一組特異識別β-銀環蛇毒素的核酸適配體及用途
2023-05-06 08:43:31 1
一組特異識別β-銀環蛇毒素的核酸適配體及用途
【專利摘要】本發明提供了一組特異性識別β-銀環蛇毒素的核酸適配體及用途。本發明提供的核酸適配體，是序列表中的SEQ?ID?NO.1～4所示的任一單鏈DNA序列，所述核酸適配體和β-銀環蛇毒素具有較高的親和力和特異性，在β-銀環蛇毒素的檢測和銀環蛇咬傷的診斷中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—組特異識別β-銀環蛇毒素的核酸適配體及用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物毒素【技術領域】，具體是指利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)製備一組與銀環蛇毒素高特異性結合的核酸適配體，為該核酸適配體在β-銀環蛇毒素的檢測和銀環蛇咬傷的診斷中提供科學依據和理論基礎。
【背景技術】
[0002]β -銀環蛇毒素來源於銀環蛇(Bungarus multicinctus)蛇毒中，是一種突觸前多肽神經毒，表現出Ca2+依賴性磷脂酶A2 (Phospholipase A2, PLA2)活性，是銀環蛇毒的最主要的毒性成分，LD50 (1.p.小鼠)為0.019 μ g/g。分子量(Mr)為20500，由兩條鏈所構成，即A鏈和B鏈，並通過一對鏈間二硫鍵連接起來。分子量較大的A鏈(Mr=13500)含120個胺基酸，具有13個半胱氨酸，其一級結構十分類似於從蛇毒和哺乳動物胰腺中鑑定的PLA2,具有比較弱的活性。分子量較小的B鏈(Mr=7000)由60個胺基酸組成，與蛋白激酶抑制物有一些序列同源性，作為β -銀環蛇毒素對特定靶向細胞膜的識別亞基，在神經-肌肉接頭突觸前膜中的一些成分間相互作用上有著重要功能。當亞基間二硫鍵斷裂時，或PLA2活性中心被共價修飾時，都可導致β -銀環蛇毒素的神經毒性和PLA2活性的喪失。
[0003]蛇咬傷是熱帶、亞熱帶農村地區一個影響健康的重要問題，每年僅在亞洲，由蛇咬傷致死的人數就達5萬人。銀環蛇咬傷在我國佔各類毒蛇咬傷的8.12%，居第5位，而死亡人數居首位。目前我國還沒有一種快速、有效的蛇傷臨床診斷試劑和方法，蛇傷診斷主要依靠病史和臨床表現。由於被不同種類的毒蛇咬傷具有相似的症狀，在病史不詳的情況下，臨床醫生很難從患者的臨床表現來判斷倒底是被哪種毒蛇咬傷。
[0004]在蛇毒的實驗室鑑定技術中，免疫檢測是其中最主要的技術手段。現有的免疫診斷技術大多是利用多克隆抗體檢測毒素，由於不同蛇毒多抗之間存在交叉反應，因此特異性較差。製備單個蛇毒成分的單克隆抗體可以大大提高檢測的特異性，但單抗本身也存在一些缺陷。單抗相對於多抗的親和力要弱，對酶標板的吸附性不夠好，同時在進行酶或生物素標記的操作中穩定性也較差。
[0005]核酸適配體是能夠與祀分子特異性結合的寡核苷酸序列(RNA或ssDNA)。1990年，Gold和Ellington兩個研究小組幾乎同時建立了一種製備特異性寡核苷酸分子的技術，並把該技術定義為 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指數富集式配體系統進化)，可製備具有一定三維結構、能與靶分子通過立體構象之間的適應性互補(並非鹼基配對)而高特異性、高親和力結合的寡核苷酸分子-適配體(aptamer)。SELEX技術的出現源於人們對核酸與蛋白相互作用研究的深入。單鏈核酸能通過鏈內某些互補鹼基間的配對、靜電作用、氫鍵作用等形成一些穩定的三維空間結構，如發卡(hairpin)、假結(pseudoknot)、凸環(stem loop)、G-四分體(G-quartet)等。通過這些結構，單鏈核酸能夠與蛋白質或其他分子形成具有高特異性結合力的穩定複合物。單鏈核酸還可以通過範德華力、氫鍵作用、靜電作用和形狀匹配等各種相互作用與靶分子產生高特異性的結合力。與抗體一樣，核酸適配體與靶標結合同樣具有高親和力和特異性，因此，核酸適配體亦被稱為「化學抗體」。
