乾酪乳桿菌菌株用於製備抑制肥大細胞活化之組合物的用途的製作方法

2023-05-02 07:45:46

專利名稱：乾酪乳桿菌菌株用於製備抑制肥大細胞活化之組合物的用途的製作方法
乾酪乳桿菌菌株用於製備抑制肥大細胞活化之組合物的用
途本發明涉及預防和治療肥大細胞參與的慢性或急性疾病(例如變態反應和某些 自身免疫病)的領域。更確切地，本發明涉及益生菌用於抑制肥大細胞活化的用途。眾所周知，肥大細胞是變態反應的主要參與者。變態反應主要依賴於IgE抗體。肥 大細胞表達高親和力IgE受體(Fe ε RI)，在體內一定比例的所述受體被IgE抗體所佔據。 當多價變應原與IgE抗體結合使得Fc ε RI在細胞表面聚集時，Fc ε RI轉導活化信號從而導 致肥大細胞活化。活化的肥大細胞釋放並分泌多種炎性分子。這些包括儲存於肥大細胞顆 粒中預先形成的血管活性胺和酶(Miller和Pemberton，2002)，新形成的衍生自脂質的前 列腺素、血栓烷和白三烯(Triggiani等，1995)，新轉錄的細胞因子(Galli等，1991)、生長 因子和趨化因子(Kaplan，2001)。這些介質具有廣泛的生物學效應。它們增加血管通透性， 觸發平滑肌收縮，吸引並活化大量炎性細胞。總之，它們在幾分鐘內同時產生急性反應，接 著在數小時內產生後期反應，在數天內產生慢性反應，以及在數月內產生組織重構(tissue remodelling)。肥大細胞不僅表達IgE受體，還表達IgG受體(Fe y R) (Benhamou等，1990 ；Daeron 等，1980)。這些包括活化性受體(小鼠中的Fc y RIIIA，人的Fc y RIΙΑ)和抑制性受體(人 和小鼠中的Fc y RIIB)。當通過IgG免疫複合物聚集時，活化性Fc γ R引發與Fc ε RI同樣 的生物學應答(Daeron等，1992 ；Hazenbos等，1996 ；Latour等，1992)。當通過免疫複合物 與Fc ε RI或與活化性Fc γ R共聚集時，Fc γ RIIB負調控由IgE或IgG抗體誘導的肥大細胞 活化(Daeron等，1995a ；Daeron等，1995b)。最近發現，在自身免疫性關節炎(Lee等，2002) 和腦炎(Robbie-Ryan等，2003)的鼠模型中，肥大細胞在IgG依賴的組織特異性自身免疫 性炎症中扮演關鍵角色。這些病理症狀的臨床表現在肥大細胞缺陷的小鼠中得以消除。此 外，這些疾病的發病嚴格地依賴於肥大細胞上活化性Fc γ R與抑制性Fc γ R之間的比例，並 依賴於它們與IgG抗體的結合(Nigrovic等，2007 ；Robbie-Ryan等，2003)。除了在炎症中的作用，最近發現肥大細胞與微生物相互作用並有助於針對病原體 的保護。它們存在於幾乎所有組織中，特別是那些與外部環境交界的部位(皮膚、舌、胃、 腸、肺等)。它們表達Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLR)以及能使它們與細菌和微 生物來源之可溶性分子(包括內毒素、CpG核苷酸、肽聚糖和脂肽)相互作用的其它受體。 當與其配體結合後，大多數這些受體可轉導還導致促炎介質分泌的信號(Arock等，1998)。 此外，肥大細胞可吞噬細菌(Arock等，1998)。由盲腸結紮和穿刺引起的小鼠腹膜炎模型清 楚地表明肥大細胞在細菌感染中的保護作用此種攻擊導致發生嚴重的腹膜炎後，大多數 野生型小鼠仍存活，而大多數肥大細胞缺陷的小鼠則死亡(Shelley等，2003 ；Supajatura 等，2001)。基於以上的數據，肥大細胞可作為固有免疫系統的細胞，又因為它們表達FcR，所 以它們可藉助抗體來參與獲得性免疫。因此，它們很好地適用於固有免疫和獲得性免疫中， 從而使兩者相互協作。因此，本發明人研究肥大細胞中固有免疫和獲得性免疫之間可能的 相互影響。特別地，他們選擇研究益生菌是否以及如何幹預IgE和IgG誘導的肥大細胞活
4化。現已發現某些益生菌菌株對某些炎性疾病(包括某些變態反應)具有有益作用。 但是，迄今所有發表的實驗均關注導致變態反應或其它炎性疾病的免疫應答之誘導。例如， Kim等人描述，在用卵清蛋白初次致敏2周前，為小鼠口服施用益生菌7周，抑制了該模型中 變態反應應答的誘導(Kim等，2005)。然而，免疫應答(如變態反應應答)可分為兩個階段，即誘導階段和應答階段。迄 今，尚不知道益生菌菌株對應答階段(其需要肥大細胞的活化)的作用。如以下實驗部分所舉例地，本發明人出人意料地發現，某些益生菌能夠抑制肥大 細胞活化，從而對某些人類炎性疾病(包括自身免疫病和變態反應)具有保護性作用。重 要的是，本發明人得到的結果顯示，這些益生菌甚至能阻止已被致敏之對象或已發生自身 免疫病之對象中的致病性免疫應答。由於可根據下文描述的發明來治療已發生炎性疾病的 患者，因此這些益生菌開闢了一條治療新途徑。因此，本發明的第一方面是乾酪乳桿菌(Lcasei)菌株和/或短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve)菌株在製備用於抑制肥大細胞活化之組合物中的用途。取決於臨床情況和施用途徑，根據本發明製備的組合物可抑制IgE和/或IgG誘 導的肥大細胞活化。因此，它們可用於預防、緩解和/或治療由抗原存在時抗體活化肥大細 胞引起的任何炎性症狀。特別地，當IgE誘導的活化被抑制時，這些組合物可用於預防、緩解和/或治療變 態反應或變應性表現。本文涉及的變態反應由IgE抗體所引起，所述IgE抗體與肥大細胞結 合併且當識別特異性抗原時觸發肥大細胞活化。重要地，這些組合物可用於預防、治療或緩 解變應性表現(例如哮喘(athma)、鼻炎或枯草熱、變應性溼疹(aczema)、過敏性休克等)， 甚至是已被抗原致敏或已被診斷為對該抗原過敏的對象中的變應性表現。例如，患有枯草 熱多年的人可通過施用根據本發明製備的組合物來預防症狀復發。許多抗原均可引起變態 反應，其可表現為多種臨床症狀。常引起變態反應的抗原的非限制性實例有環境變應原，例 如蟎(如Der ρ 2)、蟑螂抗原、樺樹花粉(如Bet V 1)、草的花粉、動物毛皮屑抗原(如貓 的Fel d 1)、蜂毒(如磷脂酶)或食物變應原(如乳(尤其是牛乳)、花生、蝦、大豆、蛋、谷 類製品和水果等)。