甲烷氧化菌的培養方法
2023-05-02 03:34:36 4
專利名稱：甲烷氧化菌的培養方法
技術領域：
本發明涉及微生物的培養方法，特別是涉及一種甲烷氧化菌的快速培養方法。
背景技術：
甲烷氧化菌是自然界中一類非常特殊的微生物，它以甲烷為唯一的碳源及能源。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以廣泛地應用於以甲烷為原料的化工產品(天然氣或沼氣等)的大規模工業化生產中，也可以應用於環境中有機汙染物的治理，甚至可以用來有效地預防煤礦中的瓦斯氣體爆炸。一般情況下，由於甲烷在水溶液中的溶解度較低，導致甲烷氧化菌生長速率慢、所得細胞濃度低，成為限制甲烷氧化菌工業化應用的瓶頸。提高氣液傳質是強化甲烷氧化菌生長和甲醇生產的關鍵技術之一。因此，如何強化氣液傳質，提高氣液傳質速率，是實現甲烷氧化菌的高密度細胞培養首先需要解決的問題。傳統的解決辦法是增加氣速和攪拌速率。但增加氣速和攪拌速率，一方面可導致大量的泡沫生成，從而降低反應器使用效率；另一方面氣速和攪拌速率的增加必然增大動力消耗，增加操作成本。和一般好氧微生物細胞的培養不同，甲烷氧化菌的細胞培養過程，不僅需要空氣或氧氣，而且需要甲烷。甲烷與空氣或氧氣的混合比例超過一定範圍時具有爆炸危險，而且，增大氣流速度必然導致氣體的大量循環，且工藝複雜，動力消耗增加。
傳統的甲烷氧化菌的固體平板培養法操作複雜，培養時間長。不僅需要每天換氣，而且培養到菌落出現一般需4-6周的時間，且在反覆地換氣過程中又極易造成雜菌的汙染，因此迫切需要一種快速、簡便的甲烷氧化菌的培養方法。
研究表明向培養基中添加石蠟油或脂肪酸可以提高氣液傳質，加快甲烷氧化菌的生長，但其缺點有二一是這些有機溶劑在以後的操作中很難分離去除；二是這些有機溶劑本身可以做為雜菌生長的碳源，因而易於引起雜菌汙染。
發明內容
本發明的目的是提供一種可顯著提高甲烷氧化菌生長速率的培養方法。
本發明所提供的甲烷氧化菌的快速培養方法，是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加經滅菌的橡膠材料，或將經滅菌的橡膠材料噴塗於甲烷氧化菌培養容器的內層。其它培養條件與常規培養方法相同。
橡膠材料的選擇是多種多樣的，如丁苯橡膠、順丁橡膠、氯丁橡膠、丁基橡膠、丁腈橡膠、矽橡膠、氟橡膠和聚氨酯等中的一種或多種。
向培養基中添加橡膠材料的方式為1)將橡膠材料直接添加入培養基中；2)先將橡膠材料包附於其它具有一定體表面積的固體材料的外層，再將該固體材料添加入培養基中。
所述方式1)中的橡膠材料和方式2)中表面包附有橡膠材料的固體材料在培養基中的體積百分含量為0.1-80％。
所述橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料為片狀、塊狀、粒狀或勻漿狀。
所述片狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的面積(每片)為0.5-25cm2。
所述塊狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的體積(每塊)為0.2-1cm3。
所述粒狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的粒徑(每粒)為500nm-0.5cm。
所述勻漿狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的粒度(每粒)為1-3000μm。
為獲得更好的培養效果，所述橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料上還設有若干孔，以增加其比表面積。
橡膠對甲烷氧化菌生長的促進作用與橡膠材料的比表面積有關，加入的橡膠材料越多，比表面積越大，則對甲烷氧化菌的促進作用越明顯。
可按常規方法對橡膠材料進行滅菌，如在121℃下加熱15-25分鐘。
本發明提供了一種甲烷氧化菌的快速培養方法。該方法是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加經滅菌的橡膠材料，因能橡膠夠吸附甲烷，使得該材料的表面呈現出較高的甲烷濃度，且在培養基中甲烷氧化菌可以吸附於該固體表面生長，從而表現出很高的生長速度。試驗證明，與常規培養方法相比，利用釐米級的片狀橡膠材料可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，小顆粒狀的橡膠材料則可成百倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，最高可達100倍。該方法不僅能促進甲烷氧化菌的生長，而且培養結束後橡膠材料與培養液很容易分開，且不會對環境造成危害，此外，橡膠材料本身是高聚物，難於被大多數微生物利用，因而不易引起雜菌汙染。本發明將在甲烷氧化菌及其相關產品的工業化生產中發揮巨大作用，具有廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
圖1為向培養基中添加不同量橡膠的甲烷氧化菌的生長曲線圖2為甲烷氧化菌專屬探針與培養菌體的螢光原位雜交結果圖3為向培養基中添加不同比表面積的橡膠材料的甲烷氧化菌的生長曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百分比濃度，所有培養基中的溶劑均為去離子水。
NMS培養基配方每升培養基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素貯存液2mL，1mmol/L H2SO40.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固體培養基再添加1.5％的瓊脂)，pH 7.0。
微量元素貯存液的配方為每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
實施例1、甲烷氧化菌的種子培養一、甲烷氧化菌單菌落的獲得用滅菌的接種環挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用劃線的方法將其接種於NMS平板固體培養基表面，每天用注射器通過0.2μ的過濾器向培養皿中加入5-10毫升的甲烷氣體，在30℃下培養四周後，平板上有明顯的菌落產生。
