硫酸軟骨素的提取方法
2023-05-06 16:41:36 3
硫酸軟骨素的提取方法
【專利摘要】本發明屬於生化藥劑【技術領域】，具體涉及一種硫酸軟骨素的提取方法。硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟：（1）軟骨和純水混合；（2）加入鹼性蛋白酶酶解反應；（3）加入角蛋白酶酶解反應；（4）過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，沉降；（5）將沉降液離心，取沉澱烘乾，得到硫酸軟骨素。本發明的有益效果在於，採用本發明的方法對硫酸軟骨素進行提取，相對於鹽法提取、鹼法提取，簡化了生產的工藝流程，相對於當前酶法提取多採用胰蛋白酶，大大縮短了工藝周期，提高了提取收率，簡化了生產的工藝流程。
【專利說明】硫酸軟骨素的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生化藥劑【技術領域】，具體涉及硫酸軟骨素的提取方法。
[0002]【背景技術】
硫酸軟骨素是軟骨素的硫酸酯，是一種酸性粘多糖，廣泛存在於動物的器官軟骨中，通常由哺乳動物的軟骨、臍帶、血管壁等組織中提取得到，易溶於水，不溶於乙醇和丙酮等有機溶劑。它可以清除體內血液中的脂質和脂蛋白，用於防治冠心病、心絞痛、心肌梗死、動脈粥樣硬化等，能有效促進細胞代謝，還具有緩和的抗凝血作用、抗炎效果，加速傷口癒合及抗腫瘤等。目前酸性硫酸軟骨素的提取方法主要有降解法和非降解法，非降解法僅用於非蛋白多糖的黏多糖一透明質酸，而降解法適用於包括透明質酸在內的所有酸性黏多糖，硫酸軟骨素的提取採用降解法，降解法又包括鹼提取法和蛋白酶提取法兩種，根據這些性質，硫酸軟骨素的提取方法有很多，歸納起來，主要有以下幾種:
(I)中性鹽法
先用10%的氯化鈣提取，氯仿-戊醇(I:4)除去蛋白質，2倍量乙醇沉澱，最後以LlO試劑精製，而以透析法 除雜質、氯化六氨合鈷純化，或一磷鎢酸純化，均可使工藝簡化，以30%氯化鉀或30%氯化鉀加1%碳酸鉀提取，高嶺土吸附除去雜蛋白，可提高產品收率。
[0003]該方法提取的產品顏色較白，各項指標符合國家標準，也不會造成環境汙染，但是產率較低，造成原材料的大量浪費，對經濟效益有一定的影響。
[0004](2)鹼提取法
濃鹼提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重後，加入骨質量1.5倍左右的15%的氫氧化鈉溶液，室溫下浸提12-16h，然後用鹽酸調節pH至2-5，雙層紗布過濾，留下濾液，將濾液調節pH到8左右，按骨質量的4%加入胰蛋白酶，於50°C左右的水解水解6h，用鹽酸調節pH至6，升高溫度到90°C左右，加入活性炭進行脫色反應，然後過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇進行沉澱分層4h，所得沉澱為硫酸軟骨素，在60°C下乾燥即得最終產品。
[0005]稀鹼提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重後，加入骨質量6倍左右的2%的氫氧化鈉溶液，60°C下浸提24h，分兩次進行，然後用鹽酸調節pH至2-5，雙層紗布過濾，留下濾液，將濾液調節PH到8左右，按骨質量的4%加入胰蛋白酶，於50°C左右的水解7h，用鹽酸調節pH至5-7，升高溫度到80-90°C，加入活性炭進行脫色反應，然後過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇和1.4%的氯化鈉溶液進行沉澱分層6h，所得沉澱再次加入1.5%的氯化鈉溶液和3倍體積的無水乙醇進行沉澱，所得即為硫酸軟骨素，然後在60°C左右的溫度下乾燥即得最終產品。
[0006]稀鹼稀鹽提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重後，加入均為骨質量6倍的0.5%的氫氧化鈉和2%的氯化鈉混合溶液，室溫下進行浸提30h，分兩次進行，然後用鹽酸調節pH至8左右，加入骨質量4%的胰蛋白酶進行水解，水解後升溫90°C左右，加入骨質量1%的滑石粉，過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇進行沉澱，過濾後再加入1.5%的氯化鈉溶液進行沉澱過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇再次進行沉澱過濾，所得沉澱物於60°C下乾燥得最終產品O[0007]稀鹼濃鹽提取工藝:將粉碎好的軟骨碎片稱重後，加入骨質量5倍左右的0.2%的氫氧化鈉溶液和20%的氯化鈉溶液,pH為13，室溫下浸提30h，分兩次進行,然後用鹽酸調節pH至7，升溫80-90°C，加入骨質量4%的滑石粉，將鹽解液調節pH至2_3，過濾lh，將濾液加入1.5倍體積的水進行稀釋，同時調節pH到6，加入1.5倍體積的無水乙醇沉澱12h，將沉澱物加入1.5%的氯化鈉溶液中進行沉澱過濾，加入1.5倍體積的無水乙醇再次沉澱8h，所得沉澱物於60°C下乾燥即得最終產品。
