一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法
2023-05-06 08:53:26 1
專利名稱：：一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法
技術領域：
：本發明涉及脫氧胸苷三磷酸
技術領域：
，具體地說，是一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法。
背景技術：
：DNA分子是由四種脫氧核糖核苷酸分子結合成的兩條互補多聚核苷酸鏈。合成這些多聚核苷酸的前體是四種脫氧核苷三磷酸，脫氧胸苷三磷酸作為四種原料之一參與核酸分子的體內或體外擴增。隨著生物技術工業的發展特別是DNA生物合成和聚合酶鏈式反應的推廣，市場上對DNA擴增所需要的脫氧核苷三磷酸的需求量將會明顯地持續升高。另外，由於脫氧胸苷三磷酸在抗病毒抗腫瘤，治療心血管疾病等方面應用的推廣，同樣也會對包括本發明所闡述的產品_脫氧胸苷三磷酸的需求量的提高起到促進作用。目前，商業化的脫氧胸苷三磷酸產品主要是由化學合成法實現的(Chambers"al.，1957;SmithandKhorana，1958);其中，脫氧胸苷三磷酸的合成方法包括使用脫氧胸苷單磷酸的三正丁基銨鹽與正磷酸在二環己基碳二亞胺的存在下，在吡啶或二甲基甲醯胺水溶液中進行反應。脫氧胸苷單磷酸的轉化率為65%;而且在轉化過程中不可避免地會生成脫氧胸苷二磷酸和脫氧胸苷多磷酸等主要副產物。因此在後續的分離中，需要色譜分離方法實現脫氧胸苷單磷酸與脫氧胸苷二磷酸和脫氧胸苷三磷酸的分離。提純過程還需要除去未反應的二環己基碳二亞胺(DCC)和正磷酸、副產物脫氧胸苷單磷酸、二磷酸和多磷酸以及還原後的DCC、吡啶或DMF溶齊U。在化學轉化法所用溶劑屬於美國環境保護署列出的有毒化學品。中國專利申請號00100844中公開了一種通過酶催化和化學反應聯合生產脫氧核苷三磷酸的方法；該方法以天然DNA為起始原料，DNA經酶解後，脫氧核苷單磷酸經"脫氧核苷單磷酸酶的催化"反應和相應的化學反應後轉化為包括脫氧胸苷三磷酸產品在內的四種脫氧核苷三磷酸；在該方法中，發明者沒有對這種"脫氧核苷單磷酸酶"進行具體描述；這種酶的名字也沒有被NC-IUBMB(國際生物化學和分子生物學聯合命名委員會http:〃w麗.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收錄和接受，其中的化學法就是上文中所提到的方法。中國專利申請號02134612公開了一種三磷酸脫氧核苷的生產方法；該方法是將核苷酸還原酶EC1.17.4.2和要轉化的底物腺苷三磷酸或鳥苷三磷酸或胸苷三磷酸或胸苷三磷酸加入到反應系統中，使酶的濃度達0.010.16單位/ml，使底物濃度達到160mmol/L，並加入以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶，以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質還原劑，以緩衝液控制溶液pH69，於25°C4(TC反應；在該過程中必須使用維生素B-12作為輔酶，以NADH或蛋白作為還原劑。工藝路線與本專利不同。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種通過生物技術合成脫氧胸苷三3磷酸的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的—種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，具體步驟為(a)脫氧胸苷酸激酶的克隆，表達和純化；脫氧胸苷酸激酶的克隆是指包含了釀酒酵母的培養，基因組DNA的提取，利用PCR技術從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內的完整的脫氧胸苷單磷酸激酶的基因CDC8，然後利用粘性末端連接法，進行重組質粒pET-17b/CDC8的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，並成功地進行高效表達；脫氧胸苷酸激酶的表達和純化是指利用23mg/ml的細菌溶菌酶加表面活性劑(如0.5^Tween20和0.5X的P450)或超聲波破碎細胞，然後使用蛋白分子量截留為3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化；(b)丙酮酸激酶的克隆，表達和純化；丙酮酸激酶的克隆是指自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基因BYK，重組質粒pET-28a/byk的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，並成功地進行高效表達；丙酮酸激酶的表達和純化是指利用溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞，使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化；(c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游離的脫氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧胸苷單磷酸合成脫氧胸苷三磷酸；本步驟包括以脫氧胸苷單磷酸為原料進行的脫氧胸苷三磷酸的生物催化合成；該過程由兩步耦合的磷酸化反應經生成中間產物脫氧胸苷二磷酸實現，其中用到原料為可溶性的脫氧胸苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶，如附圖1所示，在第一步中，使用脫氧腺苷三磷酸為磷酸供體，而在第二步反應中，磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸；第一步反應在可溶性脫氧胸苷單磷酸激酶的作用下一摩爾的脫氧胸苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸轉變為一摩爾的脫氧胸苷二磷酸和脫氧腺苷二磷酸；第二步反應中，一摩爾的脫氧胸苷二磷酸和脫氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化，脫氧胸苷二磷酸和脫氧腺苷二磷酸同時被轉化為脫氧胸苷三磷酸和脫氧腺苷三磷酸，生成的脫氧腺苷三磷酸產物又可以重新作為第一步反應的磷酸供體再次參與反應；另外，在兩步反應中，總計一摩爾的脫氧胸苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸以及兩摩爾的磷酸烯醇式丙酮酸被轉化為一摩爾的脫氧胸苷三磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸以及兩摩爾的丙酮酸，而生成的脫氧腺苷三磷酸可以再次被用做第一步反應所需要的磷酸供體，因此本反應體系的第一步反應中只需要添加極為微量的脫氧腺苷三磷酸即可滿足反應所需。