一種肌肉勻漿提取物及其製備方法與應用的製作方法
2023-05-06 14:46:31
專利名稱：一種肌肉勻漿提取物及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，具體的說涉及一類肌肉勻漿提取物及其製備方法；本發明還涉及所述肌肉勻漿提取物在製備用於治療神經退行性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年痴呆，是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特徵的腦退行性疾病。表現為全面持久的智能減退，包括記憶力、計算力、抽象思維能力和語言功能的減退，出現情感和行為異常，喪失工作能力和獨立生活能力。該病早期的行為學改變為輕微的記憶紊亂或個性改變，在5～10年內逐漸惡化，最終出現嚴重痴呆症狀，生活不能自理。這種隱襲和破壞性的大腦退行性疾病剝奪了受害者最具人類特徵的品質——記憶、推理、抽象化和語言的能力。老年斑(senile plaque，SP)、神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)和出現大腦神經元死亡、突觸丟失和反應性膠質細胞增生等為AD的主要病理變化。
目前應用的老年痴呆治療藥大多以膽鹼酯酶抑制劑為主，如他克林(Tacrine)、哈伯因(Huperzine A)、安理申(Aricept)、艾斯能(Exelon)、多奈哌齊(Donepezil)等。然而，這些藥物遠期效果並不理想，原因是老年痴呆並不僅僅是一個膽鹼能神經遞質系統的問題，而是多種類型的神經元受損和死亡。越來越多的研究結果表明，老年痴呆是由於遺傳因素和環境因素，經過複雜的病理過程，最終導致神經元損傷，引起神經元與神經元的連接——突觸的損傷甚至缺失，神經網絡的崩潰，從而引起記憶認知功能障礙。神經元體積擴大及突觸缺失可歸結為I型營養障礙軸突。胞內磷酸化tau(microtubule-associated protein tau)形成的成對螺旋絲，即NFT可歸結為II型營養障礙軸突。老年斑在正常老年人大腦中也存在，只是數量比老年痴呆患者少得多，表明老年斑只是各種因素引發病理生理改變的最終病理產物。目前老年痴呆病因不清，雖然提出了一些病因假說，但都不能完全令人信服，其治療策略也沒有得到臨床實驗的證實。AD的病因與發病機制非常複雜，是以漸進性認知功能損害為特徵的多病因的疾病或臨床綜合症。即便是單一病因治療有用，由於其多病因的存在，療效也不會太好。何況當老年患者發現有記憶力障礙時，一般都已進入疾病中、晚期，病因已發揮作用，此時病理改變從海馬和內嗅皮質擴展到大腦皮質，大腦已有輕度萎縮，大多數神經元已受損或死亡，病理已基本形成。此時對因治療恐怕為時已晚(療效不明顯)。除了AD，其它神經退行性疾病，如PD、pick病、Huntington disease和營養不良側索硬化同樣存在這樣的問題。因此，早期的病因治療較為單純，療效較好，而晚期的病因治療較為複雜，除一般病因治療外，如不及時補充死亡的神經元，療效甚差。故如何保護已有神經元的功能和促進腦內自身幹細胞分裂、增殖並轉化為正常神經元，以補充損失的神經元成為治療老年痴呆的關鍵及很有希望的策略。
目前所知，在鳥類、嚙齒類、靈長類和人類成年腦中，均發現神經幹細胞的存在。這表明在高等脊椎動物成體中，能夠產生新生神經元，對傳統的神經元不能再生只能減少的觀念提出了挑戰。當這些幹細胞被移植入小鼠或大鼠的體內後，它們能形成新的血管，能使較軟的骨質變硬，甚至能主動遷移去尋找損傷的脊柱和大腦並將它們修復。細胞移植實驗表明，腦中的幹細胞可以形成肌細胞，而骨髓細胞則可形成神經細胞。這些研究結果似乎強化了這樣一個結論來自不同組織的幹細胞，當被適當的信號刺激時，能改變原來的發育軌跡，遠離他們本來的發育模式和形態，發育成為一種新的細胞。
