用於測定糖化白蛋白的幹檢驗裝置的製作方法
2023-05-02 08:51:51
專利名稱：用於測定糖化白蛋白的幹檢驗裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於同時測定白蛋白和糖化白蛋白的檢驗裝置，其中糖化白蛋白是臨床檢驗中白蛋白的糖化蛋白質。
眾所周知，血清中的白蛋白或者紅血球中的血紅蛋白能與葡萄糖發生非酶促反應，從而產生相應的糖化蛋白質即分別產生糖化白蛋白或糖化血紅蛋白。由於在蛋白質存在於體液中期間糖化蛋白的濃度反映血糖的濃度，因此糖化蛋白濃度的測定對於體外診斷糖尿病和監測糖尿病是非常有用的。
反映血糖濃度的糖化蛋白包括血紅蛋白A1c(Hb A1c)(即糖化血紅蛋白)、糖化白蛋白和果糖胺。Hb A1c濃度反映前1-2個月的血糖濃度，而糖化白蛋白和果糖胺的濃度反映前1-2個星期的血糖濃度，因此比Hb A1c濃度表現出更快的反應和更大的差異。
換言之，糖化白蛋白或果糖胺的濃度比Hb A1c濃度更適宜作為短期血糖控制的指標。利用基於果糖胺的還原性質的比色分析可測定果糖胺的濃度，此測定易受血液中存在的其它還原物質(例如膽紅素和抗壞血酸)的影響。另外，由於所測得的果糖胺含量用絕對值表示，因此受到樣品中蛋白質的量的影響。因此，用相對值表示的糖化白蛋白的濃度被認為是比果糖胺濃度更可靠的標誌。
在臨床檢驗中，糖化白蛋白濃度通常以與總的白蛋白的比率來表示，並且範圍在11-16％的糖化白蛋白濃度通常被認為是判定正常的標準。因此，需要同時測定總的白蛋白和糖化白蛋白，以便得知糖化白蛋白的濃度。
可利用電泳法、離子交換色譜法、利用對硼酸的親合性的高壓液色譜法(HPLC) (例如Akazawa et al，Igaku ToYakugaku，29269-274(1993)；Fujitaet al，Kiki·Shiyaku，17689-694(1994))、酶免疫測定法、利用一種結合劑的測定法(美國專利5,110,745)，以及其它類似方法來測定糖化蛋白。在這些方法中，HPLC主要用於臨床檢驗領域中。然而，HPLC在準確性和分離性都可靠的情況下，測定每個樣品太耗費時間，因此不能一次測定大量樣品。
最近業已將硼酸的親合性與免疫測定法結合起來使用(例如Aka-zawa et al，Igaku To Yakugaku，29269-274(1993)；Nakano et al，Kiki·Shi-yaku，161017-1021(1993)；Fujita etal，Kiki·Shiyaku，17689-694(1994))。免疫測定法在對糖化蛋白的特異性方面一般是極好的並且適於測定大量樣品。
另外，已經報導了一種用於檢測糖化蛋白的硼酸誘導的酶試劑(例如Miyake et al，Igaku To Yakugaku，28871-875(1992)；Miyake et al，IgakuTo Yakugaku，28876-882(1992)；Kana-tsuna et al，The Clinical Report，265585-5589(1992))。
而且，業已報導了針對人糖化白蛋白的單克隆抗體(例如EP-B-0257421，美國專利5,173,422、5,223,392和5,225,354)。
在目前情況下，在臨床實驗室或大醫院中可藉助較大型設備來進行上述的HPLC和免疫測定法。因此業已需要研究一種測定糖化蛋白的方法，利用這種方法，中小型醫院的醫生、一般實踐者、甚至病人自己即能藉助簡單的小型設備在短時間內檢驗樣品。對於相應於這種需求的方法還沒有報導過。
為了測定糖化白蛋白，血清或血漿被用作樣品，從而為了除去血細胞必須對血樣品進行預處理，以便得到血清或血漿。血清的分離不僅伴隨著複雜的操作過程而且還具有所謂的生物危害感染的危險。血清分離的困難對於利用於檢驗裝置實現糖化蛋白測定也已是個障礙。
本發明的一個目的是提供一種用於同時測定總的白蛋白和糖化白蛋白以便得知糖化白蛋白濃度的幹檢驗裝置，利用這種裝置，中小型醫院的醫生、一般實踐者、甚至病人自己即能藉助簡單小型的光學設備檢驗血樣，而無需血清分離這樣的預處理過程。
業已利用一種幹檢驗裝置來完成本發明的這個和其它目的，此幹檢驗裝置通過利用一種展開劑同時測定白蛋白和糖化白蛋白來測定糖化白蛋白，其包括(A)一個其上具有一展開層的襯底；(B)一血細胞分離層；(C)一含有使白蛋白著色的染料(此後通常稱為染料1)和使糖化白蛋白著色的染料(此後通稱為染料2)的試劑層；(D)一固定有白蛋白結合物質的測定層；以及(E)一吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層。
其中，所述的血細胞分離層、所述的試劑層、所述的測定層和所述的殘餘液體吸收層按序排列在所述的展開層上(此後稱為第一實施例)。
在按照本發明的第一實施例的幹檢驗裝置中，使白蛋白著色的染料和使糖化白蛋白著色的染料最好具有不同的吸收波長或者不同的螢光發射波長。