根據不同的情況和個體，臨床症狀可以是局部的(例如在變應性鼻炎、 結膜炎或耳炎中的情形)、區域性的(例如，哮喘、皮炎、胃腸病症和昆克水腫(Quincke' s oedema))或普遍性的(例如，過敏性休克)。有些疾病有時也被認為是「變態反應」，但它們 並不依賴於上面提及的機制。例如，遲髮型過敏反應就是一個這樣的例子。當根據本發明得到的組合物抑制IgG誘導的肥大細胞活化時，該組合物可有利地 用於預防、緩解或治療自身免疫病，例如類風溼性關節炎、腦脊髓炎、多發性硬化症、大皰性 類天皰瘡、急性播散性腦脊髓炎(acute disseminated enc印halomyelitis，ADEM)、強直性 脊柱炎、抗磷脂抗體症候群(antiphospholipid antibody syndrome，APS)、自身免疫性肝 炎、自身免疫性卵巢炎、腹腔疾病(celiac disease)、克羅恩病(Crohn' s disease)、妊娠 ti^l^^i^ (gestational pemphigoid)、月市出in腎(Goodpasture' s syndrome)、 格雷夫斯病(Graves' disease)、吉-巴症候群(Guillain_Barr6syndrome，GBS，也稱「急性 炎性脫髓銷性多神經病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy)，，、「急性 特發性多神經根神經炎(acute idiopathic polyradiculoneuritis) 」、「急性特發性多神
5經炎(acute idiopathic polyneuritis)，，禾口「蘭德裡上 亍性麻搏(Landry 『 s ascending paralysis)」)、橋本病(Hashimoto 『 s disease)、特發性凝血細胞減少性紫癜、川崎病 (Kawasaki 『 s disease)、紅斑狼瘡、重症肌無力、視性眼陣攣-肌陣攣症候群(Opsoclonus myoclonus syndrome， OMS)、視神經炎、Ord 甲狀腺炎(Ord' s thyroiditis)、天;) 、賴
特爾症候群(Reiter' s syndrome)、舍格倫症候群(Sj6gren』S syndrome)、高安動脈炎
(Takayasu arteritis)、顳動脈炎(也稱為「巨細胞動脈炎(giant cell arteritis)」)以 及韋格納肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis)。重要地，由於本發明的組合物對這些 疾病的應答階段具有作用，因此已患有自身免疫病的患者可受益於這些組合物。依賴於肥 大細胞被抗體活化的任何其它自身免疫病也可通過本發明獲得的組合物進行預防或治療。根據本發明製備的組合物還可用於預防、緩解和/或治療2型糖尿病，這是因為最 近報導來自腸道菌群的LPS引起慢性炎症，其傾向於發生2型糖尿病(Cani等，2007)。在一個優選的實施方案中，本發明所用的乾酪乳桿菌菌株是乾酪乳桿菌副乾酪亞 種(L.casei ssp. paracasei)，例如1994年12月30日以編號1-1518保藏於CNCM(法國國 家培養物禾口微生物保藏中心，Collection Nationale de Culture de Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, Paris)的菌株。在另一實施方案中，本發明所用的短雙歧桿菌菌株是1999年5月31日以編號 1-2219保藏於CNCM的菌株。根據本發明的一個特定實施方案，由乾酪乳桿菌製備的所述組合物是食物補充劑 和/或功能性食品。在本文中，「食物補充劑」是指由通常用於食品中的化合物製得的產品， 但是其採用片劑、粉末劑、膠囊劑、藥水或通常與食物無關的任何其它形式，並且其對人的 健康具有有益的作用。「功能性食品」也是對人的健康具有有益作用的食物。特別地，食物 補充劑和功能性食品可具有生理作用——預防或治療疾病(例如，慢性疾病)。根據本發明製備的一種特定組合物是發酵乳製品。本發明獲得的組合物還可包含至少一種其它細菌菌株，其選自乳桿菌屬 (Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和鏈球菌屬(Str印tococcus)，例如選自嗜熱 鏈球菌(Streptococcus thermophilus)禾口 呆;！]口禾[I亞季Llflii (Lactobacillus bulgaricus) 的至少一種細菌菌株。根據另一實施方案，根據本發明製備的組合物是醫藥產品。根據本發明，所述細菌(尤其是乾酪乳桿菌)可以完整細菌(可以是活的或死的) 的形式使用。例如，可使用完整的經輻射乾酪乳桿菌。或者，可使用細菌裂解物形式的細 菌，或者可使用細菌級分形式的細菌；可選擇適於此用途的細菌級分，例如，通過測試其抑 制IgE誘導之肥大細胞活化的性質來選擇，例如通過下文實驗部分中公開的任一測定來進 行。細菌級分是尤其優選的，例如，採用靶向鼻黏膜、鼻竇黏膜和肺黏膜的配方。在一個優選的實施方案中，本發明獲得的組合物被配製成使肥大細胞與細菌、細 菌裂解物和/或細菌級分(可能是部分降解的)直接接觸。乾酪乳桿菌以及較小程度上的短雙歧桿菌對肥大細胞活化的抑制作用也可在其 它細菌菌株中觀察到。應當篩選細菌菌株(尤其是已知益生菌)文庫來鑑定能夠抑制肥大 細胞活化的其它菌株。因此，本發明還涉及用於鑑定能用以製備抑制肥大細胞活化(特別是被抗體活化)之組合物的細菌菌株的篩選方法，所述組合物尤其用於預防、緩解或治療選自變態反 應、自身免疫病和2型糖尿病的疾病。根據本發明方法的第一變型形式(第一方法)，所述方法包括以下步驟(a)將肥大細胞與待篩選之細菌孵育至少一小時；(b)任選地，除去所述細菌；(c)向肥大細胞添加活化劑；以及(d)測量肥大細胞的活化。必要時，在步驟(b)與(C)之間以及步驟(C)與(d)之間進行清洗步驟。