如果類似的現象在人類大腦中也能發生，這將意味著如果使用皮膚或骨髓的一些來源容易的幹細胞，可用於治療神經方面的退行性疾病。這也是為什麼近年來幹細胞的研究在世界範圍內受到極大重視的原因。神經幹細胞因其有著潛在的臨床應用價值，已成為當今生命科學領域研究的熱點之一。神經幹細胞是一種具有自我更新、自我複製以及分化成為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的多潛能未分化幹細胞。現已發現神經幹細胞不僅存在於發育的神經系統中，也存在於成年哺乳動物(包括人)的中樞神經系統內，如海馬的齒狀回、側腦室的室下區。神經幹細胞的發現和體外成功培養，為中樞神經系統疾病(如神經損傷、神經退行性疾病)的治療帶來生機和曙光，也為幹細胞增殖、分化機制的研究提供了新的材料和方法。如果能促使這些幹細胞分裂和分化成各種功能的神經元，或是移植部分幹細胞至患者的腦內，將大大改善患者神經元的再生能力，恢復其原來的功能。對幹細胞的分裂和分化起作用的藥物，為治療腦損傷及神經退行性疾病如AD，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)提供新的途徑。因此，從天然藥物或機體本身中尋找促進神經幹細胞增殖和分化的有效成分具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一種肌肉勻漿提取物，該肌肉勻漿提取物能促進神經幹細胞增殖和分化。
本發明的另一個目的是提供所述肌肉勻漿提取物的製備方法。
本發明的另一個目的在於提供所述肌肉勻漿提取物在製備用於治療神經退行性疾病藥物中的應用。
本發明的肌肉勻漿提取物的製備方法包括如下步驟(1)生理鹽水或磷酸鹽緩衝液溶解經粉碎的肌肉，離心取上清液；(2)濾膜除菌後，離心分離，取上清液；(3)通過超濾膜取下層液；(4)葡萄糖凝膠層析，得到的層析洗脫液經濾膜除菌；(5)過超濾膜，得到肌肉勻漿提取物。
本發明對生理鹽水或磷酸鹽緩衝液的用量沒有嚴格限制，以達到完全溶解肌肉為準。發明人經過探索性試驗發現的最佳的肌肉與生理鹽水或磷酸鹽緩衝液的重量克∶體積毫升比為1∶5～10，採用3-300KD的超濾膜，所述濾膜孔徑為0.22μm。
步驟(2)所述離心分離的轉速為3000-7000轉/分，溫度為1-4℃。
所述方法製備的肌肉勻漿提取物可用於製備用於治療神經退行性疾病的藥物中的應用。
所述的神經退行性疾病為阿爾茨海默病。
所述的神經退行性疾病為帕金森病。
發明人經過探索性試驗發現，肌肉勻漿提取物具有顯著地治療阿爾茨海默病等神經退行性疾病的作用。採用體外培養小鼠神經幹細胞，建立神經幹細胞增殖的細胞模型，加入肌肉勻漿提取物，結果表明不同劑量組對神經幹細胞均有增殖作用，MTT顯示給藥組細胞活性明顯增加，神經球計數表明給藥組多於空白對照組，統計學有顯著性差異，以高劑量組最為明顯。體內實驗將肌肉勻漿提取物注射到昆明小鼠側腦室內，結果表明給藥組大腦中神經幹細胞明顯增殖，空白對照組幾乎沒有幹細胞增加。以上實驗表明肌肉勻漿提取物具有提高神經幹細胞活性，促進其增殖的作用，從而能達到治療與延緩AD等神經退行性疾病的目的。
本發明的有益效果目前應用的老年痴呆治療藥大多以膽鹼酯酶抑制劑為主，這些藥物的治療效果不理想。本發明經過大量的實驗證明了肌肉勻漿提取物具有提高神經幹細胞活性，促進其增殖，補充減少的神經元的作用，從而能達到治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病的目的，經試驗無毒性。其治療效果顯著，應用前景廣闊。
