轉基因植物及其製品的檢測方法
2023-05-01 21:16:36 1
專利名稱：轉基因植物及其製品的檢測方法
技術領域：
本發明屬於轉基因植物安全管理技術領域和生物技術領域，具體涉及轉基因植物及其製品的快速檢測方法。
背景技術：
1、轉基因植物的安全管理轉基因植物(transgenic plant)是指人為地通過一定方法將外源基因轉移到植物的基因組中，並遺傳、表達的植物變異體，被轉入植物基因組的外源基因稱為轉化基因(transgene)。
1983年人類首次報導轉基因菸草誕生，到2000全球轉基因植物種植面積達4420萬公頃。轉基因植物從誕生之日起，就有人擔心它們可能存在的生態和食品安全問題，這些擔心曾受到一些研究結果的支持。為了加強對轉基因生物的管理，避免其可能帶來的生態、食品威脅，保護消費者權益，保證轉基因植物研究正常發展，許多國際組織、國家和地區都制定了相應的法律、法規。這些法律、法規的實施，首先要求相關職能部門、研究機構在實施管理時，對有關植物及其產品進行檢測、鑑定。建立一套通用的，快速、準確、經濟、方便地檢測鑑定技術，是當前國內外的一個研究熱點。
2、轉基因植物檢測技術的發展和存在的問題迄今，轉基因植物的檢測主要限於目的基因檢測，報告或標記基因檢測。目的基因即賦予植物有用性狀的功能基因，如抗病、抗蟲、抗除草劑基因等，目前在研的目的基因數以萬計，而且每天都在增加，涉及植物種類超過100種。截止2001年12月，僅美國FDA批准產業化的51種轉基因植物所含目的基因就超過65種；截止1999年12月，我國農業部共批准150多項轉基因植物進入商品化生產、環境釋放或中間試驗，涉及基因約103種。報告或標記基因是為了方便篩選和鑑別轉基因植物而採用的植物基因組沒有的外源基因，常用的報告或標記基因約20種，如nos、NPTII、GUS、GFP、bar基因等。在具體檢測方法上，又有四個層次(1)DNA的分子雜交(Southern雜交)、聚合酶鏈式反應(PCR)等分析技術，用以探測目標基因存在狀況，PCR技術因簡便易行而用得最多。但過去人們主要針對目的基因、報告或標記基因，其局限性是，如果一個具體植物不知道研究者導入何種基因，如果一種製品含有多種植物成分，用上述方法將帶有很大的盲目性，要花較長的時間才能確定它(們)是否轉基因植物或製品。
(2)RNA的分子雜交(Northern雜交)、反轉錄PCR(RT-PCR)等分析技術，用以探測目標基因在RNA水平的表達狀況，其缺陷與上述相同，而且檢測樣品必需是鮮活的植物材料，無法檢測乾枯、死亡材料和以植物為原料各種製品。
(3)蛋白質的ELISA、Western blot等分析技術，利用抗體-抗原之間的免疫反應來分析基因在蛋白質水平上的表達狀況，其不足是，如果一個具體植物不知道研究者導入何種基因，如果一種製品含有多種植物成分，將難以確定選用何種基因產物的抗體進行檢測。
(4)基因功能分析技術，一些轉化基因產物(酶或蛋白質)的功能可用轉基因植物的活體、活組織、蛋白粗提液與底物反應來觀察；而另一些基因編碼抗生素抗性、除草劑抗性等，則可以通過簡單的種子萌發等活體試驗加以分析。不難看出，它們都必須用活體或活組織，且在結果的判斷上容易出現誤差。
國內外均未見利用T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設計合成引物進行PCR檢測轉基因植物及其製品的報導。雖有幾篇利用CaMV 35S啟動子檢測轉植物及其製品的報導，但對於易感染CaMV的十字花科植物，單獨使用CaMV 35S啟動子檢測有可能造成重要誤差。
發明內容
本發明的目的是提供一種轉基因植物及其製品的檢測方法。該方法根據轉基因植物最普遍的特徵序列T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設計合成引物，進行PCR檢測轉基因植物及其製品，從而克服上述現有檢測方法所存在的問題。
為了獲得轉基因植物，通常將外源基因構建到由農桿菌(Agrobacterium)Ti質粒(tumer-inducingplasmid)或Ri質粒(root-inducing plasmid)衍生而來的載體T-DNA區構成植物表達載體，在這種載體上總是存在25bp的T-DNA左右邊界序列(right border sequence，RB；left border sequence，LB)，以及與外源基因配合使用的CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列，植物表達載體通過農桿菌共培養法(co-cultivation)、基因槍法(gene gun，particle bombardment)等方法導入植物細胞，使外源基因整合到植物基因組並在轉基因植物中表達。
本發明方法是採用常規方法提取被測樣品的DNA，根據T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設計合成一對或多對引物，進行PCR，得到相應的DNA擴增產物或擴增產物的信號。
