一種菸草及菸草製品中水溶性糖的檢測方法

2023-05-01 16:41:01 1

一種菸草及菸草製品中水溶性糖的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，它利用加速溶劑萃取提取菸草中的水溶性糖，再分別利用肟化-矽烷化與糖氰化-乙醯化二種衍生化方法，肟化-矽烷化產物直接氣相色譜-火焰離子化檢測器測定；糖氰化-乙醯化產物利用超聲輔助-分散液液微萃取進行提取後再進行氣相色譜-火焰離子化檢測器測定。本發明與其它分析菸草中的水溶性糖的方法相比，具有簡單快速，重現性好，靈敏度高，以及對水溶性糖分離能力好的特點，能對菸草中的水溶性糖進行準確定量。
【專利說明】一種菸草及菸草製品中水溶性糖的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於菸草化學成分的測定方法【技術領域】，具體涉及一種菸草及菸草製品中 水溶性糖的測定方法。

【背景技術】
[0002] 水溶性糖是菸草生長發育過程中重要的初級代謝產物，它們不僅與菸草的光合與 呼吸作用直接相關，還直接影響著菸草的品質與質量。水溶性糖的含量高低與菸草的香味、 刺激性及焦油的產生關係密切，例如，水溶性的還原糖與氨基化合物能燃燒產生呋喃類美 拉德反應產物，能有效改善菸草的品質，減少木質雜氣，增加煙香。此外，高含量糖的菸草也 會導致主流煙氣中有毒及致癌物質的增加，主要有甲醛、乙醛、丙酮和丙烯醛等。據研究報 道，乙醛還能夠增加吸菸者對尼古丁的依耐性。不同品種、部位、產地的菸草中水溶性糖含 量的不同，也導致了菸葉配伍性的顯著差異。因此，建立菸葉中水溶性糖的檢測方法，對於 菸葉生產、菸葉品質評價、菸葉配伍性及安全性研究等具有非常重要的指導意義。
[0003] 目前還沒有一套簡單，快速和對環境綠色友好的關於菸草及菸草製品中水溶性糖 的測得方法。建立一套簡單，快速、對環境綠色友好且準確的方法以提高樣品檢測通量，減 少環境汙染是非常必要的。
[0004] 文獻調研表明：菸草中水溶性糖的提取及淨化方法主要為振蕩提取，超聲提取和 固相萃取淨化，但振蕩提取與超聲提取都存在提取時間長，溶劑消耗大等缺陷，從而導致樣 品檢測通量不高，環境汙染較大。此外，水溶性糖的固相萃取淨化也大大增加了樣品的檢測 成本。
[0005] 菸草中水溶性的檢測方法主要分為兩大類，第一類為非衍生化方法：該方法主要 利用液相色譜-蒸發光散射檢測器和離子色譜-脈衝安培檢測器進行檢測，由於水溶性糖 的結構非常相似，導致其在液相色譜柱和離子色譜柱上不能基線分離，從而影響定量。第二 類為衍生化方法：該方法主要利用氣相色譜進行檢測，氣相色譜具有非常高的理論塔板數， 能順利分離各種結構非常相似的水溶性糖。但通過對以往文獻的調研表明：菸草中水溶性 糖的衍生化檢測主要存在三個問題1)由於水溶性糖(果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖）的結 構非常相似，沒有單獨的一種衍生化方法能較好的將其基線分離；2)衍生化方法的反應時 間較長；3)衍生化後的後處理較複雜，需要多步驟的溶劑萃取。因此，有必要開發一種簡單， 快速，準確和對水溶性糖分離能力好的檢測方法。


【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題：提供一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，該 方法具有簡單快速，重現性好，靈敏度高，以及對水溶性糖分離能力好的特點，能對菸草中 的水溶性糖進行準確定量，可以克服現有技術的不足。
[0007] 本發明技術方案： 一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，它包括以下步驟： A、 菸草及菸草製品中水溶性糖的提取：將菸草樣品粉碎後過80-100目篩後，向5mL萃 取池中放入纖維素濾膜，再放入適量硅藻土，稱取200mg菸草樣品粉末按照1: 2與硅藻土 混合後放入萃取池，加入內標溶液進行加速溶劑萃取；將提取溶劑轉移至10mL容量瓶中， 再用乙醇：水（1:1V/V)定容到10mL後混勻，分別取二個500yL提取溶液至2mL色譜 瓶和10mL離心管中，38 - 40°C條件下氮氣吹乾進行衍生化； B、 菸草及菸草製品中水溶性糖的衍生化：（1)肟化-矽烷化：將2mL色譜瓶中的吹乾 殘留物先進行肟化反應，再將肟化產物進行矽烷化，反應後直接用氣相色譜-火焰離子化 檢測器進行檢測；（2)糖氰化-乙醯化：將10mL離心管中的吹乾殘留物先進行糖氰化反 