植物作為宿主在表達PD‑1抗體和/或PD‑L1抗體中的應用的製作方法
2023-05-02 09:00:22
本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。
背景技術：
癌症是世界各地死亡的主要原因，由於人口的增長和老齡化以及其他因素的普遍存在，如空氣，食品等汙染，其發生率正在上升。在治療方法中，手術，化療和放射形照射依然是現階段治療各種腫瘤類型和階段的主要手段。然而，由於對腫瘤細胞缺乏選擇性，化療方法的成功率有限，且會導致全身毒性和耐藥性。放射性療法也不能全部殺死癌細胞，而且導致病人病體更加虛弱。因為癌細胞具有擴散性，手術可以切除發病部位，但是也不能阻擋癌細胞的傳播。目前較先進的療法是根據腫瘤細胞的分子特徵，設計出更好的靶向治療來阻止其生長和傳播。這些療法中的大多數都是基於容易進入腫瘤細胞的小分子藥物或與其表面上的特定靶標結合的單克隆抗體(mab)。
基於mab的靶向治療是針對不同目標的免疫療法，例如阻斷致癌途徑，隨後對細胞生長和凋亡的影響，阻斷新血管形成，調節對腫瘤細胞的免疫應答，破骨細胞功能的調節或細胞毒性藥物的遞送來殺死腫瘤細胞。自從美國食品和藥物管理局(fda)批准第一種單克隆抗體以來，其中包括鼠，嵌合和人源化抗體在內的數百種抗體已被開發用於癌症治療。這些單克隆抗體中的一些已經被fda批准，並且已經可用於日常實踐中的臨床應用，作為單一療法或與標準化療方案組合，而許多其它單克隆抗體仍在不同的臨床試驗中進行測試。
pd-1抗體(pembrolizumab，anti-pd-1,)是一種人源化單克隆抗體，其也與pd-1受體結合，阻斷其與pd-l1和pd-l2配體的相互作用。在2014年被fda首次批准用於治療不可切除或轉移性黑色素瘤患者疾病治療。2015年，獲得了其他兩個適應症的批准；在10月份，被用於治療表達pd-l1的轉移性nsclc患者在含鉑化療後或其後進行疾病治療，在12月被用於治療不可切除或轉移性黑色素瘤患者。最近在2016年10月，fda批准了基於腫瘤反應率和耐受性的加速批准，用於治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌(hnscc)患者，用於鉑化學療法或後續的治療。pd-1抗體(keytruda)於2017年3月被批准用於治療霍奇金淋巴瘤(chl)。
pd-l1抗體(anti-pd-l1，阿替珠單抗，atezolizumab，tecentriqtm)是一種結合pd-l1並阻斷其與pd-1和b7.1受體相互作用的fc工程化人源化單克隆抗體。它解決了pd-l1/pd-1介導的免疫應答的抑制，包括激活抗腫瘤免疫應答而不誘導抗體依賴性細胞毒性。anti-pd-l1(atezolizumab)於2016年被fda批准用於治療局部晚期或轉移性尿路上皮癌患者，其在化療期間對轉移性癌細胞具有治療效果，並可用於化療後12個月內的輔助治療。2016年10月，atezolizumab經fda批准，化療期間或之後被用於治療egfr或alk基因組畸變治療的轉移性非小細胞肺癌(nscsc)患者。
由於pd-1和pd-l1抗體對癌細胞殺傷力明顯，可以顯著提高癌症病人的存活率。且因為其廣譜的抗癌作用，fda也在加速批准該抗體對腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、血癌、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌症的臨床二期或三期試驗。目前的pd-1和pd-l1抗體是利用哺乳動物細胞生產，然而其產量低，複雜加工，設備要求高等因素導致其難以滿足癌症病人的大量需求。
現階段有利用動物細胞生產pd-1以及pd-l1單克隆抗體。但是動物細胞培養需要價格昂貴的培養液，嚴格的廠房條件，操作複雜，時間周期至少兩周，而且動物細胞生產能力低，造成成本極高。有時候動物細胞所帶的病毒可以侵染人類，造成安全性低。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。本發明利用植物尤其是生菜作為重組蛋白生產的高效平臺技術，表達了pd-1和pd-l1抗體。並且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明植物尤其是生菜表達平臺可以成功用來生產pd-1和pd-l1抗體蛋白。時間短(4d)，純化簡單，生產便捷。消除基因汙染，消除感染人體的潛在病蟲害等。大大降低生產成本，提高產品安全性。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。優選的，所述抗體為單克隆抗體。
在本發明的一些具體實施方案中，所述植物選自生菜、菸草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麥；所述植物的器官選自種子、葉、根莖或整株植物。本發明還提供了一種表達載體，包括以下各項中的任意一項以及載體：
ⅰ.pd-1的重鏈序列或輕鏈序列；
ⅱ.pd-l1的重鏈序列或輕鏈序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述pd-1的重鏈序列或輕鏈序列為將pd-1重鏈、pd-1輕鏈的密碼子優化為植物偏好的密碼子，獲得的優化的pd-1的重鏈序列或優化的pd-1的輕鏈序列；
所述pd-l1的重鏈序列或輕鏈序列為將pd-l1重鏈、pd-l1輕鏈的密碼子優化為植物偏好的密碼子，獲得的優化的pd-l1的重鏈序列或優化的pd-l1的輕鏈序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述優化的pd-1的重鏈序列如seqidno.1所示；所述優化的pd-1的重鏈的核苷酸序列如seqidno.2所示；
所述優化的pd-1的輕鏈序列如seqidno.3所示；所述優化的pd-1的輕鏈的核苷酸序列如seqidno.4所示；
所述優化的pd-l1的重鏈序列如seqidno.5所示；所述優化的pd-l1的重鏈的核苷酸序列如seqidno.6所示；
