心肌分化試劑盒及心肌細胞的培養方法與流程
2023-05-01 22:48:27
本發明涉及涉及生物醫學技術領域，具體而言，涉及一種心肌分化試劑盒及心肌細胞的培養方法。
背景技術：
日本學者中山申彌(Shinya Yamanaka)於2006年和2007年，首次通過導入四個轉錄因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分別成功將小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮膚成纖維細胞重編程為誘導多能幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，並因此獲得了2012年的諾貝爾醫學和生理學獎。hiPS細胞(人誘導多能幹細胞)具備hES細胞(人胚胎幹細胞)的所有分化能力，並且沒有倫理問題，在不久的將來會完全取代hES細胞，成為再生醫學的最主要細胞來源，為臨床應用帶來了新的曙光。
冠心病(Coronary Artery Disease,CAD)是僅次於高血壓的第二大心血管疾病，在全球範圍內的發病率和死亡率非常高，近幾年其發病率在我國也呈上升趨勢。目前冠心病的主要臨床治療方法如藥物治療、經皮冠狀動脈介入術(PCI)及冠狀動脈搭橋術(CABG)，都不能顯著恢復受損後的心臟功能。由於人心肌沒有再生能力，一旦由於心梗等原因受損死亡後，一旦超過臨界點，心臟會進入惡性代償的循環，最終不可逆的發展進入心衰。根據中國的流行病學調查，人群中的慢性心衰患病率為0.9％，至少有1000萬病人，總死亡率達32％。誘導多能幹(iPS)細胞因其易擴增，可定向分化為心肌細胞，且無免疫排斥反應和倫理學問題，提供了治療冠心病的新思路。最近的研究發現，移植人ES/iPS產生的心肌細胞後，心梗豬的心功能得到了顯著程度的改善，形態學和生理學結果都顯示移植的心肌整合進入宿主心臟並形成有效的收縮功能單元(Kawamura et al.,2012；Shiba et al.,2012)。
人心肌細胞與常用實驗動物的心肌細胞相比，存在較大生理學差異。例如，人心臟生理條件下每分鐘搏動60～90次，而小鼠為500～700次，大鼠為300～400次。而獲取與人心臟生理接近的大動物心肌細胞非常昂貴而且困難，收集到的細胞均一性差，難以得到穩定可靠的結果。ES/hiPS產生的心肌之前，幾乎不可能獲任何人源心肌細胞用於藥物開發，毒性測定和生理學研究。
因此，需要解決現有技術中因為心肌細胞無法長期培養和實現規模化量產，而無法用於藥物開發，毒性測定和生理學研的技術問題。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種心肌分化試劑盒及心肌細胞的培養方法，以解決現有技術中因為心肌細胞無法長期培養和實現規模化量產，而無法用於藥物開發，毒性測定和生理學研的技術問題。
為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種心肌分化試劑盒，該心肌分化試劑盒包括心肌分化基礎培養基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3；其中，心肌分化基礎培養基為含糖1640培養基，心肌分化添加劑1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1～3v％的B27。
進一步地，心肌分化試劑盒還包括心肌純化基礎培養基及心肌純化添加劑；其中，心肌純化基礎培養基為無糖1640培養基；心肌純化添加劑包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；優選心肌純化添加劑包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更優選，心肌純化添加劑包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。
進一步地，心肌分化添加劑1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1.5～2.5v％的B27；更優選，心肌分化添加劑1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括2v％的B27。
進一步地，心肌分化基礎培養基和心肌純化基礎培養基保存在4～8℃，心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3以及心肌純化添加劑分別置於-20～-80℃保存。