應，再將糖氰化產物進行乙醯化，反應結束後用超聲輔助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙 醯化產物； C、 菸草及菸草製品中水溶性糖的衍生化產物的提取：向氰化-乙醯化產物中加入氯化 鈉水溶液，再加入提取溶劑進行提取，提取結束後，用100UL微量進樣針吸取離心管中的 沉澱相，將其轉移至250yL微量進樣瓶中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測； D、 菸草及菸草製品中水溶性糖的色譜檢測條件：氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜條 件為：色譜柱為TR-1柱，長度60m，內徑0.32mm，膜厚0.25Mm，載氣：高純氮氣，載氣流 量：1.5mL/min，進樣口與檢測器溫度為260°C，進樣量為1ML，分流進樣，分流比為7:1，檢 測器氣體流量為乾燥空氣：350mLmirT1，高純氫氣：35mLmirT1和尾吹氣高純氮氣30mL min-1;柱溫升溫程序為80°C保持2min，5°Cmin_1升到240°C保持5min，再以20°CmirT1 升到280°C保持15min，一共運行56min; E、 菸草及菸草製品中水溶性糖的定性及定量方法：分別採用保留時間和內標法進行定 性和定量分析。
[0008] 上述內標溶液為80iiL濃度為25mgmL4的苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷乙醇： 水（1:1V/V)溶液。
[0009] 上述加速溶劑萃取的條件為：萃取溶劑為乙醇：水（1:1V/V)、壓力為1500psi、 溫度為80°C、靜態萃取時間為5min、靜態循環次數為2次、衝洗體積為0%，吹掃時間為80 So
[0010] 上述肟化條件為加入300ML濃度為25mgmr1的鹽酸甲羥胺(吡啶溶解)，80°C肟 化 10min。
[0011] 上述矽烷化條件為加入1〇〇MLN，0-雙（三甲基矽烷基）乙醯胺(含1%三甲基氯 矽烷)，80°C矽烷化10min。
[0012] 上述糖氰化反應的條件為加入300ML濃度為25mgmr1的鹽酸羥胺(吡啶：N-甲 基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V溶解)，80°C糖氰化5min，乙醯化條件為加入500yL乙酸酐溶 液，常溫反應5min。
[0013] 上述超聲輔助-分散液液微萃取的條件為加入2. 3mLll%w/v的氯化鈉水溶液， 再加入44yL三氯甲烷，渦旋混勻1min後放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5 min,微萃取後放入離心機中4000rpm離心5min。
[0014] 上述內標法定量的方法為果糖採用肟化-矽烷化方法進行定量，木糖、甘露糖、葡 萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10種水溶性糖採用糖氰化-乙醯 化方法進行定量。
[0015] 本發明的有益效果： 本發明建立了一種以加速溶劑萃取提取菸草中的水溶性糖，再分別以肟化-矽烷化和 糖氰化-乙醯化進行衍生化，衍生化後肟化-矽烷化產物直接用氣相色譜-火焰離子化檢 測器進行檢測，糖氰化-乙醯化產物利用超聲輔助-分散液液微萃取進行提取後採用氣相 色譜-火焰離子化檢測器進行檢測的方法。同時本發明為了獲得超聲輔助-分散液液微萃 取中最佳的富集因子和回收率，分別採用了部分析因設計、Doehlert設計和渴望函數進行 方法優化。與現有技術相比，本方法的優點是：採用加速溶劑萃取提取的方法減少了有機溶 劑的使用和提取時間；採用二種衍生化方法的方法，完全分離了 11種水溶性糖；採用吡啶： N-甲基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V為糖氰化-乙醯化的溶劑，大大減少了衍生化的反應時間； 採用超聲輔助-分散液液微萃取的方法，減少了有機溶劑的使用及提取的時間，提高了方 法的靈敏度。本發明具有簡單快速，重現性好，靈敏度高，以及對水溶性糖分離能力好的優 點，能對菸草中的水溶性糖進行準確定量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1本發明中菸草中水溶性糖的檢測方法流程圖； 圖2中A為果糖肟化-矽烷化後的菸草樣品色譜圖；B為果糖肟化-矽烷化後的標準 樣品色譜圖；1為果糖；IS為內標苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷； 圖3中A為10種水溶性糖糖氰化-乙醯化後的菸草樣品色譜圖；B為10種水溶性糖 糖氰化-乙醯化後的標準樣品色譜圖；2木糖、3甘露糖、4葡萄糖、5半乳糖、6肌醇、7山梨 醇、8麥芽糖、9乳糖、10蔗糖、11蜜二糖；IS內標苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷。 具體實施方案