所述優化的pd-l1的輕鏈序列如seqidno.7所示；所述優化的pd-l1的輕鏈的核苷酸序列如seqidno.8所示。
在本發明的一些具體實施方案中，所述載體為雙元植物載體。
在本發明的一些具體實施方案中，所述表達載體的構建方法包括如下步驟：
步驟1：分別將pd-1重鏈、pd-1輕鏈、pd-l1重鏈、pd-l1輕鏈的密碼子優化為植物偏好的密碼子，獲得：
ⅰ.優化的pd-1的重鏈序列；
ⅱ.優化的pd-1的輕鏈序列；
ⅲ.優化的pd-l1的重鏈序列；
iv.優化的pd-l1的輕鏈序列；
步驟2：在所述優化的pd-1的重鏈序列或優化的pd-l1的重鏈序列或優化的pd-l1的輕鏈序列的5』末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3』末端分別加入xhol位點；
在所述優化的pd-1的輕鏈序列的5』末端加入xmal限制性酶切位點，在3』末端加入xhol位點；
由genecript克隆到puc57載體中，分別獲得ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h或ppd-l1l克隆載體；
步驟3：通過kpnl/sacl分別從步驟2所得的克隆載體中獲得基因片段，克隆至雙元植物載體pcam35s，分別獲得表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l，p35s-pd-l1h或p35s-pd-l1l。
具體的，為了提供外援蛋白在植物中的高效表達，本發明將人pd-1重鏈(genbankaccession號：5dk3_b)，輕鏈，(genbankaccession號：5dk3_a)pd-l1重鏈(genbankaccession號：aao17823.1)，輕鏈，(genbankaccession號：4dke_l)蛋白序列反翻譯軟體(https://www.idtdna.com/codonopt)將其其密碼子優化為植物偏好的密碼子，由genescript公司(南京，中國)合成。在優化的pd-1重鏈序列，以及pd-l1輕重鏈序列5』末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3』末端分別加入xhol位點。在pd-1輕鏈序列5』末端分別加入xmal限制性酶切位點，在3』末端分別加入xhol位點。並由genecript克隆到puc57載體中(圖1)，分別生成ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h和ppd-l1l克隆載體。基因片段通過kpnl/sacl分別從克隆載體中分離，並克隆到雙元植物載體pcam35s，分別產生植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l，p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。
本發明還提供了所述的表達載體在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用。
此外，本發明還提供了一種植物作為宿主表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體的方法，將本發明提供共的表達載體轉化到農桿菌中，通過農桿菌介導真空滲透入植物組織後，提取、分離蛋白質，獲得pd-1抗體和/或pd-l1抗體。
具體的，將四種植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那黴素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d後，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白腖，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)並補充抗生素液體培養基(50mg/l卡那黴素)。將接種的培養物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養基測量od600值並調節至3.5～4.5。然後收集培養液，離心(4500轉速)10min。將農桿菌細胞重懸在滲透培養基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。
將製備好的含有p35s-pd-1h以及p35s-pd-1l農桿菌等量混勻至o.d.600為0.5；同樣將含有p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l的農桿菌等量混勻至o.d.600為0.5。將培養懸浮液置於2l燒杯，並置於乾燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)並輕輕地旋轉於細菌懸浮液中，將乾燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，並且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態30～60s。快速打開該系統以釋放壓力，使滲透液滲入組織內的空間。該過程重複2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴散明顯。然後將生菜組織從滲透液中輕輕取出，並用蒸餾水連續衝洗三次，然後轉移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4d。
在本發明的一些具體實施方案中，所述農桿菌介導真空滲透包括如下步驟：
步驟1：抽真空25～45s；
步驟2：保持真空(-95kpa)壓力30～60s；
步驟3：釋放壓力使得滲透液滲入所述植物組織；
重複上述步驟2～3次，避光處理4d。