另外，利用一種幹檢驗裝置來完成本發明的這個或其它目的，此幹檢驗裝置通過利用一種展開劑來測定全血中的糖化白蛋白，該檢驗裝置全部由能使液體擴散通過其的材料製成，並且包括(A)一個具有一個能進行光學測定的通孔或透光區域的襯底；(B)一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層，所述測定層疊加在所述襯底上，以便覆蓋所述通孔或透光區域；(C)一個疊加在所述測定層上的展開層；(D)一個含有使白蛋白著色的染料和使糖化白蛋白著色的染料的試劑層，所述試劑層疊加在所述展開層上；(E)一個包括一血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層疊加在所述試劑層上；以及(F)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，所述殘餘液體吸收層的配置可使其環繞在所述測定層的周圍，其中，所述使白蛋白著色的染料和所述使糖化白蛋白著色的染料具有不同的光學性質(此後稱為第二實施例)。
按照第二實施例的檢驗裝置定那種襯底上配有一單個層狀結構並且可在一個測定層中同時測定糖化白蛋白和白蛋白的類型。
而且，利用一種幹檢驗裝置業已完成這個和其它目的，此幹檢驗裝置通過利用一種展開劑來測定全血中的糖化白蛋白，並且全部由能使液體擴散通過的材料製成，其包括(A)一個具有兩個能進行光學測定的通孔或透光區域的襯底；(B)一個層狀結構，包括(a)一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層，該測定層疊加在襯底上以便覆蓋所述通孔或透光區域中的一個；(b)一個疊加在所述測定層上的展開層；(c)一個含有使白蛋白著色的染料的試劑層，所述試劑層疊加在展開層上；(d)一個包括一血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層疊加在所述試劑層上；以及(e)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，所述殘餘液體吸收層的配置可使其環繞在所述測定層的周圍；以及(C)一個層狀結構，包括(a)一個其上固定有白蛋白結合物質或糖化白蛋白結合物質的測定層，所述測定層疊加在所述襯底上以便覆蓋另一通孔或透光區域；(b)一個疊加在所述測定層上的展開層；(c)一個含有使糖化白蛋白著色的染料的試劑層，該試劑層疊加在所述展開層上；(d)一個包括一血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層疊加在試劑層上；以及(e)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，所述殘餘液體吸收層的配置可使其環繞在所述測定層的周圍(此後稱作第三實施例)。
按照第三實施例的檢驗裝置是那種襯底上配有兩個層狀結構，一個用於測定糖化白蛋白，另一個用於測定白蛋白和糖化白蛋白的類型。在第三實施例中，因為使白蛋白著色的染料和使糖化白蛋白著色的染料將在各自的層狀結構中被檢測，所以它們可以具有相同的光學性質。
圖1A至3B的每一組是按照本發明的第一實施例的檢驗裝置的一個例子的平面圖和剖面圖(分別標為檢驗裝置11、12和13)。
圖4A和4B是圖1所示檢驗裝置11放大的平面圖和剖面圖(標為檢驗裝置11』)。
圖5是按照本發明的第二實施例的檢驗裝置21的剖面圖。
圖6是按照本發明的第三實施例的檢驗裝置31的剖面圖。
在按照本發明的第一、二、三實施例的檢驗裝置中，可如下簡單地完成糖化白蛋白的測定首先將血樣滴在檢驗裝置或裝置上並用一種展開劑使樣品展開；其次用一種(或若干種)染料使白蛋白和糖化白蛋白著色，然後將這兩種蛋白捕獲在測定層中。用光測設備對如此被著色和捕獲的白蛋白和糖化白蛋白分別進行光學測定並由測定值計算糖化白蛋白對白蛋白的比率。
按照本發明的第二和第三實施例的檢驗裝置具有如下優點即使樣品由於重力被向下展開，血樣也能夠被展開。
所施加的血樣包括預先分離的血清或血漿以及全血。雖然在使用血清或血漿時血細胞分離層不是必需的，但是本發明的檢驗裝置是為檢驗全血而設計的，從而甚至病人自己也能在家裡進行測定。
如果需要的話，試劑層中可含有蛋白變性劑，此蛋白變性劑可使白蛋白和糖化白蛋白變性，以便儘可能多地暴露它們的抗原決定基，藉此使它們更易於結合到各自的抗體上。
JP-A-5-87809公開了一種測定糖化白蛋白的方法，包括利用一種固相抗體捕獲白蛋白和糖化白蛋白並用一種硼酸衍生物僅標記糖化白蛋白(「JP-A」在此處意指「未審查的日本專利申請」)。在這種方法中，施加的樣品(即含有糖化白蛋白的白蛋白)量超過了固相中的抗體的已知量，並且所給量的白蛋白被捕獲而沒有被標記。固相抗體的捕獲容量必須總是恆定的。因為捕獲容量易受各種因素影響，所以可產生誤差，並且固相的製備和保存應嚴格控制，而且還需要技術。另外，需要大量的樣品。
在測定糖化白蛋白時，由於血紅蛋白本身是紅色的，因此只標記糖化白蛋白。另一方面，由於白蛋白是無色的，因此必須用各自的標記物質來標記白蛋白和糖化白蛋白。結果，在本發明中，白蛋白被標記，從而可以測定包括糖化白蛋白的總的白蛋白。