本發明方法具體包括以下步驟(1)合成2條以上引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物，長度18-25nt，其它為CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列中任意一段或多段序列，長度≥18nt；(2)取T-DNA左右邊界序列引物，與一條或多條其它引物配成一對或多對PCR引物，按常規方法對樣品DNA進行PCR擴增反應，以pBI121或pCAMBIA1300等質粒DNA作正對照，以未轉基因植物或製品DNA作負對照，PCR反應條件是94℃預變性5分鐘，反應25-35循環，每循環包括94℃變性1分鐘，45-65℃退火1分鐘，72℃延伸反應30秒-10分鐘，循環結束後，追加72℃延伸反應5分鐘；(4)PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察到大小50-10000bp的DNA擴增片段。
按照上述本發明方法，還可進行實時定量PCR，具體是在步驟(2)的PCR反應管中加入與雙鏈DNA特異結合的SYBR螢光染料，或者特異的TaqMan螢光探針；PCR擴增產物通過螢光掃描儀觀測到相應螢光信號，或者按步驟(3)觀察結果。
按照上述本發明方法，還可進行PCR-ELISA，具體是在步驟(1)中，用生物素標記合成的引物；PCR擴增產物與固定在微板上的鏈親和素(streptavidin)-蛋白A結合，再與鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶標生物素抗體進行ELISA反應，用微板讀數儀(酶標儀)讀取405-410nm的吸光值，或者按步驟(3)觀察結果。
本發明方法具有以下有益效果(1)廣泛性。T-DNA左右邊界序列、nos啟動子和nos終止序列存在於絕大多數轉基因植物中，CaMV35S啟動子和/或CaMV 35S polyA存在於70％以上的轉基因植物中，因而具有最廣泛代表性，適用於當前絕大多數轉基因植物及其製品的檢測。
(2)快速性。大多數檢測需時約2小時至2天，能保證快速檢測的需要。
(3)準確性。上述幾種序列都是轉基因植物的特徵序列，檢測結果準確性強。
(4)靈敏性。只需用極少量樣品，如一粒種子、一塊組織、一片葉子，甚至少到ug(微克)級的樣品。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步說明。
實施例1利用T-DNA左右邊界序列和nos終止序列引物進行PCR檢測轉基因番木瓜如前面所述，T-DNA左右邊界序列、nos終止序列存在於絕大多數轉基因植物中，故用這兩種序列合成引物進行PCR，適用於當前絕大多數轉基因植物及其製品的檢測。我們在過去的工作中獲得了轉番木瓜環斑病毒(PRV)複製酶(RP)基因的抗病毒番木瓜品系，用PCR方法對其進行了轉基因檢測。
(1)用CTAB法提取轉基因番木瓜葉片DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物(第4-23nt)5』-caggatatattggcgggtaa-3』，另一條為nos終止序列引物(nos終止序列第81-100nt)5』-catgcttaacgtaattcaac-3』。
(3)按常規方法對樣品DNA進行PCR擴增反應，以pRPTW質粒DNA(含T-DNA左右邊界序列、PRV RP基因、nos終止序列等)作正對照，以未轉基因的番木瓜DNA作負對照，PCR反應條件是94℃預變性5分鐘，反應30循環，每循環包括94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸反應4分鐘，循環結束後，追加72℃延伸反應5分鐘。
(5)PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，樣品和正對照都有1條大小約2500bp的DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段。結果與設計相符，表明相關序列和RP基因已整合進番木瓜基因組。
實施例2利用T-DNA左右邊界序列和CaMV35S啟動子引物進行實時定量PCR檢測轉基因菸草CaMV 35S啟動子具有植物強啟動子功能，無器官特異性，因而廣為採用，迄今70％以上的轉基因植物採用這種啟動子。但少數十字花科植物易感染CaMV，故在檢測這類植物及其製品時，如單獨使用CaMV 35S啟動子引物，可能造成重要誤差，利用分別來自T-DNA左右邊界序列和CaMV 35S啟動子的兩個引物進行PCR則可克服這一問題。採用實時定量PCR法對我們獲得的轉基因抗草甘膦菸草進行了檢測。
(1)用CTAB法提取轉基因菸草葉片DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物(第4-23nt互補序列)5』-ttacccgccaatatatcctg-3』，另一條為CaMV35S啟動子引物(第325-344 nt)5』-atggtggagcacgacactct-3』。
(3)按常規方法對樣品DNA進行PCR擴增反應，以pM12質粒DNA(含T-DNA左右邊界序列、CaMV35S啟動子序列、EPSPS突變體基因等)作正對照，以未轉基因的菸草DNA作負對照，向反應管中加入與雙鏈DNA特異結合的SYBR螢光染料，反應在ABI Prism7000型螢光定量PCR儀中進行，PCR反應條件是94℃預變性5分鐘，反應35循環，每循環包括94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸反應2分鐘，循環結束後，追加72℃延伸反應5分鐘。