[0006]由於核酸適配體只是一段小的單鏈DNA或RNA，相對於抗體具有很多天然的優勢。例如，核酸適體易於合成及能應用常規的化學方法進行修飾、長期的穩定性(如能長期維持可逆的變性和復性)、無毒性或免疫原性。從工程學的角度來看，與體內生物抗體產生過程不同，體外核酸適體的化學合成批次間的差異很小。所有這些因素都促進了核酸適配體廣泛地應用於醫學與生命科學等領域的研究和疾病的診斷與治療中。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種能夠與β -銀環蛇毒素特異性結合的核酸適配體。
[0008]本發明的另一個目的在於提供上述核酸適配體在銀環蛇毒素和銀環蛇咬傷的檢測中的應用。
[0009]所述特異性結合β-銀環蛇毒素的適配體及其片段，選自SEQ ID Ν0.1~4所示的序列中的一個或者多個，在結構上均符合下述通式所示的結構特徵，5' -AGC AGC ACA GAGGTC AGA TG - Nx-CCT ATG CGT GCT ACC GTG ΑΑ-3'(通式 I)。通式中 N 代表鹼基 A、G、C、T中的任一個，Nx代表隨機片段長度為40、39或51個鹼基。上述序列均以單鏈形式存在。
[0010]SEQ ID N0.1~4所示的序列，可以進行修飾或改造，得到所述核酸適配體的衍生物。所述的修飾或改造方式選自以下方式中的一種或幾種:
[0011]I)將所述核酸 適配體刪除部分或增加部分核苷酸，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0012]2)將所述核酸適配體進行全硫化、端基封閉或PEG修飾，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0013]3)將所述核酸適配體連接或標記其它功能基團或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、螢光素、生物素、毒素或酶等，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0014]所述β -銀環蛇毒素核酸適配體的篩選方法是將指數富集配體系統進化技術(SPSELEX篩選)應用於β -銀環蛇毒素核酸適配體的篩選，所述SELEX篩選的具體步驟包括:
[0015]I)合成用於篩選β -銀環蛇毒素核酸適配體的隨機單鏈DNA文庫，並設計合成相應的引物；
[0016]2)將β -銀環蛇毒素包被於96孔酶標板，並與所述隨機單鏈DNA文庫孵育，分離和β -銀環蛇毒素結合的DNA ；
[0017]3)將分離的DNA進行PCR擴增，擴增產物用λ核酸外切酶酶切，得到次一級單鏈DNA庫，並用於下一輪SELEX篩選，直至獲得相應的核酸適配體。
[0018]在步驟I)中，所述隨機單鏈DNA文庫的兩端為20個鹼基的固定序列，中間為40個鹼基的隨機序列，即:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N40-CCT ATG CGT GCT ACC GTGkk-3'。
[0019]在步驟I)中，所述引物為:
[0020]引物1:5'-螢光素-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3'；
[0021]引物2:5/ -磷酸基團-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3'；[0022]引物3:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3/ ；
[0023]引物4:5' -TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3/。
[0024]和現有抗體技術相比，本發明的優點在於:篩選所獲得的核酸適配體相對於傳統抗體，具有更簡便的篩選條件，無毒性，分子量小，易於化學修飾和標記，合成成本較抗體製備低、周期短。本發明提供的核酸適配體和銀環蛇毒素的結合親和力高，Kd值達到ηΜ級，並且只特異性識別銀環蛇毒素和含有銀環蛇毒素的銀環蛇毒，對其它同源毒素或蛇毒，如α-銀環蛇毒素、金環蛇毒、五步蛇毒、蝰蛇毒、眼鏡蛇毒等沒有識別功能。上述優點使所述核酸適配體成為β-銀環蛇毒素檢測和銀環蛇咬傷診斷的有力工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1.第 I 輪篩選的 pilot PCR0 1:20bp DNA ladder ;2_9:12-26 個循環的 PCR 產物。