在本發明中染料被用作標記物，這是因為染料非常便宜並且比酶或放射性物質更穩定，而且只要所購得的光測設備能夠進行雙波長分光光度測定，就能區分兩種不同的染料，從而可測定白蛋白和糖化白蛋白。另外，染料的一個非常大的優點即是許多染料都能發射螢光。此處用於染料的術語「光學性質」意指吸收波長和螢光發射波長。
以下將參照附圖描述本發明的實施例。圖1A-4B的每一組是按照第一實施例的檢驗裝置的平面圖和剖面圖，圖5和圖6分別是按照本發明的第二和第三實施例的檢驗裝置的剖面圖。本發明的檢驗裝置的本質特徵在於能夠遷移液體的若干個層彼此疊加，從而形成一個液體可通過其向下展開的層狀結構。
檢驗裝置11圖1A和1B是按照第一實施例的檢驗裝置的一個例子的平面圖和剖面圖，包括其上具有兩個展開層2和2』的襯底1，這兩個展開層由能夠傳送展開劑的相同材料製成。展開層2上按序具有作為展開起點的位置P、作為樣品施加點的位置E、包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3、用包括一種光學變性劑的染料1塗覆的試劑層4、其上固定有一種白蛋白結合物質的測定層5和可吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層6。展開層2』上按所列出的順序有作為展開起點的位置P』、作為樣品施加點的位置E』、包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3』、用包括一種光學變性劑的染料2塗覆的試劑層4』、其上固定有一種白蛋白結合物質或一種結合糖化白蛋白而不結合非糖化白蛋白的物質(此後稱作糖化白蛋白結合物質)的測定層5』和可吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層6』。
當在測定層5』中使用糖化白蛋白結合物時，在試劑層4』中可用使白蛋白和糖化白蛋白都著色的一種染料取代染料2。
檢驗裝置11有兩個展開層，白蛋白和糖化白蛋白通過不同的試劑層並且結合在不同的測定層中。
首先將血樣滴在檢驗裝置11的位置E處，然後將展開劑加在位置P處，由此血樣被展開，並且用血細胞分離層3的血細胞分離膜除去血細胞。然後用試劑層4中的光學變性劑使血中的白蛋白變性並且用染料1給白蛋白染色。如此被染色的白蛋白被捕獲在測定層5中，而其它物質被殘餘液體吸收層6吸收。糖化白蛋白也可以用染料1進行染色並被捕獲在測定層5中。
另一方面，將等量的血樣滴在位置E』處，然後將展開劑加在位置P』處，由此血樣被展開，並且用血細胞分離層3』的血細胞分離膜除去血細胞。然後用試劑層4』中的光學變性劑使血中的糖化白蛋白變性並且用染料2給糖化白蛋白染色。如此被染色的糖化白蛋白被捕獲在測定層5』中，而其它物質被殘餘液體吸收層6』吸收。
可光學檢測被捕獲在測定層5中的白蛋白-染料1複合物或白蛋白-和糖化白蛋白-染料1複合物的顏色以及被捕獲在測定層5』中的糖化白蛋白-染料2複合物的顏色，從而得到各自染料的濃度。由染料濃度得到白蛋白和糖化白蛋白的量，並且由此計算出糖化白蛋白對總的白蛋白(糖化白蛋白和非糖化白蛋白)的比率。
如圖4A和4B(檢驗裝置11)所示，分開地配置在檢驗裝置11中的殘餘液體吸收層6和6』可用一個被兩個展開層共用的殘餘液體吸收層7來代替。
在圖1A和1B所示出的檢驗裝置11中，展開層2和2』安排在靠近襯底1的一端，以便使測定者中可以將襯底的另一端夾在手指間。當然，展開層也可以安排在襯底1的任意位置上。這還可應用到以後所描述的檢驗裝置12、13、21和31中。
本發明所用的材料是從常規材料中選擇的。襯底用於檢驗裝置11中的襯底包括主要由聚苯乙烯、聚酯、乙酸纖維素等製成的膜、片或板。襯底可以是透光的，也可以是不透光的。由於從襯底的反面進行樣品展開之後還要進行光度測定，因此希望使用透明襯底，例如，優選的是透明的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)襯底。展開層展開層包括主要由纖維素、纖維素衍生物(例如乙酸纖維素、硝基纖維素)、玻璃纖維等製成的濾紙或多孔基質。被切成條的展開層(如圖1A和1B所示)可用雙面膠帶、粘合劑或熱熔性粘合劑物理固定到襯底上。按照已知的色譜技術來決定帶的寬度和長度。血細胞分離膜用於本發明的血細胞分離膜包括主要由聚四氟乙烯、聚碸、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、混有纖維素的酯類等構成的濾膜。變性劑用於本發明的變性劑包括表面活性劑、酸、皂角苷、以及胍及其鹽。變性劑用於使白蛋白和糖化白蛋白變性，以便儘可能多地暴露出它們的抗原決定基，藉此使這兩種蛋白更易於結合到抗體上。雖然對於一些抗體變性劑並不總是必需的，但是變性劑的加入不會產生副作用。吸收劑構成殘餘液體吸收層的吸收劑要求具有足夠的用於在展開之後吸收展開劑的孔容積。可用的吸收劑包括主要由纖維素、纖維素衍生物(例如乙酸纖維素或硝基纖維素)、玻璃纖維等製成的濾紙或多孔基質。展開劑能夠用於展開血樣的展開劑最好包括一般用於免疫測定或色譜的那些展開劑，例如含有痕量蛋白、鹽、螯形化合物、表面活性劑、以及類似物質的緩衝液。所提到的展開劑的型例子是含有0.1％的牛血清白蛋白、0.9％氯化鈉、0.01％ EDTA、以及0.01％ Triton x-100的0.1M磷酸鹽緩衝液。染料用於給白蛋白染色的染料1包括那些對白蛋白具有特殊的親合力而對其它蛋白使沒有親合力的染料。染料1包括使白蛋白著色而不使糖化白蛋白著色的染料，以及使白蛋白和糖化白蛋白都著色的染料。