[0008]以上四種工藝路線，製得的硫酸軟骨素含量和氨含量都符合原料藥的要求，但是這4種路線都存在如下的缺陷:採用稀鹼溫和條件下製備的樣品溶液混濁，且時間長，汙染嚴重基原因在於該條件下軟骨的膠原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性鹽和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去，最主要的是這些工藝的生產周期都太長，極大的限制了工廠的生產效益和經濟效益。
[0009](3)酶提取法
稀鹼-酶解提取法，鄒開朗等提出稀鹼與酶解相結合法生產硫酸軟骨素，先將軟骨在80°C水煮4-6h，然後按原料(幹質量)與2%氫氧化鈉的比例為1:6的量加入氫氧化鈉溶液，室溫提取1.5h然後用鹽酸調節pH到6左右，雙層紗布過濾，取濾液，合併2次濾液，並測量體積待用，濾液調節PH到8，按濾液與胰酶100:0.4的比例加入胰酶，於50°C左右水解Ih後，再按100:0.4的質量比加入胃蛋白酶，45°C下水解1.5h後過濾後加入高嶺土和活性炭吸附，該工藝用氯仿反萃取的方法純化硫酸軟骨素，與其它的方法相比較，縮短了一半工藝流程，同時提高了純度和提取率，又減輕了鹼法提取所帶來的環境汙染。
[0010]還有採用濃鹼-複合酸酶解提取的方法，該方法的實驗流程與稀鹼酶解法基本相同，只是在鹼解這一步增加了鹼的嘗試，該方法提高了產品的純度和收率，降低了生產成本。
[0011]複合酶解提取法，該方法質量穩定，產品顏色潔白，生產周期短。上述的方法其缺點是，在生產過程中引用了濃鹼，酸，該方法中酸鹼醇的消耗量都較大，反應條件比較強烈，而且成本也較高。
[0012]酶解-樹脂提取法，該方法的優點是酶水解或稀鹼水解與樹脂交換技術相結合，保證了硫酸軟骨素分子不降解，解決了成品純度的問題，該方法簡便，收率高，但是該方法的成本也較高，而且耗時較長。
[0013]從上述的方法來看，目前國內外常用鹼提與胰酶酶解相結合的方法來提取硫酸軟骨素，但此提取工藝中，胰蛋白酶的酶解反應至少需要5h，這是主要的限速環節，將該工藝用於規模化生產，不僅生產周期長，而且產品成本高。
[0014]因此需要針對上述的方法進行改進，尋找一種不僅易於規模化生產，而且生產周期短，產品成本低的硫酸軟骨素的提取方法。
【發明內容】
[0015]為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種易於規模化生產、生產周期短、產品成本低的硫酸軟骨素的提取方法。
[0016]本發明的硫酸軟骨素的提取方法是通過下述的技術方案來實現的:
硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟:(1)軟骨和純水以1:0.5-1:2的比例混合；
(2)按照佔軟骨重量0.40-0.60%的比例加入鹼性蛋白酶，於50-60°C，ρΗ9.0-10.0條件下酶解反應1.5-2.5h ；
(3)按照佔軟骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60°C，ρΗΙΟ.0-11.0條件下酶解反應2.5-3.5h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到60-70%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0017]優選的，上述的步驟(1)中，軟骨與純水的比例為:1:1。
[0018]上述的步驟(2)中，鹼性蛋白酶佔軟骨的重的0.5%，酶解反應的條件是:於55°C，pH9.5的條件下酶解反應2h。
[0019]上述的步驟(3)中，角蛋白酶佔軟骨重的0.5%，於55°C，pH10.5的條件下酶解反應3h。
[0020]上述的步驟(5)中，將沉降液離心的條件是,在6000rpm的轉速下,離心5min。
[0021]傳統酶提取方法是採用鹼性蛋白酶和胰蛋白酶相結合，共同作用於軟骨，提取硫酸軟骨素；本發明所提供的一種硫酸軟骨素提取方法，用角蛋白酶取代胰蛋白酶進行酶解，對比結果顯示在達到相同效果的前提下，角蛋白酶所需的酶解時間更短，該新提取方法不但能夠明顯縮短提取時間，還可以簡化提取工藝，降低生產成本，更適合工業規模化生產，具有良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但並不因此限制本發明。
[0023]實施例1
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨0.5%的比例加入鹼性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應2h ；
(3)按照與軟骨0.5%的比例加入角蛋白酶，55°C，ρΗΙΟ.5條件下酶解反應3h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0024]實施例1中，得到的硫酸軟骨素分析結果如下:
得到的硫酸軟骨素0.665mg/ml，收率13.3%，白色絮狀，易從容器壁刮下；