[0026]圖2.Mfold軟體預測的適配體β B-1、β Β_19、β Β-32和β Β-20的二級結構。
[0027]圖3.SELEX篩選每一輪單鏈DNA庫和β -銀環蛇毒素的結合率。
[0028]圖4.螢光各向異性法測定適配體β Β-1、β Β-20和β -銀環蛇毒素結合的解離常數Kd值。
[0029]圖5.硝化纖維膜過濾法測定適配體β B-1和銀環蛇毒、金環蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼鏡蛇毒和蝰蛇毒的結合率。1:銀環蛇毒；2:金環蛇毒；3:尖吻蝮蛇毒；4:蝰蛇毒；5:眼鏡蛇毒。
[0030]圖6.用適配體β B-1通過ELISA方法鑑定銀環蛇毒和`β -銀環蛇毒素。1.β -銀環蛇毒素；2.BSA ；3.酪蛋白；4.α -銀環蛇毒素；5.銀環蛇毒；6.眼鏡蛇毒；7.金環蛇毒；
8.尖吻蝮蛇毒；9.蝰蛇毒；10.對照。
【具體實施方式】
[0031]以下實施例用於闡述說明本發明，但不應理解為對本發明保護範圍的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0032]實施例1特異性結合β -銀環蛇毒素的核酸適配體的篩選
[0033]1.構建隨機單鏈DNA文庫及引物:設計兩端為20個鹼基的固定序列，中間為40個鹼基隨機序列的隨機單鏈DNA文庫，即:5' -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N40-CCT ATGCGT GCT ACC GTG ΑΑ-3'。其中N代表鹼基A、G、C、T中的任一個，MO代表隨機片段長度為 40 個鹼基。引物 1:5'-螢光素-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3'，引物 2:5' -TTCACG GTA GCA CGC ATA GG-磷酸基團-3'。文庫及引物均由上海生工生物技術有限公司合成。將隨機文庫用結合緩衝液(20mM HEPES, pH7.4;150mM NaCl; 5mM KCl; 2mM MgCl2 ;2mMCaCl2)、引物用ddH20配製成100 μ M貯存液-20°C貯存備用。
[0034]2.SELEX篩選:將β -銀環蛇毒素用碳酸鹽緩衝液(CBS，pH9.6)配製成10 μ g/mL濃度，取100 μ L包被96孔板，4°C過夜。倒掉上清，加入100 μ L結合緩衝液(含lmg/mL BSA，從第5輪起封閉時用lmg/mL酪蛋白替換BSA)封閉2h。倒掉上清，用200 μ L結合緩衝液(含0.05%tween20)清洗6次。ssDNA文庫(溶於結合緩衝液，含0.05%tween20)置於PCR儀中，90°C lOmin，取出後迅速置於冰上lOmin，然後置於室溫lOmin。取100 μ L加入到96孔板中，室溫孵育lh。ssDNA文庫的濃度從第I輪的10 μ M逐漸減少到第10輪的0.03 μ Μ。倒掉上清，用200 μ L結合緩衝液(含0.05%tween20)清洗6次，然後用ddH20洗3次，最後加入IOOyL ddH20，置於95°C，10min，取出上清洗脫液，作為模板進行PCR反應。
[0035]每一輪篩選的過程中，先取少量洗脫液進行pilot PCR確定擴增的最佳循環數。PCR反應體系為:50 μ L Premix Taq solution (寶生物，大連)，4 μ L洗脫液，I μ LlO μ M引物 1，I μ LlO μ M 引物 2，44 μ L ddH20。PCR 反應條件為:94°C變性 5min ;94°C變性 0.5min，56°C退火0.5min，72°C延伸0.5min，26個循環；最後72°C延伸lOmin。從第12個循環起，每隔2個循環從PCR管中取出IOyL PCR產物。PCR完成後，將不同循環數的產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，分析電泳條帶，最佳循環數為不產生短鏈或長鏈副產物的最大循環數。確定最佳循環數後，在最佳循環數下進行PCR反應，反應體系和條件同上，共進行8管反應，總體積為800yL。PCR產物用λ核酸外切酶進行酶切，水解掉標記磷酸基團的反義鏈，得到標記螢光素的正義鏈。經乙醇沉澱純化後，獲得的ssDNA用於下一輪的SELEX篩選。