例如，諸如溴甲酚紅紫、溴甲酚藍、溴甲酚綠以及CibacronBlue F3 G-A這些指示劑是優選的。
通過以抗白蛋白抗體、以下的測定層中所描述的離子交換劑、或者它們的組合物媒介還可以使用那些對白蛋白沒有特殊親合力的染料。例如，結合到抗白蛋白抗體上的蒽醌染料、偶氮染料、吖嗪染料、三嗪染料、藻紅素染料、香豆素染料、吖啶染料、若丹明染料、螢光染料和酞薔染料可用作染料1。對於上述所列舉的染料，通過測定其螢光強度可檢測那些染料的發射。給白蛋白特異染色的染料由於其價廉、穩定以及不以抗體作媒介即能結合到白蛋白上的這些優越性而非常有用。
用於給糖化白蛋白染色的染料2包括那些對糖化白蛋白有特殊親合力的染料。通過以抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、以下的測定層中所描述的離子交換劑、或者這些物質的組合作媒介可以使用那些對糖化白蛋白沒有特異性的染料。例如，可以使用結合到二羥基硼酸衍生物或者抗糖化白蛋白抗體上的蒽醌染料、偶氮染料、吖嗪染料、三嗪染料、藻紅素染料、香豆素染料、吖啶染料、若丹明染料、螢光染料和酞菁顏料。二甲苯苯胺硼酸和二甲氨基萘磺醯基抗糖化白蛋白抗體是特別適宜的。抗糖化白蛋白本選自於那些能識別糖化白蛋白的葡糖抗原決定基的抗體。如果使用離子交換劑，則檢驗裝置的構成必須使染料2與離子交換劑的複合物不與白蛋白結合。
抗白蛋白抗體和抗糖化白蛋白抗體既可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。不僅可以使用抗體分子而且還可以使用通過酶催處理抗體分子而得到的抗體活性片段例如Fab、Fab』和(Fab』)2。
當使用染料與二羥基硼酸的結合物時，因為抗糖化白蛋白抗體具有一個葡糖抗原決定基，所以最好通過利用糖肽酶或聚糖酶的酶處理來除去葡糖鏈或者使用上述提到的Fab、Fab』、或(Fab』)2片段。測定層檢驗裝置11的測定層包括一種其上通過化學鍵固定有白蛋白結合物的基質。白蛋白結合物的例子包括抗白蛋白抗體、離子交換劑、以及它們的組合。用於本發明的白蛋白結合物能結合到白蛋白和糖化白蛋白兩種物質上。抗白蛋白抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，並且如上所述進行過酶處理。適宜的離子交換劑包括二乙氨基乙基纖維素和羧甲基化聚乙烯醇。
用於捕獲糖化白蛋白的測定層5』可包括白蛋白結合物或糖化白蛋白結合物。糖化白蛋白結合物的例子包括抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、以及它們的組合。這些物質不結合白蛋白，但是結合糖化白蛋白，因為它們能識別糖化白蛋白的糖抗原決定基。抗糖化白蛋白抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，並且如上所述進行過酶處理。
當染料1和2需要以抗體作媒介並且測定層中的血蛋白結合物含有抗體時，這些抗體應該具有不同的抗原決定基並且同時結合到一個抗原上。構成通過利用本領域公知的任何方法和相應的試劑浸漬、塗覆或與展開層結合而將以上所述的各個層配置在展開層上。例如，將待施加的物質溶解在浸漬溶液中，並且通過浸漬或用噴墨印刷機噴塗，然後進行乾燥而將溶液加到展開層上。因為試劑層中的試劑應該從初始位置滲出並用展開劑展開，所以可通過浸漬或塗覆來簡單地加入該試劑。另一方面，測定層中的特異性結合物質必須通過化學鍵固定到展開層上，以便不會從其位置上遷移出來(參見KOSOMEN-EKI SOKUTEIHO，Igakushoin(1987))。
一個基本需要是將染料1和2(每一種染料選自於前述的染料中)組合起來，從而使它們獨自並特異性地給白蛋白和糖化白蛋白染色。這種組合的一個合適的例子是作為染料1的溴甲酚紅紫和作為染料2的二甲苯苯胺硼酸。由於檢驗裝置11具有一個專門用於白蛋白測定的測定層和一個專門用於糖化白蛋白測定的測定層，因此染料1和2可以是相同種類的染料或具有相同的吸收波長，也可以有所區別。
檢驗裝置12圖2A和2B是按照本發明的第一實施例的檢驗裝置的另一個例子的平面圖和剖面圖，其包括其上具有一個展開層2的襯底1。
展開層2上按所列出的順序具有作為展開起點的位置P、作為樣品施加點的位置E、包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3、用包括一種光學變性劑的染料1和2塗覆的試劑層4、其上固定有白蛋白結合物的測定層5、以及吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層6。
檢驗裝置12具有一個展開層，並且白蛋白和糖化白蛋白通過一個試劑層，並被捕獲在一個測定層中。