在上述方法中，步驟(c)中使用的活化劑可以是例如PMA、鈣離子載體(calcium ionophore)(例如離子黴素)、LPS、毒胡蘿蔔素(thapsigargine)、預先形成的IgG/抗原復 合物，或上述兩種或更多種的混合物。根據本發明方法的第二變型形式(第二方法)，所述方法包括以下步驟(a)將肥大細胞與待篩選細菌孵育至少一個小時；(b)任選地，除去所述細菌；(c)將肥大細胞與IgE抗體孵育；(d)向肥大細胞添加特異性抗原；以及(e)測量肥大細胞的活化。此時，如有必要，可以在上述方法的步驟之間進行清洗步驟。可例如通過下文實驗部分中所述的任一技術(即通過測量肥大細胞釋放的 β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)和/或TNF-α的水平)來測量肥大細胞的活 化。當然，本領域技術人員可使用任何其它的肥大細胞活化標記物，例如Galli等(Nature immunol. 2005)所述的那些。根據所用活化劑的性質和量，還根據在測量步驟(d)或(e)中所用的技術，將肥大 細胞與所述活化劑孵育(所述第一方法的步驟c)或與特異性抗原孵育(所述第二方法的 步驟d)幾分鐘(例如，5 30分鐘)或更長的時間(多達數小時)。例如，測量存在於肥 大細胞顆粒中的化合物(例如β-氨基己糖苷酶)只需要幾分鐘的孵育，然而如果測量細 胞因子(例如TNF- α )，則步驟c)中的孵育須持續至少一個小時(1 5小時)。還可測量由肥大細胞釋放或分泌的任何其它產物和/或與肥大細胞活化有關的 任何細胞變化。以下的附圖和實驗部分將進一步舉例說明本發明，但不限制其範圍。


圖 Ia 骨髓來源肥大細胞(Bone Marrow derived Mast Cells, BMMC)的表型。在0°C將BMMC與10 μ g/ml 2. 4G2預孵育10分鐘以防止抗體的非特異性結合。然 後，在 0°C將其與 10μ g/ml FITC 抗小鼠 Fc ε RIa 或 333ng/ml PE 抗小鼠 CD19 或 133ng/ ml PE 抗小鼠 CDllb 或 100ng/ml PE 抗小鼠 Ly_6G 或 200ng/ml APC 抗小鼠 Fc ε RI α 孵育 30分鐘，然後進行清洗。利用流式細胞術評估細胞螢光。圖lb :B匪C的TLR蛋白表達。在0°C將BMMC與10 μ g/ml 2. 4G2預孵育10分鐘以防止抗體的非特異性結合。然後，在0°c將其與2 μ g/ml經生物素標記的抗小鼠TLR4/MD2單克隆抗體或2 μ g/ml經生物 素標記的抗小鼠TLR2單克隆抗體孵育30分鐘，然後進行清洗。隨後，在0°C將其與2μ g/ ml經R-藻紅蛋白綴合的親和素、中性鏈親和素(neutravidin)孵育30分鐘。利用流式細 胞術評估細胞螢光。圖Ic =BMMC的TLR轉錄物表達。使用RNeasy小量試劑盒從BMMC提取RNA，並使用oligodT和AMV逆轉錄酶進行逆 轉錄。使用特異性針對 TLRl、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MD2、MyD88、CD14 和 GAPDH 的引物， 通過PCR來分析所得的cDNA。將擴增片段在2%瓊脂糖中進行電泳。圖2a 暴露於益生菌之BMMC中的β -氨基己糖苷酶釋放。在37°C將MMC暴露於PBSUO-7M ΡΜΑ+1(Γ6Μ離子黴素或經輻射的細菌(以1000個 細菌/細胞的比例)20分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖2b 暴露於益生菌之B匪C的TNF- α分泌。在37°C將MMC暴露於PBSUO-7M ΡΜΑ+1(Γ6Μ離子黴素或經輻射的細菌(以1000個 細菌/細胞的比例)3小時。使用L929生物測定來評估TNF- α的分泌。圖3a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於益生菌的BMMC的β -氨基己糖苷酶釋放。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C 使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。使用酶比色法評估β-氨基己糖苷酶的釋放。圖3b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於益生菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C 使用10ng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使用L929生物測定來評估TNF-α分泌。圖4a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於活乾酪乳桿菌的BMMC的β -氨基己糖苷酶 釋放。在37°C將BMMC與PBS或活細菌(以0. 5、5、50個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。 接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。使用酶比色法評估β-氨基己糖 苷酶的釋放。圖4b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於活乾酪乳桿菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C將BMMC與PBS或活細菌(以0. 5、5、50個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。 接著，在37°C使用10ng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使用L929生物測定來評估TNF- α 的分泌。圖5 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的腹膜細胞來源肥大細胞 (Peritoneal Cell-derived Mast Cells, PCMC)的 β-氨基己糖苷酶釋放。