載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法
2023-05-02 07:44:56
專利名稱：載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物醫藥技術領域的製備方法。特別是一種載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法。
背景技術：
免疫治療在針對傳染性疾病以及腫瘤的預防和治療中扮演著重要的角色。免疫治療的手段不外乎各種抗原和抗體對於人體的使用。抗體，無論是單克隆還是多克隆，均為蛋白大分子，而抗原則相當多樣化，包括細胞、病毒、蛋白、多肽、以及基因物質。
近10多年來，以可降解、生物兼容的聚合物為基質的緩釋微球在小分子化學藥物及多肽藥物上有著成功的應用，這類緩釋微球能夠使多肽抗原在體內長時間(或多脈衝)釋放，產生持續的抗體響應和其它免疫應答也多有報導。通過納米或微小顆載體將抗原輸送到APC胞漿，從而誘導細胞免疫，特別是CTL應答的工作也吸引了相當的研究投入。在此基礎上如何將蛋白大分子抗原、抗體包封在這類對於多肽分子成功的輸送體系中，使之以自然構像釋放於循環系統或體內特定的靶位是本發明所要解決的問題。
對於在可降解高分子劑型中保持蛋白大分子的自然構像，不少研究者做過有益的嘗試。比如，在過去的幾十年裡，文獻中見到過各種關於提高蛋白質在微囊包過程中的穩定性的方法的報導。但是，這些方法只能解決一個或一部分問題，而對於其他問題不能兼顧，甚至引發出新的問題。也有些方法只適用於特定的一種蛋白質。還有一些報導也由於研究者自身所關注的研究領域不同而顯得互相矛盾。舉個例子說明，對於市場上唯一同類產品--緩釋重組人類成長激素(rhGH)來說，其穩定性是靠和鋅形成絡合物來實現的。而與鋅形成絡合物是rhGH在體內的自然形態。當這種鋅絡合製備方法用於另一種蛋白，如促紅細胞生成素(EPO)，蛋白分子發生聚集的比率可以高達40％，引起導致免疫原性的顧慮。為避免蛋白在微囊包過程中因解除有機溶劑而變形失活，科學家預先將蛋白分子與糖類、無機鹽或者其他保護劑制為固體顆粒狀，從而採取一種固體分散在油相，在進一步分散在水相(即油包固體—水包油，S-O-W)的方法微囊包蛋白藥物。這些蛋白穩定化輔料常常由於其高溶解度而產生強滲透壓力，引起突釋。比如，當溶解度高的硫酸鹽用於提高EPO在微囊包過程中的素穩定性時，突釋高達總劑量的55％。
(Cleland，J.L.，Jones J.S.，穩定的重組人生長素和珈嗎幹擾素劑型用於生物可降解的微球微囊化.藥學研究，1996年，第13期，第1464-1475頁)；Cleland和Jones研究了在W-O-W(油包水-水包油)和S-O-W微囊化過程中各種輔料對重組人類生長激素和幹擾素的保護作用，發現甘露醇和海藻糖能夠在防止蛋白在微膠囊過程中聚集這個方面起到最好的作用。Sanchez核查了類似的賦形劑對於另一種蛋白——破傷風類酶素的保護作用，結果發現在Cleland和Jones的報告中被認定為對復原重組人類生長激素和幹擾素不起有效作用的葡聚糖能在水合條件下的釋放階段對蛋白質起到最好保護功能。這樣的實驗似乎說明了單糖在乾燥過程中對蛋白能起到更好的保護作用，而高分子化合物則在釋放階段起到更好效果。不過，Sanchez的葡聚糖-PLGA複合微球緩釋劑型的釋放曲線顯示60％的載藥量發生了突釋。這種突釋放也許是由於直接凍幹法製備的蛋白-輔料顆粒尺寸過大引起的。
在S-O-W過程中，預製備的蛋白顆粒的大小十分重要。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine protein Microparticles throughLyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，HiroshiYamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通過冷凍蛋白和聚乙二醇水混合溶液製備球型蛋白微球，藥學研究，2000年，第17期，第1376-1373頁)；Morita發現當固體蛋白質顆粒的直徑從5微米增大到20微米時，不僅初期的釋放速率翻倍，其微囊包封率從80％下降到20％。Cleland討論了在S-O-W過程前縮小蛋白質微粒體積大小的方法。進一步粉碎蛋白質凍乾粉不能得到直徑小於10微米的微粒，而把這些粉末研磨成更小的尺寸的方法卻受阻於研磨熱引起的蛋白質性變。雖然噴霧式乾燥法能得到預期大小的蛋白質微粒，但是其間的切力和產生的熱量卻又會由於有了氣體液體界面的介入而引起性變。噴霧乾燥法或許可以提供足夠小的蛋白顆粒，但是噴嘴附近的高剪切力和液體與空氣間的界面張力會使蛋白變性。更不妙的是，噴霧乾燥或噴霧式冷凍乾燥中須使用表面活性劑，而表面活性劑有促成了蛋白質在下一步製劑程序中與溶劑互相作用。Maa等報導了在噴霧乾燥之前預先將重組人類生長激素和鋅絡合的方法防止蛋白質成分的聚集。不過鋅絡合會導致生長激素以外的蛋白變性。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，andHiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine proteinMicroparticles through Lyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通過冷凍蛋白和聚乙二醇水混合溶液製備球型蛋白微球，藥學研究，2000年，第17期，第1376-1373頁)；Motita等用PEG沉澱蛋白質的方法製備了蛋白超微顆粒。但是，在微囊包過程中這些微粒還是直接處於有機溶劑的作用下。由於蛋白質對於高分子化合物基質的內部表面的吸附作用，未受任何保護的蛋白質和PLGA的直接接觸會引起不完全的釋放。為了避免親水-疏水分界面，科學家曾用親水性雙相體系製備高分子化合物微粒。然而，在乳化階段必須靠共價或離子同步交聯作用來固化顆粒，從而使蛋白質暴露在活性反應物中。