進一步地，心肌分化試劑盒在使用前還包括配製相應心肌分化培養基和心肌純化培養基的步驟，配製相應心肌分化培養基和心肌純化培養基的步驟包括：在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3及心肌純化添加劑；將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3；將心肌純化添加劑與心肌純化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌純化培養基。
為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種心肌細胞的培養方法，該培養方法包括以下步驟：將人多能幹細胞接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中；向培養皿中依次加入心肌分化培養基1培養2～4天，心肌分化培養基3培養1～2天，心肌分化培養基2培養2～3天，得到分化細胞；其中，心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3採用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎培養基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3配製而成。
進一步地，配製心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3的步驟包括：將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3。
進一步地，在得到分化細胞之後，培養方法還包括對分化細胞進行心肌細胞純化的步驟，優選對心肌細胞純化的步驟包括：去除心肌分化培養基2，然後向培養皿中加入心肌純化培養基，每隔一天換一次心肌純化培養基，純化3～4天，獲得純化後的心肌細胞；其中，心肌純化培養基採用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌純化基礎培養基及心肌純化添加劑配製而成。
進一步地，配製心肌純化培養基的步驟包括：將心肌純化添加劑與心肌純化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合形成心肌純化培養基。
進一步地，在獲得純化後的心肌細胞之後，培養方法還包括維持培養純化後的心肌細胞的步驟；優選維持培養純化後的心肌細胞的步驟包括：將純化後的心肌細胞接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中，並向培養皿中添加心肌分化培養基3，每隔2天換一次心肌分化培養基3，培養60～100天。
應用本發明的技術方案，本發明的試劑盒中心肌分化相關培養基、純化相關培養基成分明確，品質穩定；不含動物源成分，分化的心肌細胞均一性好，電生理穩定，可重複性高；可以達到人源心肌細胞穩定的獲得和維持，並且適用於包括藥物開發和安全性評價在內的各種需求，為心血管藥物開發和生理學研究奠定基礎。
附圖說明
構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
圖1A至圖1D示出了實驗一中實施例5的培養基分化人誘導多能幹細胞向心肌分化過程在不同階段的圖像；其中，圖1A是分化前(day0)的iPSC，圖1B是分化72h的細胞形態，圖1C是分化結束獲得的心肌細胞，圖1D是純化處理獲得的純度≧99％的心肌細胞。
圖2A至圖2B示出了實驗一中實施例5的心肌細胞特異性標記物染色結果；其中，圖2A中的左、中、右圖分別示出的是誘導出的心肌細胞所表達主要的心肌特異性收縮蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及兩者疊加之後的圖，圖2A顯示了心肌細胞非常規則的肌理結構。圖2B顯示了實施例5的試劑盒誘導的心肌細胞由心室肌樣細胞組成，其中，左圖顯示的是少量其他心肌細胞表達心房特異性輕鏈肌球蛋白MLC2a，中圖顯示的是心室肌樣細胞表達心室特異性輕鏈肌球蛋白MLC2v，右圖顯示的是兩者疊加後的圖。
圖3A和圖3B示出了實驗二中實施例5的心肌細胞分化效率和純度鑑定結果；其中，圖3A顯示實施例1～5及對比例1的心肌細胞分化效率比較結果；圖3B顯示心肌細胞NKX2.5啟動子調控下特異性的表達綠色螢光蛋白(GFP)，通過搏動和表達GFP的細胞比例可知，心肌細胞純度達99％以上。
圖4A及圖4B示出了實驗三中實施例5分化的心肌細胞轉染GFP質粒的轉染效率圖，轉染48h觀察，其中圖4A為白光下的圖像；圖4B為綠色螢光下的圖像，經統計，GFP螢光比率達到50～60％，表明所分化的心肌細胞的GFP轉染效率可達50～60％。