首先將血樣滴在檢驗裝置12的位置E處，然後將展開劑加在位置P處，由此血樣被展開，並且用血細胞分離層3的血細胞分離膜除去血細胞。試劑層4中的光學變性劑使血中的白蛋白和糖化白蛋白變性，並且用染料1給白蛋白染色，用染料1和2或染料2給糖化白蛋白染色。如此被染色的白蛋白和糖化白蛋白被捕獲在測定層5中，而其它物質被殘餘液體吸收層6吸收。
被捕獲在測定層5中的白蛋白-染料1複合物或者白蛋白-染料1複合物與糖化白蛋白-染料1和2複合物中的染料1的顏色以及糖化白蛋白-染料2複合物或者糖化白蛋白-染料1和2複合物中的染料2的顏色可分開進行光學檢測，以便得到各自染料的濃度。由染料濃度可得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此計算出糖化白蛋白對總的白蛋白的比率。
由於檢驗裝置12隻有一個展開層，因此與具有兩個展開層的檢驗裝置11相比結構更簡單，成本更低。滴一次血樣即可測定糖化白蛋白，從而測定也較為簡單。
構成檢驗裝置12的襯底、展開層、以及其它各個層的材料與檢驗裝置11相同。然而，當一種著色染料用作染料1時，染料1不僅可以使白蛋白著色，而且可以使糖化白蛋白著色。在這種情況下，染料1和2都可以使糖化白蛋白著色。因此，應該選擇染料1和2以使它們能夠光學區分開，即應該具有不同的吸收波長，從而在一個測定層中可觀察到染料1和2。這是第一實施例的檢驗裝置11和12的區別。當然，染料2應該只標記糖化白蛋白。
當染料1和2需要以抗體作媒介並且測定層中的特異性結合物含有抗體時，這些抗體應該具有不同的抗原決定基並且同時結合到一個抗原上。
檢驗裝置13圖3A和3B是按照本發明的第一實施例的檢驗裝置的又一個例子的平面圖和剖面圖，其包括其上具有一個展開層2的襯底1。
展開層2上按所列出的順序具有作為展開起點的位置P、作為樣品施加點的位置E、包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3、用包括一種光學變性劑的染料1和2塗覆的試劑層4、其上固定有糖化白蛋白結合物的測定層5』、其上固定有白蛋白結合物的測定層5、以及吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層6。
檢驗裝置13具有一個展開層，白蛋白和糖化白蛋白通過一個試劑層並被捕獲在不同的測定層中。
首先將血樣滴在檢驗裝置13的位置E處，然後將展開劑加在位置P處，由此血樣被展開，並且用血細胞分離層3的血細胞分離膜除去血細胞。試劑層4中的光學變性劑使血中的血蛋白和糖化白蛋白變性，並且用染料1給白蛋白染色，用染料1和2或染料2給糖化白蛋白染色。如此被染色的糖化白蛋白被捕獲在測定層5』中，如此被染色的白蛋白被捕獲在測定層5中，而其它物質被殘餘液體吸收層6吸收。
分別被捕獲在測定層5』和5中的糖化白蛋白-染料1和2複合物或者糖化白蛋白-染料2複合物中的染料2的顏色以及白蛋白-染料1複合物或者白蛋白-染料1複合物與糖化白蛋白-染料1和2的複合物中的染料的顏色可分開進行光學檢測，以便得到各自染料的濃度。由染料濃度可得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此計算出糖化白蛋白對總的白蛋白的比率。
檢驗裝置13具有與檢驗裝置12一樣的優點。另外，由於檢驗裝置13具有一個專門用於白蛋白的測定層和一個專門用於糖化白蛋白的測定層，因此即使染料1和2的種類相同或者具有相同的吸收波長，也能將二者區分開。染料1既可以是只給白蛋白特異染色的染料，也可以是給白蛋白和糖化白蛋白都染色的染料，而染料2應該只標記糖化白蛋白。
如果測定層的一層(層5』)上固定有抗糖化白蛋白抗體，而另一測定層(層5)上固定有抗白蛋白抗體，則只可以使用使白蛋白和糖化白蛋白同時著色的染料。在這種情況下，使白蛋白著色的染料和使糖化白蛋白著色的染料具有完全相同的吸收波長，並且由於具有兩個分開的測定層，因此還能將這兩種區分開。
檢驗裝置21圖5是按照本發明的第2實施例的檢驗裝置的一個例子的剖面圖，其包括其上具有一個層狀結構(層結構)的襯底1。
檢驗裝置2 1按所列出的順序包括具有通孔7的襯底1，通孔上層壓著有層8；其上固定有白蛋白結合物的測定層5；展開層2；其上載有包括光學變性劑的染料1和2的試劑層4；以及包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3。測定層5被吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層6環繞著，從而形成一個層狀結構。這個層狀結構用具有一個通孔的罩9覆蓋著，通過罩9上的這個通孔施加血樣和展開劑。
在將血樣滴到血細胞分離層3上，其次將展開劑加到這一層上之後，血樣被展開，並且用血細胞分離膜分開血細胞。試劑層4中的光學變性劑使血漿中的白蛋白和糖化白蛋白變性，白蛋白用染料1染色，而糖化白蛋白用染料1和2或染料2染色。用染料1染色的白蛋白和用染料1和2或染料2染色的糖化白蛋白被捕獲在測定層5中，而其它物質被殘餘液體吸收層6吸收。