在本發明的一些具體實施方案中，農桿菌具體為根癌土壤桿菌gv3101。
本發明所述克隆ppd-1h，ppd-1l,ppd-l1h和ppd-l1l基因片段(圖2a，b)，並且構建四種雙元植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。在完成構建體後，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。滲透後，絕大多數生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區域外，其餘部分均在真空滲透4天後顯示淡黃褐色區域。
提取、分離蛋白質具體為：將經農桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，並用體積比為1:1比例的提取緩衝液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機中高速勻漿1～2min。將勻漿物調節至ph8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15min以除去細胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，並在冰上搖動孵育60min。通過離心機(10,000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進行第二輪硫酸銨(70％)沉澱，冰上搖動懸浮60min，再次在4℃下以10,000g離心15min。然後，棄去上清液，將處理樣品沉澱蛋白質溶於5ml緩衝液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中並在4℃下儲存。
sds-page凝膠電泳具體為：收集從農桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質，取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩衝液(biorad，hercules，ca，usa)在4-12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳。同樣，在非變性凝膠電泳中檢測抗體的親和程度。然後用考馬斯藍g250(biorad)染色後再次對凝膠進行拍照。
植物來源的重組蛋白質的下遊加工通常難於並且昂貴，因為纖維素細胞壁難以裂解以及次級植物代謝產物。我們用攪拌機攪拌勻漿，大大節省勻漿成本以及工藝。重組pd-1抗體以及pd-l1抗體經過變性凝膠sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約分別為23kda以及50kda條帶(圖3a)，符合pd-1以及pd-l1抗體輕重鏈的蛋白大小。在非變性的凝膠電泳中觀察到大約150kda(圖3b)的條帶，證明生菜重組輕重鏈成功的結合為抗體結構，符合pd-1以及pd-l1的抗體蛋白分子量。基於bradford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量大約為0.72mg/g。
經癌症細胞抑制試驗驗證獲得的抗體，人非小細胞肺癌nsclc細胞系a549細胞在補充有10％fbs(gibco，usa)，100u/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的rpmi-1640培養基(gibco，usa)中生長。所有細胞在37℃的5％co2加溼氣氛中培養，每天更新培養基，並使用0.25％胰蛋白酶每三天傳代細胞。通過胰蛋白酶消化收集a549細胞，並以1×106個細胞/ml的密度重懸浮，加入分別加入純化的10μgpd-1以及pd-l1抗體，72h後用膜聯蛋白v-螢光素異硫氰酸酯(fitc)和pi用於雙染以評估凋亡細胞的比例。
通過細胞實驗研究純化pd-1以及pd-l1抗體對人非小細胞肺癌(nsclc)細胞對的抑制。通過加入純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養nsclc細胞，在72h的時間點檢查細胞生長結果表明，沒有任何處理的nsclc細胞生長良好。相比之下，使用純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養的細胞大部分消失(圖4)。這些結果表明，通過生菜系統瞬間表達的外源pd-1以及pdl-1抗體具有生物學活性並且可以殺死nsclc細胞。結果表明，植物尤其生菜是一種生產pd-1以及pd-l1抗體的合適的生物反應器。
本發明利用生菜來瞬時表達pd-1以及pd-l1抗體，在較短的時間內(4d)可產生高含量的蛋白質。生菜是高等植物，可以進行翻譯後修飾過程，即表達的蛋白自動具有活性。而且這種方法最大限度地減少了生物安全問題，因為處理過的生菜組織通常是在完全封閉的設施或容器中開發，不存在生物汙染問題。生菜基本不含有植物有毒物質，而且其本身纖維少，利於下遊的蛋白純化。利用生菜系統生產pd-1以及pd-l1單克隆抗體，可以大大縮短生產周期和生產成本。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示克隆載體puc57示意圖；
圖2(a)示pd-1植物雙元表達載體p35s-pd-1h(重鏈)以及p35s-pd-1l(輕鏈)構建流程；利用限制性內切酶(xbal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-1h重鏈，連接入pcam35s的xbal/xhol位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-1h；利用限制性內切酶(xmal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-1h重鏈，連接入pcam35s的xmal/xhol位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-1l；
