過將SDS加入核酸擴增反應溶液，抑制了核酸擴增反應(比較例2)。此外，證實了即使將HP β CD以5倍於SDS的濃度加入，核酸擴增反應仍然受到抑制(試驗例I)。另一方面，在含有10倍於SDS濃度的HP β⑶的試驗例2以及含有15倍於SDS濃度的ΗΡβ⑶的試驗例3中，證實了核酸的擴增。上述結果證實了，即使在SDS的存在下，通過將環糊精以例如約10倍於SDS的濃度加入核酸擴增反應溶液，核酸擴增反應不被抑制。
[0113]表2

【權利要求】
1.一種製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法包括: 將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟。
2.根據權利要求1所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，用含有離子表面活性劑的溶液對所述液體進行稀釋的步驟。
3.根據權利要求2所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述離子表面活性劑是陰離子表面活性劑。
4.根據權利要求3所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
5.根據權利要求4所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，其中，所述環糊精的濃度高於或等於所述十二烷基硫酸鈉濃度的8倍。
6.根據權利要求2所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行超聲處理的步驟。
7.根據權利要求2所述的製備用於核酸擴增反應的樣品的方法，所述方法進一步包括: 在所述固相試劑的溶解步驟前，對所述液體的稀釋液進行加熱的步驟。
8.—種核酸擴增方法，所述方法包括如下步驟: 將至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑的固相試劑溶解於含有核酸的液體中的步驟；以及 擴增所述核酸的步驟。
9.根據權利要求8所述的核酸擴增方法，其中，所述核酸的擴增在等溫下進行。
10.根據權利要求8所述的核酸擴增方法， 其中，所述核酸是核糖核酸；以及 其中，所述核酸擴增方法進一步包括在擴增所述核酸的步驟前，使用所述核糖核酸作為模板進行逆轉錄反應的步驟。
11.一種固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
12.根據權利要求11所述的固相核酸擴增反應用試劑，其中，所述環糊精包含羥丙基基團。
13.根據權利要求11所述的固相核酸擴增反應用試劑，其中，將所述固相核酸擴增反應用試劑混合於含有模板核酸鏈和離子表面活性劑的液體中。
14.根據權利要求13所述的固相核酸擴增反應用試劑，其中，所述環糊精的濃度高於或等於所述離子表面活性劑濃度的8倍。
15.根據權利要求13所述的固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑進一步含有核糖核酸酶H。
16.一種微晶片，所述微晶片包含固相核酸擴增反應用試劑，所述固相核酸擴增反應用試劑至少含有DNA聚合酶、環糊精和粘合劑。
17.根據權利要求16所述的微晶片， 其中，在所述微晶片中設置的核酸擴增反應的多個反應位點的每一個反應位點中提供所述固相核酸擴增反應用試劑；以及 其中，所述反應位點 通過流道與入口連通，液體通過所述入口進入所述微晶片。
【文檔編號】C12N15/10GK104073485SQ201410108292
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】中村友彥, 町田賢三 申請人:索尼公司