(4)隨著循環數增加，轉基因菸草和正對照PCR擴增產物螢光信號不斷增強，30循環時螢光強度達到最強，負對照測不到螢光；PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，轉基因菸草和正對照都有1條大小約2000bp DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段，結果與設計相符，表明相關序列和EPSPS突變體基因已整合進菸草基因組。
實施例3利用CaMV35S啟動子和nos終止序列引物進行PCR-ELISA檢測轉基因番茄我們將變形鏈球菌表面蛋白PAC(Streptococcus mutans surface protein)的唾液粘附區(Saliva-binding region，SBR)基因及其與霍亂弧菌B亞單位(Cholera toxin B subunit，CTB)組成嵌合基因，共培養轉化番茄，獲得轉基因植株，用PCR-ELISA方法對其進行了轉基因檢測。
(1)用常規CTAB法提取轉基因番茄果實DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為CaMV35S啟動子引物(第61-70nt，5』端連接生物素)5』-biotin-cagcaggtctcatcaagacg-3』，另一條為另一條為nos終止序列引物(nos終止序列第81-100nt互補序列)5』-gttgaattacgttaagcatg-3』。
(3)按常規方法對樣品DNA進行PCR擴增反應，以pROSB質粒DNA(含CaMV35S啟動子、SBR-CTB嵌合基因、nos終止序列等)作正對照，以未轉基因的番茄DNA作負對照，PCR反應條件是94℃預變性5分鐘，反應30循環，每循環包括94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸反應3分鐘，循環結束後，追加72℃延伸反應5分鐘。
(4)PCR擴增產物與固定在微板上的鏈親和素(streptavidin)-蛋白A結合，再分別與地高辛探針(CaMV35S啟動子第181-200nt，5』-aagatatattt ctcaagatc-3』-Dig)、酶標地高辛抗體進行ELISA反應，用BioRad450酶標儀讀取405-410nm的吸光值，樣品和正對照可見明顯的吸收峰，負對照則沒有；PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，樣品和正對照都有1條大小約2900bp的DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段，結果與設計相符，表明相關序列和SBR-CTB嵌合基因已整合進番茄基因組。
權利要求
1.一種轉基因植物及其製品的檢測方法，其特徵是採用常規方法提取被測樣品的DNA，根據T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列設計合成一對或多對引物，進行PCR，得到相應的DNA擴增產物或擴增產物的信號。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵是具體包括以下步驟(1)合成2條以上引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物，長度18-25nt，其它為CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列中任意一段或多段序列，長度≥18nt；(2)取T-DNA左右邊界序列引物，與一條或多條其它引物配成一對或多對PCR引物，按常規方法對樣品DNA進行PCR擴增反應，以pBI121或pCAMBIA1300質粒DNA作正對照，以未轉基因植物或製品的DNA作負對照；PCR反應條件是94℃預變性5分鐘，反應25-35循環，每循環包括94℃變性1分鐘，45-65℃退火1分鐘，72℃延伸反應30秒-10分鐘，循環結束後，追加72℃延伸反應5分鐘；(3)PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察到大小50-10000bp的DNA擴增片段。
3.按照權利要求2所述的方法，其特徵是進行實時定量PCR在步驟(2)的PCR反應管中加入與雙鏈DNA特異結合的SYBR螢光染料，或者特異的TaqMan螢光探針；PCR擴增產物通過螢光掃描儀觀測到相應螢光信號，或者按步驟(3)觀察結果。
4.按照權利要求2所述的方法，其特徵是進行PCR-ELISA在步驟(1)中，用生物素標記合成的引物；PCR擴增產物與固定在微板上的鏈親和素-蛋白A結合，再分別與特異性地高辛探針、酶標地高辛抗體進行ELISA反應，用酶標儀讀取405-410nm的吸光值，或者按步驟(3)觀察結果。
全文摘要
本發明涉及一種轉基因植物及其製品的檢測方法。用轉基因植物中的特徵序列:T－DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列,設計合成引物進行PCR,得到相應的DNA擴增產物或擴增產物的信號,根據PCR結果,判斷被測樣品是否為轉基因植物及其製品。本發明具有簡便易行、經濟節時、準確靈敏的優點,特別是只需用一至三對引物既可檢測絕大多數轉基因植物及其製品。
文檔編號C12Q1/68GK1385541SQ0211523
公開日2002年12月18日 申請日期2002年5月17日 優先權日2002年5月17日
發明者葉長明, 藍崇鈺, 魏祥東, 陳東紅, 林周 申請人:中山大學