都被捕獲在測定層5中的白蛋白-染料1複合物或者白蛋白-和糖化白蛋白-染料1複合物的顏色以及糖化白蛋白-染料2複合物的顏色可分開進行檢測，以便得到各自染料的濃度。由染料濃度得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此計算出糖化白蛋白對白蛋白的比率。
用於檢驗裝置21的製備中的襯底、血細胞分離膜、吸收劑、展開劑、染料1和2、變性劑、測定層以及類似組分與用於檢驗裝置11的相同。
當使用不透光的襯底時，要製備一個如圖5所示的通孔。
用於檢驗裝置21中的透明層包括主要由聚酯、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、以及類似物質製成的膜或片。配置透明層是為了支撐覆蓋襯底的通孔的測定層。因此，當測定層本身具有一定的強度時或者襯底本身是透光的時，透明層不是必需的。假設在圖5中襯底是不透光的，則襯底要有一個通孔，並且透明層配置在測定層之下。
罩9的材料不受特別限定，可以與用於襯底的相同，即可以是主要由聚酯、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、以及類似物質製成的膜或片。罩9是為了保證幾個層疊壓在一起。當用少量粘合劑使幾個層固定在一起時，罩9是不必需的。
可以與檢驗裝置11相同的方式用相應試劑和類似物質浸漬或塗覆主要由纖維素、纖維素衍生物(例如乙酸纖維素、硝基纖維素)、玻璃纖維、以及類似物質製成的濾紙或多孔基質來製備構成檢驗裝置21的每一層。
在檢驗裝置21中，可在同一層中測定被染色的白蛋白和被染色的糖化白蛋白。為了在一個測定層中清楚地區分開染料1和2，染料1和2必須具有不同的光學性質(例如吸收波長和螢光發射波長)。
由於檢驗裝置21隻有一個層狀結構，因此它與以後將描述的具有兩個層狀結構的檢驗裝置31相比結構更簡單，成本更低。只滴加一次血樣即能測定出糖化白蛋白，從而測定更簡便。
檢驗裝置31圖6是按照本發明的第三實施例的檢驗裝置的一個例子的剖面圖，其包括其上具有兩個層狀結構(層結構)的襯底1。
檢驗裝置31按所列出的順序包括具有兩個通孔7和7』的襯底1，每個通孔上層壓著透明層8或8』；其上固定有白蛋白結合物的測定層5或5』；展開層2或2』；其上載有染料1的試劑層4或者其上載有包括一種光學變性劑的染料2的試劑層4』；以及包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層3或3』。測定層5和5』的每一層分別被殘餘液體吸收層6或6』環繞著，從而形成相應的層狀結構。兩個層狀結構用在每個層狀結構上具有一個通孔的罩9覆蓋著，可通過此通孔施加血樣和展開劑。
在測定層5中，白蛋白(和糖化白蛋白)被染色。在測定層5』中，只有糖化白蛋白被染色。這樣，可得到糖化白蛋白對總的白蛋白的比率。
雖然構成檢驗裝置31的每一層的材料與檢驗裝置21相同，但是檢驗裝置31的優點在於由於是在分開的兩個測定層上各自觀察染料1和2，因此即使染料1和2的光學性質相同並且在光學上是不可分辨的，也能將它們彼此區分開。
當染料1和2需要以抗體作媒介並且測定層中的白蛋白-和/或糖化白蛋白結合物含有抗體時，這些抗體應該具有不同的抗原決定基並且同時結合到一個抗原，這與檢驗裝置21相同。
作為檢驗裝置31的一種改進，測定層5上可固定有白蛋白結合物質，而測定層5』上可固定有糖化白蛋白結合物質。在這種情況下，測定層5捕獲白蛋白和糖化白蛋白，而測定層5』只捕獲糖化白蛋白，藉此能夠計算出糖化白蛋白對總的白蛋白的比率。在這種改進的裝置中，使白蛋白和糖化白蛋白都著色的染料還可以用來代替染料2。此時，這種染料和染料1可以是相同種類的染料或具有相同的光學性質，也可以有所區別。
以上雖然參考特定的例子對本發明進行了描述，但是應該理解本發明包括各種在本發明的精髓和範圍內做出的各種改進和變化。即，按照最終用途可以改變以上所述的檢驗裝置的結構。例如，襯底不是必需的，襯底部分可以用作展開層或層狀結構。
本發明提供了用於同時測定糖化白蛋白和白蛋白的新型、實用的檢驗裝置，這種裝置易於用手拿操作，並且因此而適合於家庭使用。
雖然已經參考特定的例子對本發明進行了詳細的描述，但是對於本領域的技術人員在不脫離本發明的精髓和範圍內所做的各種變型和改進都是顯而易見的。
權利要求
1.一種通過利用一種展開劑同時測定全血中的白蛋白和糖化白蛋白來測定糖化白蛋白的幹檢驗裝置，包括(A)一個其上具有一展開層的襯底；(B)一個血細胞分離層；(C)一個含有一種使白蛋白著色的染料和一種使糖化白蛋白著色的染料的試劑層；(D)一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層；以及(E)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，其中所述血細胞分離層、所述的試劑層、所述測定層、以及所述殘餘液體吸收層按序排列在所述的展開層上。
2.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料和所述使糖化白蛋白著色的染料具有不同的吸收波長和不同的螢光發射波長。