在37°C將PCMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C 使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。使用酶比色法評估β-氨基己糖苷酶的釋放。圖6a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的大鼠嗜鹼性粒細胞白血病細胞(Rat Basophil Leukemia, RBL)的β-氨基己糖苷酶釋放。在37°C將RBL細胞與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵 育過夜。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在 37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。使用酶比色法評估β-氨基己糖苷酶的 釋放。圖6b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的RBL的TNF- α分泌。在37°C將RBL細胞與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵 育過夜。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在 37°C使用10ng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使用L929生物測定來評估TNF-α的分泌。圖7 在用PMA-離子黴素攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育 過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C使用10_7M PMA+10_6M離子黴素攻擊細胞3小時。使用 L929生物測定來評估TNF- α的分泌。圖8a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌並在不存在細菌下孵育3小時的 BMMC的β -氨基己糖苷酶釋放。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，於37°C在細菌不存在下孵育細胞0或3小時，在37°C用1 μ g/ml 抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊 細胞20分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖8b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌並在不存在細菌下孵育不同時 間的BMMC的β -氨基己糖苷酶釋放。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，於37°C在不存在細菌下孵育細胞0或24小時，在37°C用1 μ g/ml 抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊 細胞20分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖9 暴露於乾酪乳桿菌之BMMC的碘化丙啶(PI)/膜聯蛋白V(AnneXin V)標記。在37°C將B匪C與PBS、250ng/ml星形孢菌素(staurosporine)或經輻射的細菌 (以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。接著，在0°C使用0.5 μ g/ml PI和0. 5 μ 1膜聯蛋白V-APC (BD Biosciences)孵育細胞30分鐘。利用流式細胞術評估細 胞螢光。圖IOa 暴露於乾酪乳桿菌之B匪C的Fc ε RI表達。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，在0°C用10 μ g/ml 2. 4G2孵育細胞10分鐘以防止抗體的非特異 性結合，在0°C用10 μ g/ml FITC抗小鼠Fc ε RI α抗體孵育細胞30分鐘，接著清洗細胞。 利用流式細胞術評估細胞螢光。圖IOb 暴露於乾酪乳桿菌之BMMC的IgE結合。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育 過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3 次；接著，在0°C使用30 μ g/ml經FITC標記的山羊抗小鼠Fab' 2孵育細胞30分鐘，然後
9進行清洗。利用流式細胞術評估細胞螢光。圖Ila:在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌不同時間的BMMC的β-氨基己 糖苷酶的釋放。將BMMC在37°C與PBS預孵育4小時或者與經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞 的比例)預孵育1、2、3、4小時，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞 致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。使 用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖lib 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌不同時間的BMMC的TNF- α分 泌。