具體實施例方式
實施例1 肌肉勻漿提取物的製備將成年雄鼠頸椎脫臼處死，剝離取後肢肌肉，在4℃用0.9％生理鹽水漂洗3遍。把分離肌肉剪碎，按1∶5比例(質量體積比)加入0.9％生理鹽水。用勻漿機勻漿。離心(5000rpm，40min，4℃)，去除沉澱，取上清液。進一步低溫高速離心(13500g，40min，4℃)，取上清液。過300KD超濾膜(13500g，40min，4℃)取下層液。過0.22μm濾膜除菌，-20℃凍存。葡聚糖凝膠層析凝膠的溶脹10g Sephadex G75乾粉中加入200ml 0.9％生理鹽水，沸水浴3h，冷卻，去除細顆粒，並除去氣體。裝柱(1)先向柱內加滿洗脫劑，檢查是否漏水，排除柱內氣泡，關閉出液口，使柱內洗脫液的體積約佔總體積的15％；(2)將溶脹的Sephadex G75緩慢注入柱內，避免氣泡產生；(3)裝好停10min，打開出液口，排出過量洗脫液；(4)膠上保留2～3cm洗脫液，調好流速(3ml/min)，平衡。樣品的準備和上樣將洗脫液下降至浴凝膠表面相切，取樣體積為床體積的5％，沿管壁小心加在膠上面，打開柱出口，至樣品完全滲入凝膠床，用2ml洗脫液沿管壁洗一次，將衡壓洗脫瓶與柱上端相連進行連續洗脫。洗脫；收集洗脫液。過0.22μm濾膜除菌。高速離心取上清液，過3KD超濾膜得到肌肉勻漿提取物，經試驗無毒性。
實施例2 肌肉勻漿提取物的製備將成年雄鼠頸椎脫臼處死，剝離取後肢肌肉，在4℃用0.9％生理鹽水漂洗3遍。把分離肌肉剪碎，按1∶10比例(質量體積比)加入0.9％生理鹽水。用勻漿機勻漿。離心(5000rpm，40min，4℃)，去除沉澱，取上清液。進一步低溫高速離心(13500g，40min，4℃)，取上清液。過100KD超濾膜(13500g，40min，4℃)取下層液。過0.22μm濾膜除菌，-20℃凍存。葡聚糖凝膠層析凝膠的溶脹10g Sephadex G75乾粉中加入200ml 0.9％生理鹽水，沸水浴3h，冷卻，去除細顆粒，並除去氣體。裝柱(1)先向柱內加滿洗脫劑，檢查是否漏水，排除柱內氣泡，關閉出液口，使柱內洗脫液的體積約佔總體積的15％；(2)將溶脹的Sephadex G75緩慢注入柱內，避免氣泡產生；(3)裝好停10min，打開出液口，排出過量洗脫液；(4)膠上保留2～3cm洗脫液，調好流速(3ml/min)，平衡。樣品的準備和上樣將洗脫液下降至浴凝膠表面相切，取樣體積為床體積的5％，沿管壁小心加在膠上面，打開柱出口，至樣品完全滲入凝膠床，用2ml洗脫液沿管壁洗一次，將衡壓洗脫瓶與柱上端相連進行連續洗脫。洗脫；收集洗脫液。過0.22μm濾膜除菌。高速離心取上清液，過3KD超濾膜得到肌肉勻漿提取物，經試驗無毒性。
實施例3 肌肉勻漿提取物的製備將成年雄鼠頸椎脫臼處死，剝離取後肢肌肉，在4℃用0.9％生理鹽水漂洗3遍。把分離肌肉剪碎，按1∶7比例(質量∶體積比)加入0.9％生理鹽水。用勻漿機勻漿。離心(5000rpm，40min，4℃)，去除沉澱，取上清液。進一步低溫高速離心(13500g，40min，4℃)，取上清液。過3KD超濾膜(13500g，40min，4℃)取下層液。過0.22μm濾膜除菌，-20℃凍存。葡聚糖凝膠層析凝膠的溶脹10g Sephadex G75乾粉中加入200ml 0.9％生理鹽水，沸水浴3h，冷卻，去除細顆粒，並除去氣體。裝柱(1)先向柱內加滿洗脫劑，檢查是否漏水，排除柱內氣泡，關閉出液口，使柱內洗脫液的體積約佔總體積的15％；(2)將溶脹的Sephadex G75緩慢注入柱內，避免氣泡產生；(3)裝好停10min，打開出液口，排出過量洗脫液；(4)膠上保留2～3cm洗脫液，調好流速(3ml/min)，平衡。樣品的準備和上樣將洗脫液下降至浴凝膠表面相切，取樣體積為床體積的5％，沿管壁小心加在膠上面，打開柱出口，至樣品完全滲入凝膠床，用2ml洗脫液沿管壁洗一次，將衡壓洗脫瓶與柱上端相連進行連續洗脫。洗脫；收集洗脫液。過0.22μm濾膜除菌。高速離心取上清液，過3KD超濾膜得到肌肉勻漿提取物，經試驗無毒性。