3.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料通過以抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合作媒介給白蛋白染色；所述使糖化白蛋白著色的染料通過以抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、離子交換劑、或者這些物質的組合物媒介給糖化白蛋白染色。
4.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料是一種不用媒介即能給白蛋白特異染色的染料。
5.如權利要求4所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料選自於溴甲酚紅紫、溴甲酚紅藍、溴甲酚紅綠、以及CibacronBlue F3 G-A。
6.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述白蛋白結合物質是一種抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合。
7.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述檢驗裝置具有兩個展開層，白蛋白和糖化白蛋白通過不同的試劑層並結合在不同的測定層中。
8.如權利要求7所述的幹檢驗裝置，其特徵在於白蛋白被捕獲在一個其上固定有抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合的測定層中；而糖化白蛋白被捕獲在一個其上固定有抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、或者它們的組合的測定層中。
9.如權利要求7所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述的兩個展開層共用一個殘餘液體吸收層。
10.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述檢驗裝置具有一個展開層，白蛋白和糖化白蛋白通過一個試劑層並被捕獲在一個測定層中。
11.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述檢驗裝置具有一個展開層，白蛋白和糖化白蛋白通過一個試劑層並被捕獲在不同的測定層中。
12.如權利要求11所述的幹檢驗裝置，其特徵在於白蛋白被捕獲在一個其上固定有抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合的測定層中；糖化白蛋白被捕獲在一個其上固定有抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、或者它們的組合的測定層中。
13.如權利要求1所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述試劑層還含有一種血液變性劑。
14.一種通過利用一種展開劑測定全血中糖化白蛋白的幹檢驗裝置，該裝置全部由能使液體遷移通過的一種材料製成，其包括(A)一個具有一個能進行光學測定的通孔或透光區域的襯底；(B)一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層，所述測定層層壓在所述襯底上，以便覆蓋所述通孔或透光區域；(C)一個層壓在所述測定層上的展開層；(D)一個含有一種使白蛋白著色的染料和一種使糖化白蛋白著色的染料的試劑層，所述試劑層層壓在所述展開層上；(E)一個包括一個血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層層壓在所述試劑層上；以及(F)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，所述殘餘液體吸收層的配置環繞在所述測定層的周圍，並且所述使白蛋白著色的染料和所述使糖化白蛋白著色的染料具有不同的光學性質。
15.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料和所述使糖化白蛋白著色的染料具有不同的吸收波長或螢光發射波長。
16.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述的使白蛋白著色的染料通過以抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合作媒介來給白蛋白染色；所述使糖化白蛋白著色的染料通過以抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、離子交換劑、或者這些物質的組合作媒介給糖化白蛋白染色。