[0036]3.克隆和測序:經過10輪篩選，用不標記螢光素和磷酸基團的引物PCR擴增洗脫液，PCR產物連接到克隆載體PMD19-T，克隆送上海生工生物技術有限公司進行測序，獲得4條適配體序列。結果如SEQ ID N0.1~4所示，分別命名為β B-1、β Β-19、β Β-32和βΒ-20。用Mfold軟體(httD://mfold.rit.albany.edu)對適配體的二級結構進行預測，4條適配體的二級結構如圖1所示。每條適配子中的莖環結構和發卡結構可能是適配體和β-銀環蛇毒素的結合部位。
[0037]實施例2以消化纖維膜法測定每一輪核酸適配體庫和β -銀環蛇毒素的結合力
[0038]硝化纖維膜(HAWP02500nitrocellulosefilters, Millipore, 0.22 μ m)用
0.5MK0H溶液浸泡30min後，用ddH20充分清洗，然後用置於結合緩衝液中，搖動40min，置於新的結合緩衝液中，4°C保存。螢光素標記的各輪ssDNA庫配製成I μ M濃度，取10 μ L加入到ImL結合緩衝液中，置於90°C lOmin，然後置於冰上lOmin，室溫放置lOmin。加入Img/mL β -銀環蛇毒素4 μ L，室溫孵育lh，對照不加β -銀環蛇毒素，然後過濾膜，用ImL結合緩衝液衝洗濾膜。合併濾液，用Perkin Elmer LS55螢光分光光度計測定濾液的螢光強度。測定參數為:上樣量=2mL, excitation wavelength=492nm, emission waveIength=5I8nm,integration time=10sec, inlet and outlet slit width=10nm。對照的突光強度減去樣品的螢光強度則為結合到β_銀環蛇毒素上的ssDNA的螢光強度。結合的螢光強度與對照的螢光強度的比值即為每一輪核酸適配體庫和β -銀環蛇毒素的結合率。結果如圖2所示，可以看到，隨著篩選輪數的增加，適配體和銀環蛇毒素的結合率逐漸增加。至第10輪時結合率不再增加，表明適配體已經高度富集，篩選結束。
[0039]實施例3以螢光各向異性法測定核酸適配體的解離常數Kd值
[0040]人工合成螢光標記的適配體βΒ-1、β Β-19、β Β-32和β Β-20,分別取4 μ L適配體(ΙμΜ)加入到2mL結合緩衝液中，測定螢光各向異性值。然後用不同濃度的β -銀環蛇毒素進行滴定，測定每一個濃度下的螢光各向異性值。測定參數同實施例2。用β_銀環蛇毒素的濃度做為橫坐標，螢光各向異性值的增量作為縱坐標，用SigmaPlotl0.0軟體做非線性回歸，分析適配體的解離常數(Kd)值。
[0041]適配體βΒ-l和βΒ-20的Kd值均低於ΙΟΟηΜ，分別65.9ηΜ和83.8ηΜ，測定結果如圖3所示。β Β-19的Kd值為540 ηΜ，而β Β-32的Kd值為1200ηΜ。適配體β B-1和β Β-20與β-銀環蛇毒素具有更高的親和力，顯示其在β-銀環蛇毒素檢測中的應用價值。
[0042]實施例4以硝化纖維膜法鑑別不同蛇毒
[0043]銀環蛇毒、金環蛇毒、尖吻蝮蛇毒、蝰蛇毒和眼鏡蛇毒分別用結合緩衝液配製成10mg/mL濃度，12000rpm離心5min,取上清。取I μ M突光素標記的適配體β B-1或βΒ-206μ?，加入到ImL結合緩衝液中，置於90°C lOmin，然後置於冰上lOmin，室溫放置IOmin0然後分別加入各種蛇毒2 μ L，室溫孵育lh，對照不加蛇毒。過濾膜，並用ImL結合緩衝液衝洗濾膜。合併濾液，測定濾液的螢光強度。測定參數同實施例2。對照的螢光強度減去樣品的螢光強度則為結合到各種蛇毒上的適配體的螢光強度，結合的螢光強度與對照的螢光強度的比值即為核酸適配體和各種蛇毒的結合率。測定結果如圖4所示。適配體β B-1或β Β-20和銀環蛇毒的結合率均大於80%，而和金環蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼鏡蛇毒和蝰蛇毒的結合率均低於10%，表明適配體βΒ-l和βΒ-20隻特異性的識別銀環蛇毒。因此，利用SELEX技術篩選的和β-銀環蛇毒素高親和力、高特異性結合的適配體在蛇咬傷的診斷中有非常廣泛的應用前景。