圖5A、圖5B及圖5C示出了實驗三中實施例5的試劑盒誘導分化的心肌細胞在接種後10～13天RTCA數據分析結果：其中，圖5A顯示心肌細胞質量均一穩定且具備正常人心肌細胞的搏動幅度與頻率；圖5B顯示心肌細胞在1.1μM異丙腎上腺素(Isoprenaline)的作用下心率顯著提高，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照；圖5C顯示心肌細胞在1.1μM胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率顯著降低，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。
圖6A和圖6B示出了實驗三中實施例5的試劑盒誘導分化的心肌細胞的膜片鉗電生理檢測結果，圖6A顯示誘導的心肌細胞具備典型的自發動作電位，圖6B顯示誘導的心肌細胞具備經典的自發離子通道。
具體實施方式
需要說明的是，在不衝突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。
如背景技術所提到的，現有技術中，心肌細胞因為無法長期培養和實現規模化量產，因而無法用於藥物開發，毒性測定和生理學研究。而動物自體分離的心肌細胞，不同批次差異較大，很不穩定，且電生理跟人差異極大，嚴重影響實驗進度和結果。
為改善現有技術中的上述技術問題，在本申請一種典型的實施方式中，提供了一種心肌分化試劑盒。該試劑盒包括心肌分化基礎培養基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2及心肌分化添加劑3；其中，心肌分化基礎培養基為含糖1640培養基；心肌分化添加劑1包括1～3v％的B27、8～12ng/ml的BMP4以及4～8μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1～3v％的B27以及4～6μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1～3v％的B27。
本申請的心肌分化試劑盒成分明確，品質穩定且分化效率高，細胞譜系廣，可以分化包括各種來源的人誘導多能幹細胞，胚胎幹細胞H9、HCN4等細胞。而且，分化的心肌細胞均一性好，電生理穩定，可重複性高；可以達到人源心肌細胞穩定的獲得和維持，並且適用於包括藥物開發和安全性評價在內的各種需求，為心血管藥物開發和生理學研究奠定基礎。
包含上述成分的心肌分化試劑盒已經能夠分化出品質穩定的心肌細胞，並且能夠滿足包括藥物開發和安全性評價在內的各種需求。為了進一步提高所分化的心肌細胞的純度，在本申請的一種優選的實施例中，上述心肌分化試劑盒還包括：心肌純化基礎培養基和心肌純化添加劑，其中，心肌純化基礎培養基為無糖1640培養基；心肌純化添加劑包括1～3v％的B27以及1～3mg/ml的乳糖；優選心肌純化添加劑包括1.5～2.5v％的B27以及1.5～2.5mg/ml的乳糖；更優選，心肌純化添加劑包括2v％的B27以及2mg/ml的乳糖。
上述優選實施例中，通過包括上述組分及其含量的心肌純化基礎培養基和心肌純化添加劑，使得本申請的心肌分化試劑盒除了具有分化心肌細胞、量產化心肌細胞的功能外，還具有對分化的心肌細胞進行純化的功能，使得心肌細胞的純度相對更純，品質更穩定，更適合用於藥物開發、毒性測定和生理學研究。
上述心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎培養基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3的成分及含量明確，誘導分化能力強，分化後的心肌細胞品質穩定。為了進一步優化上述心肌分化基礎培養基及添加劑的相應功能，在本申請一種優選的實施例中，上述心肌分化添加劑1包括心肌分化添加劑1包括1.5～2.5v％的B27、9～11ng/ml的BMP4以及5～7μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括1.5～2.5v％的B27以及4.5～5.5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括1.5～2.5v％的B27；更優選，心肌分化添加劑1包括2v％的B27、10ng/ml的BMP4以及6μM的CHIR99021；心肌分化添加劑2包括2v％的B27以及2 5μM的IWP2；心肌分化添加劑3包括2v％的B27。上述含量範圍的各成分組成的心肌分化試劑盒具有更高效的心肌細胞誘導分化能力，得到的心肌細胞的品質更穩定。