lbandrb:ti質粒左右邊界；35s，具有菸草花葉病毒(tmv)5『utr的camv35s啟動子；nptii，用於卡那黴素抗性的編碼nptii基因的表達；nos3』，終止子；
圖2(b)示pd-l1植物雙元表達載體p35s-pd-l1h(重鏈)以及p35s-pd-l1l(輕鏈)構建流程；利用限制性內切酶(xbal/xhoi)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下pd-l1h以及pd-l1l輕重鏈片段，連接入pcam35s的xbai/xhoi位點，生成植物雙元表達載體p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l；
lbandrb:ti質粒左右邊界；35s，具有菸草花葉病毒(tmv)5『utr的camv35s啟動子；nptii，用於卡那黴素抗性的編碼nptii基因的表達；nos3』，終止子；
圖3(a)示sds-page凝膠電泳結果；泳道1：pd-1重組抗體；泳道2：pd-l1重組抗體；
圖3(b)示非變性凝膠電泳結果；泳道3：pd-1重組抗體；泳道4：pd-l1重組抗體；
圖4示通過細胞實驗研究純化pd-1以及pd-l1抗體對人非小細胞肺癌(nsclc)細胞對的抑制。
具體實施方式
本發明公開了植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明通過實驗發現，植物系統尤其是生菜系統是更加經濟、高效的表達平臺，是一種快速的瞬時表達重組蛋白質的方法。本發明描述的真空農桿菌滲透方法簡單，快速，而且可以提高重組蛋白產量。生菜可以通過承受真空壓力而增加蛋白質產量，並允許每片葉子更完整的滲透。由於生菜易於生長並且可商業上大量生產，因此比其他瞬時表達植物，如菸草等更容易獲得並且更便宜，並且由於不需要複雜的特殊生產設備，成本可顯著降低。綜上所述，本發明可以利用生菜系統短時間內大規模生產pd-1以及pd-l1單克隆抗體。
本發明提供的植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用中所用原料及試劑均可由市場購得。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1植物瞬時表達載體的構建
為了提供外援蛋白在植物中的高效表達，將人pd-1重鏈(genbankaccession號：5dk3_b)，輕鏈，(genbankaccession號：5dk3_a)pd-l1重鏈(genbankaccession號：aao17823.1)，輕鏈，(genbankaccession號：4dke_l)蛋白序列反翻譯軟體(https://www.idtdna.com/codonopt)將其其密碼子優化為植物偏好的密碼子，由genescript公司(南京，中國)合成。在優化的pd-1重鏈序列，以及pd-l1輕重鏈序列5'末端分別加入xbal限制性酶切位點，在3'末端分別加入xhol位點。在pd-1輕鏈序列5'末端分別加入xmal限制性酶切位點，在3'末端分別加入xhol位點。並由genecript克隆到puc57載體中(圖1)，分別生成ppd-1h，ppd-1l,ppd-l1h和ppd-l1l克隆載體。基因片段通過kpnl/sacl分別從克隆載體中分離，並克隆到雙元植物載體，pcam35s，分別產生植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。將四種植物表達載體分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那黴素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d後，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白腖，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)並補充抗生素液體培養基(50mg/l卡那黴素)。將接種的培養物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養基測量od600值並調節至3.5～4.5。然後收集培養液，離心(4500轉速)10min。將農桿菌細胞重懸在滲透培養基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。
克隆獲得ppd-1h，ppd-1l，ppd-l1h和ppd-l1l基因片段(圖2a，b)，並且構建四種雙元植物表達載體p35s-pd-1h，p35s-pd-1l,p35s-pd-l1h和p35s-pd-l1l。在完成構建體後，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。滲透後，絕大多數生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區域外，其餘部分均在真空滲透4天後顯示淡黃褐色區域。
實施例2農桿菌介導的真空滲透
將製備好的含有p35s-pd-1h以及p35s-pd-1l農桿菌等量混勻至o.d.600為0.5；同樣將含有p35s-pd-l1h以及p35s-pd-l1l的農桿菌等量混勻至o.d.600為0.5。將培養懸浮液置於2l燒杯，並置於乾燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)並輕輕地旋轉於細菌懸浮液中，將乾燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，並且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態30-60秒。快速打開該系統以釋放壓力，使滲透液滲入組織內的空間。該過程重複2至3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴散明顯。然後將生菜組織從滲透液中輕輕取出，並用蒸餾水連續衝洗三次，然後轉移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4天。