將BMMC在37°C與PBS預孵育4小時或者與經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞 的比例)預孵育1、2、3、4小時，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞 致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使用 L929生物測定來評估TNF- α的分泌。圖12 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌但用膜分隔開的BMMC的TNF- α 分泌。在transwell存在或不存在下，於37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000 個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 細胞致敏1小時，隨後清洗3次。接著，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使 用L929生物測定評估TNF- α的分泌。圖13a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的TLR-2/TLR-4缺陷型BMMC的 β-氨基己糖苷酶釋放。在37°C將來自野生型和TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠的BMMC與PBS或經輻射的細菌 (以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗 DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細 胞20分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖13b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的TLR-2/TLR-4缺陷型BMMC的 TNF-α分泌。在37°C將來自野生型和TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠的BMMC與PBS或經輻射的細菌 (以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗 DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞 3小時。使用L929生物測定評估TNF-α的分泌。圖14a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的MyD88缺陷型BMMC的β -氨 基己糖苷酶釋放。在37°C將來自野生型和MyD88缺陷型小鼠的BMMC與PBS或經輻射的細菌(以 1000個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20 分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖14b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的MyD88缺陷型BMMC的TNF- α 分泌。
在37°C將來自野生型和MyD88缺陷型小鼠的BMMC與PBS或經輻射的細菌(以 1000個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小 時。使用L929生物測定評估TNF-α的分泌。圖15a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的N0D2缺陷型BMMC的β -氨 基己糖苷酶釋放。在37°C將來自野生型和N0D2缺陷型小鼠的MMC與PBS或經輻射的細菌(以1000 個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20分鐘。 使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖15b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的NOD2缺陷型BMMC的TNF- α 分泌。在37°C將來自野生型和N0D2缺陷型小鼠的MMC與PBS或經輻射的細菌(以1000 個細菌/細胞的比例)預孵育過夜，然後清洗3次。然後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻擊細胞3小時。使 用L929生物測定評估TNF- α的分泌。圖16 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的Fc γ RIIB缺陷型BMMC的 β-氨基己糖苷酶釋放。在37°C將來自野生型和Fc y RIIB缺陷型小鼠的BMMC與PBS或經輻射的細菌(以 1000個細菌/細胞的比例)預孵育4小時，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。接著，在37°C使用所示濃度的DNP-BSA攻擊細胞20 分鐘。使用酶比色法評估氨基己糖苷酶的釋放。圖17a 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的BMMC的細胞內信號傳導蛋白 的表達和磷酸化。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育 過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3 次。接著，用10ng/ml DNP-BSA攻擊細胞0、3、10或30分鐘，並裂解細胞。通過SDS-PAGE 以及隨後的使用抗PLAT抗體、抗LAT抗體、抗pPLC γ 1抗體、抗PLC γ 1抗體、抗pERK抗體、 抗ERK抗體、抗pAkt抗體和抗Akt抗體的Western印跡來分析細胞裂解物。