上述試劑盒中，根據成分種類的不同，可以選擇合適的保存方式以延長試劑盒中各種培養基成分的有效性，從而延長試劑盒的有效使用期。在本發明一種優選的實施例中，心肌分化基礎培養基和心肌純化基礎培養基保存在4～8℃，心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3以及心肌純化添加劑分別置於-20～-80℃保存。各心肌分化添加劑及心肌純化添加劑，在-20～-80℃保存可以保持性能穩定長達一年以上。
對於上述試劑盒的使用步驟，根據實際需要可以將各成分提前配製成母液或者現用現配。在本申請一種優選的實施例中，心肌分化試劑盒在使用前還包括配製相應心肌分化培養基和心肌純化培養基的步驟，配製相應心肌分化培養基和心肌純化培養基的步驟包括：在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2、心肌分化添加劑3及心肌純化添加劑；將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3；將心肌純化添加劑與心肌純化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌純化培養基。優選的，心肌分化培養基和心肌純化培養基在使用前0～14天配製，並在2～8℃保存。
在本申請另一種典型的實施方式中，還提供了一種心肌細胞的培養方法，該培養方法包括以下步驟：將人多能幹細胞接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中；向培養皿中依次加入心肌分化培養基1培養2～4天，心肌分化培養基3培養1～2天，心肌分化培養基2培養2～3天，得到分化細胞。上述依次加入是指：加入心肌分化培養基1培養2～4天，然後將心肌分化培養基1去除，換成心肌分化培養基3培養1～2天，再將心肌分化培養基3去除，換成心肌分化培養基2培養2～3天，得到上述分化細胞；其中，心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3採用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌分化基礎培養基、心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3配製而成。
採用上述培養基按照上述培養方法培養，能夠分化得到較多的心肌細胞，實現心肌細胞的量產，且得到的心肌細胞的品質性能穩定。
根據試劑盒成分保存方式的不同，在採用試劑盒中的成分進行心肌細胞培養時，可以採用不同的前處理步驟。比如，對已經化凍的心肌分化培養基的母液，直接按需求添入培養皿中即可。若試劑盒中各添加劑成分都是在-20℃～-80℃下保存，還需要先配置後續培養過程中使用的心肌分化培養基和心肌純化培養基。
在本申請一種優選的實施例中，上述配製心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3的步驟包括：將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2以及心肌分化添加劑3分別與心肌分化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合後形成心肌分化培養基1、心肌分化培養基2以及心肌分化培養基3。上述優選的實施例中，將各分化添加劑與分化基礎培養基以上述體積比進行混合形成相應的分化培養基，具有誘導心肌細胞分化效率高，品質穩定的效果。當上述各分化添加劑處於-20℃～-80℃的冷凍狀態時，配製上述各分化培養基之前，還需要先將各分化添加劑進行化凍，使各分化添加劑處於液體狀態。
為了獲得純度更高、品質更穩定的心肌細胞，在本申請另一種優選的實施例中，在得到分化細胞之後，培養方法還包括對分化細胞進行心肌細胞純化的步驟，優選心肌細胞純化的步驟包括：去除心肌分化培養基2，然後向培養皿中加入心肌純化培養基，每隔一天換一次心肌純化培養基，純化3～4天，獲得純化後的心肌細胞；其中，心肌純化培養基採用上述任一種心肌分化試劑盒中的心肌純化基礎培養基及心肌純化添加劑配製而成。
在本申請一種優選的實施例中，上述配製心肌純化培養基的步驟包括：將心肌純化添加劑與心肌純化基礎培養基以1:40～60，優選1:50的體積比混合形成心肌純化培養基。而將心肌純化添加劑與心肌純化基礎培養基以上述體積比進行混合形成的純化培養基，對心肌細胞的純化效率高，純化得到的心肌細胞的品質性能穩定。當然，若上述心肌純化添加劑處於-20℃～-80℃的冷凍狀態時，配製上述純化培養基之前，還需要先將純化添加劑進行化凍成液體狀態才能配製。