實施例3蛋白質提取和分離
經農桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，並用體積比為1:1比例的提取緩衝液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機中高速勻漿1-2分鐘。將勻漿物調節至ph8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15分鐘以除去細胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，並在冰上搖動孵育60分鐘。通過離心機(10,000g)在4℃下再次分離15分鐘。將得到的上清液進行第二輪硫酸銨(70％)沉澱，冰上搖動懸浮60分鐘，再次在4℃下以10,000g離心15分鐘。然後，棄去上清液，將處理樣品沉澱蛋白質溶於5ml緩衝液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中並在4℃下儲存。
植物來源的重組蛋白質的下遊加工通常難於並且昂貴，因為纖維素細胞壁難以裂解以及次級植物代謝產物。我們用攪拌機攪拌勻漿，大大節省勻漿成本以及工藝。重組pd-1抗體以及pd-l1抗體經過變性凝膠sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約分別為23kda以及50kda條帶(圖3a)，符合pd-1以及pd-l1抗體輕重鏈的蛋白大小。在非變性的凝膠電泳中觀察到大約150kda(圖3b)的條帶，證明生菜重組輕重鏈成功的結合為抗體結構，符合pd-1以及pd-l1的抗體蛋白分子量。基於bradford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量大約為0.72mg/g。
實施例4sds-page凝膠電泳
收集從農桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質，取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩衝液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳。同樣，在非變性凝膠電泳中檢測抗體的親和程度。然後用考馬斯藍g250(biorad)染色後再次對凝膠進行拍照。
實施例5癌症細胞抑制實驗
人非小細胞肺癌nsclc細胞系a549細胞在補充有10％fbs(gibco，usa)，100u/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的rpmi-1640培養基(gibco，usa)中生長。所有細胞在37℃的5％co2加溼氣氛中培養，每天更新培養基，並使用0.25％胰蛋白酶每三天傳代細胞。通過胰蛋白酶消化收集a549細胞，並以1×106個細胞/ml的密度重懸浮，加入分別加入純化的10μgpd-1以及pd-l1抗體，72h後用膜聯蛋白v-螢光素異硫氰酸酯(fitc)和pi用於雙染以評估凋亡細胞的比例。
結果顯示，肺癌(nsclc)細胞對的抑制。通過加入純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養nsclc細胞，在72h的時間點檢查細胞生長結果表明，沒有任何處理的nsclc細胞生長良好。相比之下，使用純化的重組pd-1以及pd-l1抗體培養的細胞大部分消失(圖4)。這些結果表明，通過生菜系統瞬間表達的外源pd-1以及pdl-1抗體具有生物學活性並且可以殺死nsclc細胞。生菜系統是一種生產pd-1以及pd-l1抗體的合適的生物反應器。
實施例6
對照組：利用動物生產pd-1和pd-l1抗體；
實驗組1：本發明提供的植物生產pd-1和pd-l1抗體；
實驗組2：利用菸葉生產pd-1和pd-l1抗體；
表1pd-1以及pd-l1抗體
*示與對照組相比p≤0.05；**示與對照組相比p≤0.01；
#示與實驗組2相比p≤0.05；##示與實驗組2相比p≤0.01；
由表1可知，與對照組的動物系統相比，本發明提供的生菜瞬時表達pd-1和pd-l1抗體，極顯著(p≤0.01)縮短了生產周期，極顯著(p≤0.01)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產成本。
與實驗組2的菸葉系統相比，生菜瞬時表達pd-1和pd-l1抗體，顯著(p≤0.05)縮短了生產周期，顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產成本。
實驗組2與對照組相比，菸葉瞬時表達pd-1和pd-l1抗體比動物系統顯著(p≤0.05)縮短了生產周期，顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，顯著(p≤0.05)降低了生產成本。
綜合上述試驗結果表明，植物系統尤其是生菜系統是更加經濟、高效的表達平臺。能夠快速瞬時表達重組蛋白質，可以在短時間內大規模生產pd-1以及pd-l1單克隆抗體。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
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深圳惠升生物科技有限公司
植物作為宿主在表達pd-1抗體和/或pd-l1抗體中的應用
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