與現有技術相比，本發明的積極效果是(1)目前，傳統的化學法既有可能破壞環境，又因為反應過程、純化過程的低產率而不經濟。雖然產品相同，但本發明描述的酶促工藝與化學法工藝截然不同過程簡單，轉化率高，環境友好，避免使用有毒和有腐蝕性的物質，如DCC、吡啶、DMF等。(2)本發明採用兩種很容易確認的酶，脫氧胸苷單磷酸激酶(EC2.7.4.9)和丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)，而且這兩種酶製劑可以利用工程菌自行生產，表達量高，純化簡單，生產成本較低。使用過程中，可根據需要對酶用量、酶純度等進行實時控制和調節。(3)本發明使用兩種工程菌生產的激酶，包括脫氧胸苷單磷酸激酶(EC2.7.4.9)和丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)，這兩種酶的催化反應不需要額外地添加輔酶。而現有技術使用一種酶核苷酸還原酶(EC1.17.4.2)，需要維生素B12作為酶促反應的輔酶，(4)本發明不使用還原劑。現有所述的方法必須使用含巰基還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖醇(DTE)或二氫硫辛酸或巰基乙醇，本發明中不需要添加任何還原劑，成份更加簡潔；(5)本發明所建立的催化體系中，調節兩種酶製劑的用量可以保持反應流的正向進行，使脫氧胸苷單磷酸底物完全轉化為脫氧胸苷三磷酸產物，產物的分離和純化將更加簡單；(6)本發明的原材料為脫氧胸苷單磷酸這一單一化合物；(7)本發明的終產物是單獨封裝的脫氧胸苷三磷酸產物，然後可以按照需求進行分裝或者和其它三種脫氧核苷三磷酸產品進行混合；(8)本發明中反應在水相中進行，原料溶解度大，可以獲得高濃度的產品。圖1脫氧胸苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶催化下由脫氧胸苷單磷酸生物合成脫氧胸苷三磷酸；圖2HPLC檢測14小時後脫氧胸苷單磷酸向脫氧胸苷三磷酸的全轉化圖。具體實施方式以下提供本發明一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法的具體實施方式。實施例1(a)脫氧胸苷單磷酸激酶的克隆，表達和純化利用PCR技術，以釀酒酵母基因組DNA為模板，擴增獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內的完整的脫氧胸苷單磷酸激酶的基因GUKl，然後利用粘性末端連接法，插入pET-17b的多克隆位點內，構建重組質粒pET-17b/G區l，並將該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序進行高效表達；脫氧胸苷單磷酸激酶製劑製備的基本培養基組成為0.5%的酵母提取物，1.0%蛋白腖和1.OX的氯化鈉，其餘的液體為水，用5mol/L的NaOH溶液調節培養基的pH值至7.0，12rC保溫20分鐘滅菌。滅菌後以lX接種量接種，37t:條件下，充分攪拌培養至0D600為0.50.6，加入終濃度為0.5mM的誘導劑IPTG，37"下攪拌誘導4小時。在4"下，10000g離心5min收集細胞，用pH值為59的緩衝液洗滌，緩衝液為三羥甲基氨基甲烷_鹽酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸。離心收集洗滌後的細胞，用pH值為59的裂解緩衝液裂解細胞，裂解液為三羥甲基氨基甲烷_鹽酸，氯化鉀，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐溫-20和P-40以及PMSF，離心後獲得提取液，該提取液可以不經純化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶，還可以通過色譜柱進行進一步的純化；表1由BL21(DE3)細胞產生的脫氧胞苷單磷酸激酶的活性tableseeoriginaldocumentpage6(b)丙酮酸激酶的克隆，表達和純化利用PCR技術，以枯草桿菌基因組DNA為模板，擴增獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內完整的丙酮酸激酶的基因BYK，然後利用粘性末端連接法，插入pET-28a的多克隆位點內，構建重組質粒pET-28a/bykl，並將該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序進行高效表達；丙酮酸激酶製劑製備的基本培養基組成為0.5%的酵母提取物，1.0%蛋白腖和1.0%的氯化鈉，其餘的液體為水，用5mo1/1的NaOH調節培養基pH值至7.0，12rC保溫20分鐘滅菌。滅菌後以1%接種量接種，371:條件下，充分攪拌培養至0D600為0.60.9，加入終濃度為0.35mM的誘導劑IPTG，25t:下攪拌誘導6小時。在4"下，10000g離心5min收集細胞，用pH值為59的緩衝液洗滌，緩衝液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸。離心收集洗滌後的細胞，用pH值為59的裂解緩衝液裂解細胞，裂解液為三羥甲基氨基甲烷_鹽酸，氯化鉀，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐溫-20和P-40以及PMSF，離心後獲得提取液，該提取液可以不經純化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶，還可以通過色譜柱進行進一步的純化；表2由BL21(DE3)細胞產生的丙酮酸激酶的活性tableseeoriginaldocumentpage6(c)在可溶性脫氧胸苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶的作用下將脫氧胸苷單磷酸完全轉化為脫氧胸苷三磷酸生產脫氧胸苷三磷酸的過程在3(TC下進行，緩衝液由pH8.0的50mMTris，lOOmM的氯化鉀和50mM的氯化鎂組成。