在得到上述純化後的心肌細胞之後，根據研究目的和對心肌細胞的使用時間的不同，可以選擇直接對心肌細胞進行試驗或研究，或者持續培養以適應階段性的研究需求。在本申請一種優選的實施例中，在獲得純化後的心肌細胞之後，培養方法還包括維持培養純化後的心肌細胞的步驟；優選維持培養純化後的心肌細胞的步驟包括：將純化後的心肌細胞接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中，並向培養皿中添加心肌分化培養基3，每隔2天換一次心肌分化培養基3，培養60～100天。
下面將結合實施例進一步說明本發明的有益效果。
一、各組分的配製
在下列實施例中，心肌分化添加劑及心肌純化添加劑通過以下步驟配置：
1)心肌分化添加劑1：
第一步：配製各種成分的儲備液：①B27；②BMP4 10ug/ml；③CHIR99021 6mM。
第二步：在室溫下將以上各種成分的儲備液按照以上儲備液編號順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、BMP4 8～12ng/ml、CHIR99021 4～8μM的工作液。
2)心肌分化添加劑2：
第一步：配製各種成分的儲備液：①B27；②IWP2 5mM。
第二步：在室溫下將以上各種成分的儲備液按照以上儲備液編號順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、IWP2 4～6μM的工作液。
3)心肌分化添加劑3：
第一步：配製各種成分的儲備液：①B27
第二步：在室溫下將以上儲備液按照儲備液編號與基礎液混合，成為終濃度為B271～3v％的工作液。
4)心肌純化添加劑：
第一步：配製各種成分的儲備液：①B27②乳糖2g/ml。
第二步：在室溫下將以上各種成分的儲備液按照以上儲備液編號順序依次混合，成為終濃度為B27 1～3v％、乳糖1～3mg/ml的工作液。
二、實施例1-5的各心肌分化培養基和心肌純化培養基的配製
實施例1-5及對比例1中的心肌分化培養基的組分如表1所示。
表1：
對比例1中的培養基為現有技術的體系。
將上述實施例1-5中的心肌分化培養基、純化培養基按照如下步驟配製：
在2～8℃化凍心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2和心肌分化添加劑3，隨後將心肌分化添加劑1、心肌分化添加劑2和心肌分化添加劑3分別按1ml:50ml的比例加入心肌分化基礎培養基形成心肌分化培養基1、心肌分化培養基2和心肌分化培養基3，均可在2～8℃穩定儲存達兩周。
在2～8℃化凍心肌純化添加劑，隨後將心肌純化添加劑按1ml:50ml的比例加入到心肌純化基礎培養基形成心肌純化培養基，可在2～8℃穩定儲存達兩周。
三、心肌細胞分化實驗
實驗一：
1.實驗材料：人腎上皮來源的誘導多能幹細胞
2.培養基：實施例1-5中的心肌分化培養基
3.實驗步驟：
1)人腎上皮來源的誘導多能幹細胞的接種：將人腎上皮來源的誘導多能幹細胞接種到鋪有基質膠培養皿中，培養至匯合度達到85％左右；
2)向培養皿中依次加入心肌分化培養基1培養2天，心肌分化培養基3培養1天，心肌分化培養基2培養3天；
3)去除心肌分化培養基2，向培養皿中加入心肌純化培養基，每隔一天換一次心肌純化培養基，純化3天；
4)將純化的心肌細胞再接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中，換成心肌分化培養基3，每隔2天換一次心肌分化培養基3，可長期培養100天。
通過心肌細胞特異性標記物對各實施例及對比例誘導的心肌細胞進行染色鑑定。其中，圖1A至圖1D示出了實驗一中實施例5的培養基分化人誘導多能幹細胞在分化過程不同階段的圖像；其中，圖1A是分化前(day0)的iPSC，圖1B是分化72h的細胞形態，圖1C是分化結束獲得的心肌細胞，圖1D是純化處理獲得的純度≧99％的心肌細胞。
圖2A和圖2B示出的是心肌細胞特異性標記物染色的結果。圖2A的左、中、右圖分別示出的是誘導出的心肌細胞所表達主要的心肌特異性收縮蛋白Cardiac Troponin T、α-Sarcomeric-Actinin以及兩者疊加之後的圖；圖2A顯示了心肌細胞非常規則的肌理結構。圖2B顯示了實施例5的試劑盒誘導的心肌細胞由心室肌樣細胞組成。其中，左圖顯示的是少量其他心肌細胞表達心房特異性輕鏈肌球蛋白MLC2a；中圖顯示的是心室肌樣細胞表達心室特異性輕鏈肌球蛋白MLC2v；右圖2顯示的是兩者疊加後的圖，並對細胞核進行了特異染色。
實施例1～4的誘導分化過程及心肌細胞特異性標記物的染色結果與實施例5的結果類似，此處不再展示。
實驗二：
1.實驗材料：人ES細胞
2.培養基：實施例1-5中的心肌分化培養基
3.實驗步驟：
1)人ES細胞的接種：將人ES細胞接種到鋪有基質膠的培養皿中，培養至匯合度達到85％左右；
2)向培養皿中加入心肌分化培養基1培養3天，心肌分化培養基3培養2天，心肌分化培養基2培養3天；