二、甲烷氧化菌種子液的獲得1)取50毫升的培養瓶，裝入NMS液體培養基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘；2)挑取一個步驟一在固體平板上長出的甲烷氧化菌單菌落，將其接種到NMS液體培養基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-20毫升甲烷氣體，在30℃、150rpm下振蕩培養四周，培養基的OD600值約為0.3後(混濁狀)，得到甲烷氧化菌種子液。
實施例2、檢測橡膠及其不同添加量對甲烷氧化菌生長速率的影響1)取4個50毫升的培養瓶，分別裝入NMS液體培養基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘；2)向上述4個培養瓶中依次加入約1cm2見方的不同量(0g(對照)、1g、2g、3g)的丁基橡膠片，1毫升種子液和20mL的甲烷，然後在30℃、150rpm下振蕩培養，同時每隔半天記錄一次菌液OD600值。
菌體的生長曲線如圖1所示，與對照相比，加入橡膠後，甲烷氧化菌OB3b的生長速率得到了顯著提高，且生長速率與橡膠的添加量成正比。
實施例2、甲烷氧化菌OB3b的鑑定根據甲烷氧化菌OB3b的16s rRNA的特徵序列設計併合成探針並用螢光進行標記，探針序列為5』FAM-TGGAGATTTGCTCCGGGT-3』，對實施1經橡膠輔助培養的菌體進行固定後，按常規方法進行螢光原位雜交，雜交結果如圖2所示(FAM螢光原位雜交前的觀察結果，DAPI螢光原位雜交後的觀察結果)，雜交率為100％，表明獲得的菌體全部為甲烷氧化菌。
實施例3、檢測不同比表面積的橡膠材對甲烷氧化菌生長速率的影響1)用普通的挫刀處理氟橡膠材料，將橡膠材料製成表面具有多孔的直徑小於1mm的小顆粒，約1cm2見方的橡膠片以及邊長3cm的立方塊；2)取4個100毫升的血清瓶，分別加入25毫升的NMS培養基後，其中3個依次加入7.5克步驟1)中不同大小及形狀的氟橡膠材料，以不添加橡膠材料的為對照，在121℃下滅菌20分鐘；3)向上述血清瓶中依次加入2.5毫升實施例1獲得的種子液後，每天通入20-30毫升的甲烷氣體，並在140rpm、30℃下進行培養，同時每隔5小時記錄一次菌液0D600值。
菌體的生長曲線如圖3所示，與對照相比，加入橡膠後，甲烷氧化菌OB3b的生長速率得到了顯著提高，且小顆粒狀的多孔橡膠材料對甲烷氧化菌的促生效果尤為顯著，菌體的生長速率較對照提高了約100倍，表明甲烷氧化菌生長速率與橡膠材料的比表面積成正比。
權利要求
1.一種甲烷氧化菌的培養方法，是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加經滅菌的橡膠材料，或將經滅菌的橡膠材料噴塗於甲烷氧化菌培養容器的內層。
2.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於所述橡膠材料為丁苯橡膠、順丁橡膠、氯丁橡膠、丁基橡膠、丁腈橡膠、矽橡膠、氟橡膠和聚氨酯中的一種或多種。
3.根據權利要求1或2所述的培養方法，其特徵在於所述向培養基中添加橡膠材料的方式為1)將橡膠材料直接添加入培養基中；2)先將橡膠材料包附於其它固體材料的外層，再將該固體材料添加入培養基中。
4.根據權利要求3所述的培養方法，其特徵在於所述方式1)中的橡膠材料和方式2)中表面包附有橡膠材料的固體材料在培養基中的體積百分含量為0.1-80％。
5.根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料為片狀、塊狀、粒狀或勻漿狀。
6.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於所述片狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的面積為0.5-25cm2。
7.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於所述塊狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的體積為0.2-1cm3。
8.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於所述粒狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的粒徑為500nm-0.5cm。
9.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於所述勻漿狀橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料的粒度為1-3000μm。
10.根據權利要求5所述的培養方法，其特徵在於所述橡膠材料和表面包附有橡膠材料的固體材料上設有若干孔。
全文摘要
本發明公開了一種甲烷氧化菌的培養方法。該方法是在常規培養甲烷氧化菌的培養基中添加經滅菌的橡膠材料。所述橡膠材料為丁苯橡膠、順丁橡膠、氯丁橡膠、丁基橡膠、丁腈橡膠、矽橡膠、氟橡膠和聚氨酯中的一種或多種。與常規培養方法相比，添加釐米級的片狀橡膠材料可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，添加小顆粒狀的橡膠材料則可成百倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，最高可達100倍。該方法不僅能促進甲烷氧化菌的生長，而且培養結束後橡膠材料與培養液很容易分開，不會對環境造成危害，此外，橡膠材料本身是高聚物，難於被大多數微生物利用，因而不易引起雜菌汙染。本發明將在甲烷氧化菌及其相關產品的工業化生產中發揮巨大作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N11/08GK1844348SQ20061007453
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月27日 優先權日2006年4月27日
發明者緱仲軒, 邢新會, 江皓, 吳昊, 韓冰, 王磊 申請人:清華大學