可溶性脫氧胸苷單磷酸激酶活力為4.6U/ml，可溶性丙酮酸激酶的活力為14.5U/ml。脫氧胸苷單磷酸濃度為25mM，磷酸烯醇式丙酮酸的濃度為50mM，脫氧腺苷三磷酸濃度為1.OmM。脫氧胸苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶皆由自主克隆相應基因的工程菌提取。反應過程pH的控制通過滴加5mol/l的NaOH溶液實現，脫氧胸苷三磷酸的生成速率為0.0283mM/min，在大約14小時以後96%左右的脫氧胸苷單磷酸基本可以完全轉化為脫氧胸苷三磷酸，如附圖2所示。需要特別說明的是本反應中酶的用量、底物濃度和其它試劑的用量以及反應器的大小可根據過程要求，如產量和生產率而改變。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍內。權利要求一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，具體步驟為(a)脫氧胸苷酸激酶的克隆，表達和純化；(b)丙酮酸激酶的克隆，表達和純化；(c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸和游離的脫氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧胸苷單磷酸合成脫氧胸苷三磷酸；包括以脫氧胸苷單磷酸為原料進行的脫氧胸苷三磷酸的生物催化合成；該過程由兩步耦合的磷酸化反應經生成中間產物脫氧胸苷二磷酸實現，其中用到原料為可溶性的脫氧胸苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶，在第一步中，使用脫氧腺苷三磷酸為磷酸供體，而在第二步反應中，磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸。2.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(a)中，所述的脫氧胸苷酸激酶的克隆是指包含了釀酒酵母的培養，基因組DNA的提取，利用PCR技術從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內的完整的脫氧胸苷單磷酸激酶的基因CDC8，然後利用粘性末端連接法，進行重組質粒pET-17b/CDC8的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，並成功地進行高效表達。3.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(a)中，所述的脫氧胸苷酸激酶的表達和純化是指利用23mg/ml的細菌溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞，然後使用蛋白分子量截留為3，50014，000Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化。4.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(b)中，所述的丙酮酸激酶的克隆是指自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基因BYK，重組質粒pET-28a/byk的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，並成功地進行高效表達。5.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(b)中，所述的丙酮酸激酶的表達和純化是指利用溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞，使用蛋白分子截留量在3，50014，000Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化。6.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(c)中，所述的第一步反應是指在可溶性脫氧胸苷單磷酸激酶的作用下一摩爾的脫氧胸苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸轉變為一摩爾的脫氧胸苷二磷酸和一摩爾的腺苷二磷酸。7.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(c)中，所述的第二步反應是指一摩爾的脫氧胸苷二磷酸和一摩爾的脫氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化，脫氧胸苷二磷酸轉化為脫氧胸苷三磷酸同時脫氧腺苷二磷酸也同時被轉化為脫氧腺苷三磷酸，此時生成的脫氧腺苷三磷酸又可以再次作為第一步反應的磷酸供體，參與第一步反應。全文摘要本發明涉及一種通過生物技術合成脫氧胸苷三磷酸的方法，具體步驟為脫氧胸苷酸激酶的克隆，表達和純化；丙酮酸激酶的克隆，表達和純化；用激動劑脫氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游離的脫氧胸苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧胸苷單磷酸合成脫氧胸苷三磷酸；包括以脫氧胸苷單磷酸為原料進行的脫氧胸苷三磷酸的生物催化合成；該過程由兩步耦合的磷酸化反應經生成中間產物脫氧胸苷二磷酸實現。本發明的優點表達量高，純化簡單，生產成本較低；產物的分離和純化將更加簡單；可溶解很多的溶質，從而可以滿足不同的使用要求。文檔編號C12P19/30GK101705269SQ200910035990公開日2010年5月12日申請日期2009年10月15日優先權日2009年10月15日公開號200910035990.發明者俞宏峰,朱月珍,段梅莉,辛秀娟,陸雅臣,鮑傑申請人:江蘇華榮生物科技有限公司