3)去除心肌分化培養基2，向培養皿中加入心肌純化培養基，每隔一天換一次心肌純化培養基，純化3天；
4)將純化的心肌細胞再接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中，換成心肌分化培養基3，每隔2天換一次心肌分化培養基3，可長期培養100天。
通過心肌細胞特異性標記物對各實施例及對比例進行染色鑑定，並根據染色結果統計各實施例及對比例的分化效率，實驗結果如圖3A和圖3B所示。圖3A示出了實施例1～5及對比例1的心肌細胞分化效率比較結果；圖3B示出了實施例5的試劑盒誘導的心肌細胞NKX2.5啟動子調控下特異性的表達綠色螢光蛋白(GFP)。由搏動和表達GFP的細胞比例顯示，心肌細胞純度達99％以上。圖3B中，右上角的縮小圖顯示了整個視野下的分化後帶螢光的細胞的比例，並以白光下的效果作為背景參照。
由圖3A可以看出，在分化效率上，實施例5相比對比例1，提高了20％。在目前分化培養適合藥物研發的心肌細胞的培養基種類相對較少的基礎上，實施例5的培養基能夠在對比例1的培養基的誘導分化效率基礎上又提高20％多，是難以預料的。而且，分化效率的提高是實現心肌細胞的規模化量產的一個重要條件。此外，對比例1的培養基對分化後的心肌細胞的培養周期是難以達到100天的。而實施例5不僅分化效率大大提高，而且在需要的情況下可以被長期體外培養(可長達100天)，進而解決了現有技術難以實現心肌細胞大規模量產的問題。
實驗三：
1.實驗材料：人外周血來源的誘導多能幹細胞
2.培養基：實施例1-5中的心肌分化培養基
3.實驗步驟：
S1，人外周血來源的誘導多能幹細胞的接種：將人外周血來源的誘導多能幹細胞接種到鋪有基質膠的培養皿中，培養至匯合度達到85％左右；
S2，向培養皿中加入心肌分化培養基1培養4天，心肌分化培養基3培養1天，心肌分化培養基2培養2天；
S3，去除心肌分化培養基2，向培養皿中加入心肌純化培養基，每隔一天換一次心肌純化培養基，純化4天；
S4，將純化的心肌細胞再接種到鋪有基質膠或玻璃粘連蛋白的培養皿中，換成心肌分化培養基3，每隔2天換一次心肌分化培養基3，可長期培養100天。
以實施例5分化的心肌細胞作為轉染受體細胞，檢測本申請的試劑盒誘導的心肌細胞的轉染效率。檢測結果如圖4A和4B所示。圖4A和4B分別顯示心肌細胞轉染GFP質粒(Lipofectamine LTX and PLUS Reagents)48h後在白光和螢光下的觀察結果。經統計，GFP螢光比率達到50～60％。可見，本申請的試劑盒所誘導分化的心肌細胞的轉染效率達50～60％。
此外，採用實時心肌細胞功能分析儀(RTCA)和膜片鉗分別對上述實驗一、實驗二和實驗三中各實施例及對比例所誘導分化及培養的心肌細胞的功能和電生理分別進行了檢測。檢測結果顯示，本申請的試劑盒誘導的心肌細胞在無明顯可見細胞死亡的情況下，維持存活達到3個月以上，並且能保持節律性的搏動。不僅能夠用來排除具有心臟毒性的化合物，還能用於初步評價心血管類藥物的療效，極大地降低藥物開發成本，並提高藥物開發效率，是長期藥物毒性實驗和生理學研究的理想模型工具。
其中，圖5A至圖5C是實驗三中實施例5的心肌功能分析結果。其中，圖5A顯示心肌細胞質量均一穩定且具備正常人心肌細胞的搏動幅度與頻率。圖5B顯示心肌細胞在1.1μm異丙腎上腺素(Isoprenaline)的作用下心率顯著提高，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。圖5C顯示心肌細胞在1.1μm胺碘酮(Amiodarone)的作用下心率顯著降低，其中，0.1％DMSO處理作為陰性參照。
圖6A和圖6B示出的是實驗三中實施例5的膜片鉗檢測電生理的結果。圖6A和圖6B示出了實驗三中實施例5的試劑盒誘導分化的心肌細胞的膜片鉗電生理檢測結果，圖6A顯示誘導的心肌細胞具備典型的自發動作電位，圖6B顯示誘導的心肌細胞具備經典的自發離子通道。
從上述實驗一、實驗二以及實驗三的結果可以看出，本發明的心肌分化試劑盒成分明確，品質穩定且分化純化效率高，細胞譜系廣，可以分化包括各種來源的人誘導多能幹細胞，胚胎幹細胞H9、HCN4等細胞。而且，在需要的情況下可以培養長達100天，且能保持節律性的搏動。不僅能夠用來排除具有心臟毒性的化合物，而且能夠用於初步評價心血管類藥物的療效，極大地降低藥物開發成本，並提高藥物開發效率，是長期藥物毒性實驗和生理學研究的理想模型工具。
從以上的描述中，可以看出，本發明上述的實施例實現了如下技術效果：本申請的心肌分化試劑盒搭配合成包被基質使用，可以達到人源心肌細胞穩定的獲得和維持，並且適用於包括藥物開發和安全性評價在內的各種需求，為心血管藥物開發和生理學研究奠定基礎。
以上僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。