圖17b 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的BMMC的轉錄因子活化。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育過 夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，然後清洗3次。 接著，用10ng/ml DNP-BSA攻擊細胞0、3、10或30分鐘，並裂解細胞。通過SDS-PAGE以及 隨後的使用抗PNF κ B抗體、抗NF κ B抗體、抗ρ κ Ba抗體、抗I κ Ba抗體的Western印 跡來分析細胞裂解物。圖18 在致敏和用抗原攻擊前暴露於乾酪乳桿菌的BMMC的鈣流入。在37°C將BMMC與PBS或經輻射的細菌(以1000個細菌/細胞的比例)預孵育 過夜，然後清洗3次。隨後，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使細胞致敏1小時，隨後清洗3 次。接著，在室溫使用5 μ M鈣指示染料Fluo3AM標記30分鐘，清洗3次，然後在37°C使用
1110ng/ml DNP-BSA攻擊細胞。利用流式細胞術評估細胞刺激後的細胞螢光變化。圖19 乾酪乳桿菌抑制人嗜鹼性粒細胞活化。將來自正常供者的剔除紅細胞的血細胞與PBS或數量遞增的經輻射乾酪乳桿菌
(A)或者與PBS或1000個經輻射乾酪乳桿菌/細胞(B)孵育過夜，然後與抗人IgE抗體 的F(ab' )2片段孵育。對鑑定為FceRI+⑶203+細胞的嗜鹼性粒細胞設「門」，並監測刺 激前後所設門細胞中⑶203的表達。示出了來自PBS或乾酪乳桿菌處理組之數據的ρ值 (Student' s t 檢驗)。圖20 活乾酪乳桿菌抑制由IgE和IgG誘導的腹膜細胞來源肥大細胞(PCMC)活 化。將PCMC與PBS或活乾酪乳桿菌(以100個細菌/細胞的比例)孵育過夜。然後， 用IgE使肥大細胞致敏，用抗原攻擊細胞(A)或者用預先形成的IgG免疫複合物攻擊細胞
(B)0刺激20分鐘後，測量上清液中的β-氨基己糖苷酶。圖21 活乾酪乳桿菌不誘導骨髓來源肥大細胞(BMMC)活化。用IgE和抗原(Α、
C)或用活乾酪乳桿菌(B、D)刺激BMMC的β-氨基己糖苷酶釋放(Α、Β)和TNF-α產生(C、
D)。用IgE使BMMC致敏並用抗原進行攻擊，或者將BMMC與不同細菌/細胞比例的細菌孵 育。分別在刺激20分鐘和3小時後測量上清液中的β-氨基己糖苷酶和TNF-α。圖22 活嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)不抑制IgE誘導的B匪C活化。將B匪C 與PBS、活嗜熱鏈球菌或活乾酪乳桿菌(以100個細菌/細胞的比例)孵育過夜。然後，用 IgE使肥大細胞致敏並用抗原進行攻擊。分別在刺激20分鐘和3小時後測量上清液中的 β -氨基己糖苷酶㈧和TNF- α⑶。圖23 活乾酪乳桿菌來源的代謝物不抑制IgE的誘導BMMC活化。將PBS或活乾酪乳桿菌與培養基孵育過夜，並離心。將經0.2 μ m膜過濾的上清液、 細菌沉澱物或活細菌與BMMC孵育過夜。然後，用IgE使肥大細胞致敏並用抗原進行攻擊。 分別在刺激20分鐘和3小時後測量上清液中的β -氨基己糖苷酶(A)和TNF- α (B)。圖24 活乾酪乳桿菌對IgE誘導之BMMC活化的抑制需要細胞與細菌的直接接觸。 在普通培養孔(Α、C)或雙室transwell (孔徑0. 4μ m) (B、D)中，將BMMC與PBS或活乾酪 乳桿菌孵育過夜。然後，用IgE使肥大細胞致敏並用抗原進行攻擊。分別在刺激20分鐘和 3小時後測量上清液中的β-氨基己糖苷酶(C、D)和TNF-α (A、B)。圖25 活乾酪乳桿菌抑制BMMC中由IgE誘導的鈣應答。將BMMC與PBS或活乾酪 乳桿菌(以100個細菌/細胞的比例)孵育過夜，並用IgE使細胞致敏。然後，用Fluo-3 對肥大細胞進行加載(A)或不加載(B)，並用抗原進行攻擊。利用流式細胞術監測細胞內相 對Ca2+濃度作為時間的函數(A)。刺激20分鐘後測量上清液中的氨基己糖苷酶(B)。圖26 活乾酪乳桿菌抑制BMMC中由IgE誘導的細胞內信號傳導。將BMMC與PBS 或活乾酪乳桿菌(以100個細菌/細胞的比例)孵育過夜。然後，用IgE使肥大細胞致敏， 並用抗原攻擊細胞所示的時間。將細胞裂解物進行電泳，然後用所示抗體進行Western印 跡。圖27 活乾酪乳桿菌抑制PMA和離子黴素誘導的B匪C活化。將B匪C與PBS或活 乾酪乳桿菌(以100個細菌/細胞的比例)孵育過夜，並用PMA+離子黴素刺激。分別在刺 激20分鐘和3小時後測量上清液中的β -氨基己糖苷酶(A)和TNF- α (B)。
12實施例使用如下材料和方法進行下文所述的實驗細胞培養收集股骨骨髓細胞，並培養在添加了 10% FCS,0. 2% 2_巰基乙醇、100IU/ml青黴 素、100μ g/ml鏈黴素(完全Opti-ΜΕΜ)和分泌鼠IL-3的X63轉染體的4%上清液(Dr. P.Dubreui1, Institut de Cancerologie et d 『 Immunologie, Marseille, France)的 Opti-MEM+GlutaMAX-I中。通過用新鮮培養基重懸沉澱細胞(以3X105/ml的濃度)對培 養物每3天傳代一次。從經腹膜內注射了 2ml RPMI 1640的小鼠收集腹膜細胞。將細胞以1 X 106/ml接種 在添加了分泌鼠SCF之CHO轉染體的4%上清液(Dr. P. Dubreui 1)的完全Opti-MEM中。24 小時後，將非貼壁細胞除去，並向貼壁細胞添加新鮮培養基。3天後，收集用胰蛋白酶-SDTA 回收的非貼壁細胞和貼壁細胞，進行沉澱，並以3X105/ml的濃度用新鮮培養基重懸細胞。 同樣的步驟每周重複兩次。將3 9周的培養物用於實驗。培養試劑均來自Invitrogen Life Technologies。在添加了10% 05、100叨/1111青黴素和10(^8/1111鏈黴素的1^]\01640+611^3獻父-1 中培養大鼠嗜鹼性粒細胞白血病細胞。