對比例I
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨1%的比例加入鹼性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應3h ；
(3)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(4)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0025]對比例2
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨1%的比例加入角蛋白酶，55°C，ρΗΙΟ.5條件下酶解反應3h ；
(3)過濾，取濾液， 向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；(4)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60 V烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0026]對比例I中，產品的純度為0.273mg/ml，收率為5.5% ；
對比例2中，產品的純度為0.308 mg/ml，粗品收率為6.2%。
[0027]對比例3
(1)軟骨和純水以1:1的比例混合；
(2)按照與軟骨0.5%的比例加入鹼性蛋白酶，55°C，pH9.5條件下酶解反應2h ；
(3)按照與軟骨0.5%的比例加入胰蛋白酶，55°C，pH7.0條件下酶解反應3h ；
(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih；
(5)將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0028]對比例3中，產品的純度為0.417 mg/ml，粗品收率為8.3%。
[0029]對比例4
A:軟骨和純水以1:1的比例混合；
按照與軟骨0.45%的比例加入鹼性蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應2h ；
按照與軟骨0.45%的比例加入胰蛋白酶，55°C，pH7.0條件下酶解反應3h ；
過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih ；
將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0030]B:軟骨和純水以1:1的比例混合；
按照與軟骨0.45%的比例加入鹼性蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應2h ；
按照與軟骨0.45%的比例加入角蛋白酶，55°C，pH9.2條件下酶解反應3h ；
過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到66%，沉降Ih ；
將沉降液離心，離心的條件是6000rpm、5min，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
[0031]1.A、B兩者的沉降效果對比:
【權利要求】
1.硫酸軟骨素的提取方法，包括下述的步驟: (1)軟骨和純水以1:0.5-1:2的重量比例混合； (2)按照佔軟骨重量0.40-0.60%的比例加入鹼性蛋白酶，於50-60°C，ρΗ9.0-10.0條件下酶解反應1.5-2.5h ； (3)按照佔軟骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60°C，ρΗΙΟ.0-11.0條件下酶解反應2.5-3.5h ；(4)過濾，取濾液，向濾液中加入乙醇溶液，使得乙醇終濃度達到60-70%，沉降Ih； (5)將步驟(4)中的沉降液離心，取沉澱，60°C烘乾，得到硫酸軟骨素。
2.如權利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特徵在於，所述的步驟(1)中，軟骨與純水的重量比例為:1:1。
3.如權利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中，鹼性蛋白酶佔軟骨的重量的0.5%，酶解反應的條件是:於55°C，pH9.5的條件下酶解反應2h。
4.如權利要求1所述的硫酸軟骨素提取方法，其特徵在於，所述的步驟(3)中，角蛋白酶佔軟骨重的0.5%，於55°C，ρΗΙΟ.5的條件下酶解反應3h。
5.如權利要求1 所述的硫酸軟骨素提取方法，其特徵在於，所述的步驟(5)中，將沉降液離心的條件是，在6000rpm的轉速下,離心5min。
【文檔編號】C08B37/08GK103641935SQ201310620429
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】楊雨, 趙穎娟, 宋迪, 薛秀梅 申請人:濟南天天香有限公司