17.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料不用媒介即能給白蛋白特異染色。
18.如權利要求17所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述第一染料選自於溴甲酚紅紫、溴甲酚藍、溴甲酚綠和Cibacron Blue T3 G-A。
19.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述白蛋白結合物質是抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合。
20.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於包括所述測定層、所述展開劑、所述試劑層、所述血細胞分離層以及所述殘餘液體吸收層的層狀結構用一個具有一通孔的罩覆蓋著，通過所述通孔施加血樣和展開劑。
21.如權利要求14所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述試劑層還含有一種血液變性劑。
22.一種通過利用一種展開劑測定全血中糖化白蛋白的幹檢驗裝置，該裝置全部由能使液體遷移通過的一種材料製成，其包括(A)一個具有兩個能進行光學測定的通孔或透光區域的襯底；(B)一個層狀結構，包括(a)一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層，該測定層層壓在襯底上，以便覆蓋其中一個所述通孔或透光區域；(b)一個層壓在所述測定層上的展開層；(c)一個含有一種使白蛋白著色的染料的試劑層，所述試劑層層壓在展開層上；(d)一個包括一血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層層壓在所述試劑層上；以及(e)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，使所述殘餘液體吸收層的配置環繞在所述測定層的周圍；以及(C)一個層狀結構，包括(a)一個其上固定有一種白蛋白結合物質或一種糖化白蛋白結合物質的測定層，所述測定層層壓在所述襯底上，以便覆蓋另一通孔或透光區域；(b)一個層壓在所述測定層上的展開層；(c)一個含有一種使糖化白蛋白著色的染料的試劑層，該試劑層層壓在所述展開層上；(d)一個包括一血細胞分離膜的血細胞分離層，所述血細胞分離層層壓在試劑層上；以及(e)一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層，使所述殘餘液體吸收層的配置環繞在所述測定層的周圍。
23.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料通過以抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合作媒介給白蛋白染色；而所述使糖化白蛋白著色的染料通過以抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、離子交換劑、或者這些物質的組合物媒介給糖化白蛋白染色。
24.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白染色的染料不用媒介即可給白蛋白特異染色。
25.如權利要求24所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述使白蛋白著色的染料選自於溴甲酚紅紫、溴甲酚藍、溴甲酚綠和CibacronBlue F3 G-A。
26.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述白蛋白結合物質是抗白蛋白抗體、離子交換劑、或者它們的組合。
27.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述糖化白蛋白結合物質是抗糖化白蛋白抗體、二羥基硼酸衍生物、或者它們的組合。
28.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於包括所述測定層、所述展開層、所述試劑層、所述血細胞分離層、以及所述殘餘液體吸收層的層狀結構用一個具有一通孔的罩覆蓋著，通過所述通孔施加血樣和展開劑。
29.如權利要求22所述的幹檢驗裝置，其特徵在於所述試劑層還含有一種血液變性劑。
全文摘要
本發明公開了一種通過用展開劑同時測定全血中的白蛋白和糖化白蛋白來測定糖化白蛋白的幹檢驗裝置，該裝置包括一個其上具有一個展開層的襯底；一個血細胞分離層；一個含有使白蛋白著色的染料和使糖化白蛋白著色的染料的試劑層；一個其上固定有白蛋白結合物質的測定層；以及一個吸收殘餘展開劑的殘餘液體吸收層。
文檔編號G01N33/543GK1165300SQ9612161
公開日1997年11月19日 申請日期1996年10月18日 優先權日1995年10月18日
發明者山本·博司, 河野昌雄, 土井茂 申請人:株式會社京都第一科學