在添加了10% FCSUOOIU/ml 青黴素和 100 μ g/ml 鏈黴素的 DMEM+GlutaMAX-I 中 培養Raw 264. 7細胞。細胞預孵育在添加了 10 % FCS和分泌鼠IL-3之X63轉染體的4 %上清液的 Opti-MEM+GlutaMAX-I中將細胞與細菌、PBS或星形孢菌素進行預孵育。細胞致敏在添加了10% FCS 和 4% HEPES 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中使用抗 DNP IgE 使 細胞致敏。刺激細胞在添加了10% FCS 和 4% HEPES 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中用細菌、PMA/ 離子 黴素或DNP-BSA刺激細胞。標記細胞在添加了 0. 2% FCS的PBS中將細胞與2. 4G2以及經生物素、PE、FITC、APC標記
的抗體孵育。在結合緩衝液(BD Biosciences)中將細胞與PI/膜聯蛋白V-APC孵育。在添加了0. 2% pluronic 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中將細胞與 Fluo3AM 孵育。實施例1 經輻射乾酪乳桿菌對IgE誘導之BMMC活化的抑制所使用的模式細胞是鼠骨髓來源肥大細胞(BMMC)，其上檢出了 Fc eRI、 Fc y RIIIA和Fc y RIIB的表達。它們還表達幹細胞因子受體kit (⑶117)，但不表達巨噬 細胞標誌物(Macl)、B細胞標誌物(CD19)或粒細胞標誌物(GRl)(圖la)。通過使用可用 抗體進行間接免疫螢光來評估，檢測不出BMMC表達膜蛋白TLR-2和TLR_4(圖lb)，但是通 過RT-PCR分析評估，BMMC中包含編碼TLR_1、2、4、5、6、MD-2、MyD88和CD14的轉錄物(圖
13Ic)。當用IgE抗體致敏並用特異性抗原進行攻擊時，BMMC釋放β -氨基己糖苷酶並分泌 TNF- α。測試了 5種細菌菌株對肥大細胞活化的作用-乾酪乳桿菌副乾酪亞種，其於1994年12月30日以編號1-1518保藏於 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，25rue du Docteur Roux, Paris)，其在本文所述的實施例中稱為「乾酪乳桿菌」；-副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)DN-114120 ；-於1999年5月31日以編號1-2219保藏於CNCM的短雙歧桿菌；-植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DSM 9843 ；-於2002年1月24日以編號1-2273保藏於CNCM的嗜熱鏈球菌。首先測試這些細菌活化肥大細胞的能力。為此目的，對細菌進行輻射處理，用PBS 重懸並與BBMC(以1000個細菌/細胞的比例)孵育。當分別孵育20分鐘或3小時後，所 測試的6種細菌菌株均不誘導BMMC釋放β -氨基己糖苷酶或分泌TNF- α (圖2a和2b)。然後，本發明人研究了預先將BMMC暴露於細菌是否會影響隨後的IgE誘導之肥大 細胞生物應答。他們發現，當與BMMC孵育過夜(以1000個經輻射細菌/細胞的比例)時， 幾種菌株既抑制β-氨基己糖苷酶的釋放也抑制TNF-α的分泌。而其它菌株則不然。一 個菌株一乾酪乳桿菌一比其它細菌明顯更加有效(圖3a和3b)。在同樣的條件下，活幹 酪乳桿菌能抑制肥大細胞活化，並且在較低的細菌/細胞比例下也誘導出相當的抑制效果 (圖4a和4b)。出於實用的考慮，隨後的實驗中使用經輻射的細菌。所得結果如下文所述。A.乾酪乳桿菌所誘導之抑制的一般特徵1、乾酪乳桿菌對BMMC中的IgE誘導應答以及對實驗室開發的原代漿膜型成熟肥 大細胞新模型中的IgE誘導應答具有同樣地影響(Malbec等，2007)(圖5)，但是對腫瘤肥 大細胞系RBL-2H3無影響(圖6a和6b)；2、乾酪乳桿菌不僅抑制由IgE誘導的BMMC應答，還抑制由PMA+離子黴素誘導的 BMMC應答(圖7)，這表明乾酪乳桿菌抑制繞過膜抗體受體和細胞內信號傳導早期步驟的非 特異性活化；3、抑制是暫時性的(圖8a和8b)；4、乾酪乳桿菌不降低肥大細胞的生存力(圖9)；5、乾酪乳桿菌略微下調B匪C中Fc ε RI的表達，IgE抗體對B匪C的致敏作用未受影響。B、發生抑制的實驗條件1、通過預先與乾酪乳桿菌進行孵育而抑制肥大細胞應答是時間依賴性的(圖Ila 和 lib)；2、抑制不能歸因於乾酪乳桿菌上清液中存在的可溶性產物，並且其也不是由乳酸 引起的；3、支持這一發現的是，如果在孵育期間將乾酪乳桿菌和BMMC用0.4μπι的 transwell膜分隔開即可阻止抑制，這表明它需要細胞與細菌之間的直接接觸(圖12)。C、乾酪乳桿菌抑制肥大細胞活化涉及的機制1、乾酪乳桿菌對源自a) TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠(圖13a和13b)、b)MyD88缺陷型小鼠(圖14a和14b)、c)N0D2缺陷型小鼠(圖15a和15b)禾Π d)Fc γ RIIB缺陷型小鼠 (圖16)之BMMC中IgE誘導應答的抑制與對來自野生型小鼠之BMMC中應答的抑制同樣有 效；2、通過Western印跡評估，乾酪乳桿菌降低了幾種信號分子的表達(圖17)；3、乾酪乳桿菌抑制了早期和晚期Fc ε RI依賴性磷酸化事件(圖17)；4、乾酪乳桿菌增強了 NF-K B的磷酸化，但降低了 I κ B降解(其是NF-κ B核轉移 所需的)(圖17)；以及5、乾酪乳桿菌強烈抑制IgE誘導的及離子黴素誘導的細胞內Ca2+濃度增加(圖 18)。這些結果表明，將肥大細胞暴露於乾酪乳桿菌數小時不僅影響了導致轉錄因子活 化和Ca2+應答的Fc ε RI信號傳導，還影響了繞過Fc ε RI的活化信號(PMA+離子黴素)。結 果，IgE誘導的肥大細胞分泌應答(包括脫顆粒和細胞因子分泌)被顯著抑制。