[0017] 本發明通過以下實例對上述方法進一步進行描述，但並不限制本發明。
[0018] 實施例1 本發明菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法包括如下步驟： (1)將菸草樣品粉碎後過80-100目篩後，向5mL萃取池中放入纖維素濾膜，再放入適 量硅藻土，稱取200mg菸草粉末按照1: 2與硅藻土混合後放入萃取池，加入80iiL濃度 為25mgml/1的苯基-beta-D-批喃葡萄糖苷內標後進行加速溶劑萃取。其中加速溶劑萃 取條件為：萃取溶劑為乙醇：水（1:1V/V)、壓力為1500psi、溫度為80°C、靜態萃取時間為 5min、靜態循環次數為2次、衝洗體積為0%和吹掃時間為80s。
[0019] (2)將提取溶劑轉移至10mL容量瓶中，再用乙醇：水（1:1V/V)定量到10mL後 混勻，分別取二個500yL提取溶液至2mL色譜瓶和10mL離心管中，38 - 40°C條件下氮 氣吹乾進行衍生化。
[0020] (3)將2mL色譜瓶中的吹乾殘留物進行肟化-矽烷化：加入300ML濃度為25mg mL-1的鹽酸甲羥胺(批啶溶解)，80°C肟化10min，再加入100MLN，0-雙（三甲基矽烷基） 乙醯胺(含1%三甲基氯矽烷)，80°C矽烷化10min，反應後用氣相色譜-火焰離子化檢測器 進行檢測。
[0021] (4)將10mL離心管中的吹乾殘留物進行糖氰化-乙醯化：加入300ML濃度為 25mgmL4的鹽酸羥胺(吡啶：N-甲基咪唑：甲醇2:1:1V/V/V溶解)，80°C糖氰化5min，再 加入500yL溶液，常溫乙醯化5min，反應結束後用超聲輔助-分散液液微萃取提取糖氰 化-乙醯化產物。
[0022] (5)加入2. 3mLll%w/v的氯化鈉水溶液，再加入44iiL三氯甲燒，渦旋混勻1 min後放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5min，萃取後放入離心機中4000rpm離 心5min，用100yL微量進樣針吸取離心管中的沉澱相，將其轉移至250yL微量進樣瓶 中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測。
[0023] (6)本發明中果糖採用肟化-矽烷化方法進行定量，其它10種水溶性糖(木糖、甘 露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖)採用糖氰化-乙醯化方法 進行定量。
[0024] 本發明中氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜分析條件為：色譜柱為TR-1柱，長度 60m，內徑0.32mm，膜厚0.25Mm，載氣：高純氮氣，載氣流量：L5mL/min，進樣口與檢測 器溫度為260°C，進樣量為1ML，分流進樣，分流比為7:1，檢測器氣體流量為乾燥空氣：350 mLmirT1，高純氫氣：35mLmirT1和尾吹氣高純氮氣30mLmin'柱溫升溫程序為80°C保 持 2min，5°Cmin_1 升到 240°C保持 5min，再以 20°Cmin_1 升到 280°C保持 15min，一 共運行56min。
[0025] 配製相應濃度的母液，然後按照對應的衍生化方法將母液混合併稀釋成5個濃度 梯度的混合標樣分別進行衍生化並提取，再進行氣相色譜-火焰離子化檢測器分析，並以 目標化合物峰面積與內標物峰面積的比為縱坐標（Y)，目標化合物量與內標量（100呢）的 比值為橫坐標（X)進行回歸分析，得到回歸方程及相關參數，將最低濃度的標準溶液按照信 噪比（S/N=3)為3計算方法的最低檢測限（L0D)，同時向菸草中添加兩個濃度梯度的水溶性 糖後進行提取，對方法的回收率進行評價，重複5次，從而對方法的精密度（RSD)進行評價。 結果見表1。

【權利要求】