實施例4 實施例1得到的肌肉勻漿提取物對體外培養的神經幹細胞生長狀態的影響將神經幹細胞接種於24孔培養板，隨機分為空白對照組、陽性對照組、提取物低劑量組(10％)、提取物中劑量組(5％)、提取物高劑量組(2.5％)加入培養孔中，於4d後，使用MTT法檢測其活性。結果如表1表1
**與溶媒對照組相比，P＜0.01。
表明肌肉勻漿提取物對神經幹細胞具有營養作用，提高其存活率。可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
實施例5 實施例1得到的肌肉勻漿提取物對體外培養的神經幹細胞的增殖作用將神經幹細胞接種於24孔培養板，隨機分為空白對照組、陽性對照組、提取物低劑量組(2.5％)、提取物中劑量組(5％)、提取物高劑量組(10％)加入培養孔中，於7d後，採用神經球計數法。結果如表2表2
**與溶媒對照組相比，P＜0.01。
表明肌肉勻漿提取物對神經幹細胞有促增殖作用。可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
實施例6稱取實施例1得到的肌肉勻漿提取物凍乾粉10g，加入120g澱粉和50g糊精和2％羧甲基纖維素鈉水溶液40ml，在攪拌器中充分混勻，製成軟材。軟材用搖擺式顆粒機製成20目顆粒，流化床60℃沸騰乾燥1h，幹顆粒以高速整粒機整粒後加入硬脂酸鎂3g，羥丙基纖維素3g，於V型混合機中充分混合，用自動膠囊填充機製成膠囊500粒，鋁塑包裝，即得肌肉勻漿提取物凍乾粉的膠囊劑。可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
實施例7分別稱取實施例1得到的肌肉勻漿提取物凍乾粉3g，加入澱粉200g，置於快速制粒機中，加入2％羧甲基纖維素鈉水溶液25ml，一步制粒法製成12目顆粒。顆粒於烘箱中60℃乾燥4h，以搖擺式顆粒機12目篩網整粒，按5g/袋分裝於鋁箔袋中，密封即得肌肉勻漿提取物的顆粒劑。可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
實施例8稱取實施例1得到的肌肉勻漿提取物凍乾粉，加入注射用水1000ml和0.2％的吐溫-80使溶解，加入0.1％活性炭，煮沸30min，放冷，濾除活性炭，灌裝至2ml安瓿中，熔封，熱壓蒸汽滅菌，即得肌肉勻漿提取物凍乾粉的注射劑。可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
實施例9 實施例1得到的肌肉勻漿提取物對小鼠側腦室下區神經幹細胞的增殖作用1方法小鼠隨機分為4組，溶媒對照組(人工腦脊液)、陽性對照組(rhFGF)、肌肉勻漿提取物低劑量組(2.5mg·mL-1)和肌肉勻漿提取物高劑量組(25mg·mL-1)。戊巴比妥鈉麻醉小鼠(40mg·kg-1)，固定於腦立體定位儀上，進行側腦室注射。坐標後囪前3mm，旁開1.5mm，進針1.5mm。雙側側腦室各注射5μl。單側注射時間5min，留針5min。手術7d後用4％多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，連續冠狀切片(5μm厚)，每4張取一張，每個標本取10張切片，按照常規方法分別做Nestin和Musashi免疫組化染色，每種抗體染5張切片。蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。