[0044]實施例5用ELISA方法鑑定蛇毒和相關蛋白
[0045]合成5'端標記生物素的適配體βΒ-1。銀環蛇毒素、BSA、酪蛋白、α-銀環蛇毒素、銀環蛇毒、眼鏡蛇毒、金環蛇毒、尖吻蝮蛇毒和蝰蛇毒用CBS緩衝液(ρΗ9.6)各自配製成10 μ g/mL,分別取100 μ L包被ELISA板，4°C過夜。棄上清，ELISA板用200 μ L清洗緩衝液(結合緩衝液+0.05%tween20)清洗3次，加入100 μ Llmg/mL BSA封閉，室溫，2h。棄上清，ELISA板用200 μ L清洗緩衝液清洗3次，加入100 μ L生物素標記的β B-1 (濃度ΙΟρΜ，溶於結合緩衝液)，室溫結合40min。棄上清，ELISA板用200 μ L清洗緩衝液清洗3次，加入100 μ L1: 1000稀釋的過氧化物酶標記親和素(用結合緩衝液稀釋)，室溫,40min。棄上清，ELISA板用200 μ L清洗緩衝液清洗3次，加入100 μ L新鮮配製的底物(PD溶液，室溫避光反應15min，最後加入50 μ L2M H2SO4終止反應，觀察每孔的顏色變化。對照包被β _銀環蛇毒素，但不加入適配體。結果如圖6所示。β-銀環蛇毒素和銀環蛇毒孔顏色為棕褐色，其中β-銀環蛇毒素孔顏色更深，而其它蛋白和蛇毒孔顏色和對照基本相同，沒有發生明顯的顏色變化。不需要儀器判讀，僅從各孔的顏色上就可以明顯的從相關蛋白中鑑定出β_銀環蛇毒素，從各種蛇毒中鑑定出銀環蛇`毒。
[0046]
【權利要求】
1.特異性結合β-銀環蛇毒素的核酸適配體，其選自SEQID Ν0.1~4所示的序列中的一個或者多個，分別命名為βΒ-1、βΒ-19、βΒ-32和βΒ_20，其序列如下:
βΒ-l:
agcagcacag aggtcagatg gttttcccct tgtcgctttt ggttcgttct gcctctatct 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa80
βΒ-19:
agcagcacag aggtcagatg tttggtgtgg atcctgaaca tttatattct ttcgtttttt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa80
βB-32:
agcagcacag aggtcagatg gcaatgcacc tttgtctctt atagtttatt ttttgccttc 60
ctatgcgtgc taccgtgaa79
βB-20:
agcagcacag aggtcagatg attagtcatg tttgtttgtc tggctttttg ggtttgtgca 60
gtattatgaa ccctatgcgt gctaccgtga a91
2.權利要求1所述適配體在β-銀環蛇毒素檢測中的用途。
3.權利要求1所述適配體在蛇咬傷診斷中的用途。`
4.特異性結合銀環蛇毒素的核酸適配體，包括對權利要求1所述適配體刪除或增加部分核苷酸，並與權利要求1所述適配體具有相同功能的適配體。
5.特異性結合銀環蛇毒素的核酸適配體，包括對權利要求1所述適配體連接或標記其它功能基團或分子的適配體，並與權利要求1所述適配體具有相同功能的適配體，所述其它功能基團或分子選自:巰基、氨基、放射性同位素、螢光素、生物素、毒素或酶酶標記。
6.權利要求1所述適配體，其被能夠增強其半衰期、提高其穩定性、防止核酸內切酶或者外切酶切割的化合物所修飾。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820458SQ201410116477
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】葉鋒平, 鄭穎, 範泉水, 王熙, 米其利, 郭平, 餘靜, 王傑, 張志曉, 馮子良 申請人:中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心