1. 一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：包括以下步驟： A、 菸草及菸草製品中水溶性糖的提取：將菸草樣品粉碎後過80-100目篩後，向5 mL萃 取池中放入纖維素濾膜，再放入適量硅藻土，稱取200 mg菸草樣品粉末按照1: 2與硅藻土 混合後放入萃取池，加入內標溶液進行加速溶劑萃取；將提取溶劑轉移至10 mL容量瓶中， 再用體積比為1:1的乙醇和水的溶液定容到10 mL後混勻，分別取二個500 y L提取溶液 至2 mL色譜瓶和10 mL離心管中，38 - 40°C條件下氮氣吹乾進行衍生化； B、 菸草及菸草製品中水溶性糖的衍生化：（1)肟化-矽烷化：將2 mL色譜瓶中的吹乾 殘留物先進行肟化反應，再將肟化產物進行矽烷化，反應後直接用氣相色譜-火焰離子化 檢測器進行檢測；（2)糖氰化-乙醯化：將10 mL離心管中的吹乾殘留物先進行糖氰化反 應，再將糖氰化產物進行乙醯化，反應結束後用超聲輔助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙 醯化產物； C、 菸草及菸草製品中水溶性糖的衍生化產物的提取：向氰化-乙醯化產物中加入氯化 鈉水溶液，再加入提取溶劑進行提取，提取結束後，用100 UL微量進樣針吸取離心管中的 沉澱相，將其轉移至250 y L微量進樣瓶中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測； D、 菸草及菸草製品中水溶性糖的色譜檢測條件：氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜分 析條件為：色譜柱為TR-1柱，長度60 m，內徑0.32 mm，膜厚0.25 Mm，載氣：高純氮氣，載氣 流量：1.5 mL/min，進樣口與檢測器溫度為260°C，進樣量為1 ML，分流進樣，分流比為7:1， 檢測器氣體流量為乾燥空氣：350 mL mirT1，高純氫氣：35 mL mirT1和尾吹氣高純氮氣30 mL min-1;柱溫升溫程序為80 °C保持2 min，5 °C min_1升到240°C保持5 min，再以20 °C min-1 升到 280°C保持 15 min，一共運行 56 min ; E、 菸草及菸草製品中水溶性糖的定性及定量方法：分別採用保留時間和內標法進行定 性和定量分析。
2. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述內標溶液為80 y L濃度為25 mg mL4，以及體積比例為1:1的苯基-beta-D-吡喃葡 萄糖苷乙醇：水溶液。
3. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述加速溶劑萃取的條件為：萃取溶劑為體積比例為1:1的乙醇：水溶液、壓力為1500 psi、溫度為80°C、靜態萃取時間為5 min、靜態循環次數為2次、衝洗體積為0%，吹掃時間為 80 s〇
4. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述I虧化條件為加入300 ML濃度為25 mg mL4的鹽酸甲輕胺，80°C|虧化10 min。
5. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述矽烷化條件為加入100 ML N，0-雙乙醯胺，80°C矽烷化10 min。
6. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述糖氰化反應的條件為加入300 ML濃度為25 mg mL4的鹽酸羥胺，80°C糖氰化5 min， 乙醯化條件為加入500 ii L乙酸酐溶液，常溫反應5 min。
7. 根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述超聲輔助-分散液液微萃取的條件為加入2. 3 mLll% w/v的氯化鈉水溶液，再加入44 UL三氯甲烷，渦旋混勻1 min後放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5 min，微萃取 後放入離心機中4000 rpm離心5 min。
8.根據權利要求1所述的一種菸草及菸草製品中水溶性糖的測定方法，其特徵在於：所述內標法定量的方法為果糖採用肟化-矽烷化方法進行定量，木糖、甘露糖、葡萄糖、半 乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10種水溶性糖採用糖氰化-乙醯化方法進 行定量。
【文檔編號】G01N30/02GK104458934SQ201410579991
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】蔡凱, 趙會納, 雷波, 潘文杰, 向章敏 申請人:貴州省菸草科學研究院