實施例2 乾酪乳桿菌抑制由IgE誘導的體內應答乾酪乳桿菌的體內作用主要通過強飼將乾酪乳桿菌暴露於小鼠來進行研究的。首 先研究乾酪乳桿菌抑制被動局部或全身性過敏反應的能力。然後，利用來自經乾酪乳桿菌 強飼之小鼠的經IgE致敏的迴腸區段，研究乾酪乳桿菌抑制抗原誘導的肥大細胞介質釋放 的能力。最後，在鼠變態反應(變應性哮喘和食物性變態反應)模型中以及在實驗室開發 的自身免疫性炎性疾病(類風溼關節炎和腦脊髓炎)模型中，研究了乾酪乳桿菌強飼的效^ ο實施例3 經輻射乾酪乳桿菌對人肥大細胞和嗜鹼性粒細胞的體外作用在與處理小鼠肥大細胞相似的條件下，將來自正常人供體的剔除紅細胞的血細胞 暴露於乾酪乳桿菌，並檢測它們對藉助IgE之刺激的應答。結果示於圖19中，其表明乾酪乳桿菌抑制人嗜鹼性粒細胞的活化。實施例4 乾酪乳桿菌對人中變態反應和自身免疫病的作用臨床試驗中包括服用Actimel 或安慰劑的正常組和變態反應患者組。還包括 患有自身免疫病(類風溼關節炎、多發性硬化症或大皰性類天皰瘡)之患者的單獨組，以及 患有2型糖尿病之患者的組。實施例5 新的目的益生菌的篩選為了從大的益生菌文庫中進行篩選，建立了在多孔板中的自動體外測定。如果該 篩選發現新的潛在目的益生菌，則使用與乾酪乳桿菌同樣的實驗方法對這些益生菌進行檢 測。實施例6 活乾酪乳桿菌對肥大細胞活化的作用使用與上述實施例1中所述的相同實驗方法對活乾酪乳桿菌或經輻射的細菌進 行操作。結果示於圖20至27中，其顯示使用活乾酪乳桿菌也觀察到使用經輻射乾酪乳杆 菌時對肥大細胞的同樣作用。參考文獻Arock, M. , Ross, Ε. , Lai-Kuen, R. , Averlant, G. , Gao, Ζ. , and Abraham, S. 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權利要求
乾酪乳桿菌(L.casei)菌株和/或短雙歧桿菌(B.Breve)菌株用於製備用以抑制肥大細胞活化之組合物的用途。
2.權利要求1的用途，其用於製備用以預防IgE誘導之肥大細胞活化的組合物。
3.權利要求2的用途，其用於製備用以預防、緩解或治療變態反應或變應性表現的組 合物。
4.權利要求1的用途，其用於製備用以預防IgG誘導之肥大細胞活化的組合物。
5.權利要求4的用途，其用於製備用以預防、緩解或治療自身免疫病的組合物。
6.權利要求1的用途，其用於製備用以預防、緩解或治療2型糖尿病的組合物。
7.權利要求1至6中任一項的用途，其中所述乾酪乳桿菌菌株是乾酪乳桿菌副乾酪亞 ft (L. casei ssp. Paracasei)
8.權利要求1至7中任一項的用途，其中所述乾酪乳桿菌菌株是1994年12月30日以 編號1-1518保藏於CNCM的菌株。
9.權利要求1至8中任一項的用途，其中所述短雙歧桿菌菌株是1999年5月31日以 編號1-2219保藏於CNCM的菌株。
10.權利要求1至9中任一項的用途，其中所述組合物是食物補充劑和/或功能性食品。
11.權利要求1至10中任一項的用途，其中所述組合物是發酵乳製品。
12.權利要求1至11中任一項的用途，其中所述組合物還包含至少一種選自乳桿菌屬 (Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)禾口鏈球菌屬(Streptococcus)的另夕卜菌株。
13.權利要求12的用途，其中所述組合物包含至少一種選自嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)禾口保力口利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)的細菌 菌株。
14.權利要求1至9、12和13中任一項的用途，其中所述組合物是醫藥產品。
15.根據權利要求1至14中任一項的用途，其中所述細菌以存活形式被應用。
16.根據權利要求1至15中任一項的用途，其中所述細菌以完整死細胞的形式被應用。
17.根據權利要求1至15中任一項的用途，其中所述組合物包含所述細菌的細菌裂解 物或細菌級分。
18.根據權利要求1至17中任一項的用途，其中所述組合物被配製成使得攝入該組合 物導致肥大細胞與所述組合物中包含的細菌、細菌裂解物和/或細菌級分直接接觸。
19.用於鑑定細菌菌株的篩選方法，所述細菌菌株能用於製備用以抑制肥大細胞被抗 體活化的組合物，其中所述方法包括以下步驟(a)將肥大細胞與待篩選的細菌孵育至少一個小時；(b)任選地，除去所述細菌；(c)向肥大細胞添加活化劑；以及(d)測量肥大細胞的活化。
20.權利要求19的篩選方法，其中用於步驟(c)中的活化劑選自預先形成的IgG/抗原 複合物、鈣離子載體、LPS、PMA、離子黴素、毒胡蘿蔔素以及上述兩種或更多種的混合物。
21.用於鑑定細菌菌株的篩選方法，所述細菌菌株能用於製備用以抑制肥大細胞被抗 體活化的組合物，其中所述方法包括以下步驟(a)將肥大細胞與待篩選的細菌孵育至少一個小時；(b)任選地，除去所述細菌；(c)將肥大細胞與IgE抗體孵育；(d)向肥大細胞添加特異性抗原；以及(e)測量肥大細胞的活化。
22.根據權利要求19至21中任一項的篩選方法，其中步驟(d)或(e)通過測量由所述 肥大細胞釋放的β 「氨基己糖苷酶和/或TNF-a的水平、和/或由肥大細胞釋放或分泌的 任何產物、和/或與肥大細胞的活化有關的任何細胞變化來進行。
全文摘要
本發明涉及預防和治療肥大細胞參與的慢性或急性疾病(例如變態反應和某些自身免疫病)的領域。更確切地，本發明涉及包含乾酪乳桿菌(L.casei)菌株和/或短雙歧桿菌(B.breve)菌株的益生菌用於抑制肥大細胞活化的用途。本發明還涉及用於鑑定能用以製備所述益生菌之細菌菌株的篩選方法。
文檔編號G01N33/573GK101909643SQ200880124467
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月1日 優先權日2007年11月30日
發明者塞西爾·希弗-曼尼維, 拉斐爾萊·布爾代-西卡爾, 桑德裡納·薩姆森, 馬克·達埃龍 申請人:巴斯德研究所;達能日爾維公司