2結果2.1形態學觀察高劑量組側腦室下區(SVZ)可見陽性細胞較密集，細胞質染色呈深棕色，陰性細胞由於蘇木素染色而呈藍色。低劑量組室下區陽性細胞數較少。兩組的陽性細胞形態與陽性對照組類似。溶媒對照組基本無明顯陽性細胞，細胞均為藍色。側腦室室壁上細胞均呈深棕色，為免疫組化過程中切片邊緣未被洗掉的一抗造成的假陽性結果。
2.2形態計量學分析在光鏡下(×250)，每張切片隨機取側腦室下區3個視野進行細胞計數並計算該視野下陽性細胞出現率(陽性細胞/細胞總數)。應用SPSS數理統計軟體對各組數據進行方差分析及組內t檢驗，結果如表3表3 免疫組化染色後細胞陽性率(％)
**與溶媒對照組比較P＜0.01；Δ與陽性對照組比較P＜0.05與溶媒對照組比較，其餘3組均有顯著性差異。與陽性對照組比較，高劑量組P＞0.05；低劑量組則P＜0.05，說明兩組間差異有統計學意義，低劑量組效果不及陽性對照組和高劑量組。Nestin和Musashi染色結果基本一致。
可用於治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病。
權利要求
1.一種肌肉勻漿提取物的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液溶解經粉碎的肌肉，離心取上清液；(2)濾膜除菌後，離心分離，取上清液；(3)通過超濾膜取下層液；(4)葡萄糖凝膠層析，得到的層析洗脫液經濾膜除菌；(5)過超濾膜，得到肌肉勻漿提取物。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於肌肉與生理鹽水或磷酸鹽緩衝液的重量克∶體積毫升比為1∶5～10，採用3-300KD的超濾膜，所述濾膜孔徑為0.22μm。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述離心分離的轉速為3000-7000轉/分，溫度為1-4℃。
4.一種肌肉勻漿提取物，其特徵在於是由權利要求1或2或3所述的方法製備而成。
5.權利要求4所述肌肉勻漿提取物在製備用於治療神經退行性疾病的藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的神經退行性疾病為阿爾茨海默病。
7.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的神經退行性疾病為帕金森病。
8.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的神經退行性疾病為pick病。
全文摘要
本發明涉及一類肌肉勻漿提取物及其製備方法與應用。所述肌肉勻漿提取物的製備方法包括用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液溶解經粉碎的肌肉，離心取上清液；濾膜除菌後，離心分離，取上清液；通過超濾膜取下層液；葡萄糖凝膠層析，得到的層析洗脫液經濾膜除菌；過超濾膜，得到肌肉勻漿提取物。得到的肌肉勻漿提取物具有提高神經幹細胞活性，促進其增殖，補充減少的神經元的作用，可用於製備治療與延緩阿爾茨海默病等神經退行性疾病的藥物。
文檔編號A61K35/34GK1686171SQ20051003396
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月7日 優先權日2005年4月7日
發明者羅煥敏, 肖飛, 肖美玲, 王成蹊 申請人:暨南大學