專利申請號CN02146543.6，公開號CN1401328，名稱流行性腦脊髓膜炎多糖-蛋白結合疫苗，該技術將A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖通過化學的方法以共價鍵結合到有效的蛋白載體上，製備出含有兩種結合疫苗的聯合疫苗製劑，該製劑可供人體免疫接種，用於預防A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。不過該技術是針對的是非蛋白亞單位疫苗，而是用蛋白做載體，導致異種蛋白本身的免役原性的問題難於避免，且是通過化學修飾，同樣化學修飾導致疫苗本身的性質的變化不得而知。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種利用多糖玻璃體保護疫苗和抗體活性的方法。並且通過多糖玻璃體保護疫苗製備成納米或微小顆載體將抗原輸送到APC細胞的胞漿裡，從而誘導細胞免疫，特別是CTL細胞。或製備成緩釋的微球來維持血液中抗原濃度，從而刺激漿細胞長期分泌抗體，誘導體液免疫。局部緩釋抗體主要是針對固體腫瘤的血管增生迅速，利用局部注射緩釋微球，特異性抑制腫瘤血管增生，使得腫瘤得不到足夠得營養而餓死。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明的具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所製備的疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低於室溫高於冰點的溫度下混合，或將疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與並含有0.2-2％的聚電解質的聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合，或將疫苗或抗體-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍乾燥；④將所得到的凍乾粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的-多糖玻璃體微粒。
所述的聚乙二醇，其分子量為1,000-30,000；其濃度為0.2％-50％。
所述的聚乙二醇，用於除去PEG連續相的有機溶劑是溶解PEG而不溶解多糖的溶劑。
所述的多糖，其分子量為10,000-2,000,000；其濃度為2％-20％。
所述的多糖，為葡聚糖。
所述的聚電解質為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負電荷的聚電解質。
所述的多糖分散相顆粒，含有緩衝物質、鹽類和小分子糖類物質。
所述的緩衝物質為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
所述的疫苗為亞單位疫苗、活病毒疫苗、減活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
所述的亞單位疫苗為A肝疫苗、B肝疫苗、C肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、愛滋病疫苗、炭疽疫苗、腫瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸蟲病疫苗，還可以添加免疫佐劑如細胞因子、TAP、無機鹽、CpG等起到增強免疫的效果。
所述的活病毒疫苗為麻疹疫苗、脊髓灰質炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
所述的亞單位疫苗的重量百分比0.001％-50％，所述的抗體為重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％。
所述的抗體，為抗血管增生的抗體，病毒抗體、腫瘤抗體和細胞因子抗體或者抗細胞因子的抗體。載在多糖玻璃體中的疫苗和抗體，可以長期保持活性和治療效果。
緩釋微球劑型，載有抗體、疫苗和病毒的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基質中；高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成復乳即油包固體—水包油(S/O/W)的方法，或者通過將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成復乳即油包固體—水油包油(S/O/O)的方法，或者通過噴霧乾燥法製備微球，或者添加到各種凝膠中。
所述的高分子為聚醚醯亞胺、聚酯、聚酸酐、聚氨基酯、或骨架非肽鍵的聚胺基酸，包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括矽像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白及它們的組合、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠、糖敏型凝膠和酸敏型凝膠、它們的組合。
所述的溫敏型凝膠，其特徵為載於疫苗或抗體多糖玻璃體微粒或多糖溶液中的蛋白被選擇性地分配在多糖相中處於熱力學上更穩定的狀態。此外，溫敏型凝膠系在升溫相變(從液體到膠狀)過程中發生脫水收縮引起的突釋，而分配在多糖相中的蛋白則可以在相當程度上避免這類突釋。所述的多糖玻璃體或者未經乳化凍幹的含有疫苗或抗體的多糖溶液可以被直接加入低溫下處於液體狀態的溫敏型凝膠或它們的組合。
所述的緩釋疫苗的微球劑型為皮下注射，起到長期緩釋有治療和預防作用的疫苗。
所述的緩釋抗體的微球劑型為固體腫瘤周圍注射，起到長期緩釋，和提高固體腫瘤周圍的抗體濃度，起到治療腫瘤的效果。
所述的APC細胞吞噬的疫苗的微球劑型為0.5μm-10μm的微球，皮下注射或肌肉注射能被APC細胞吞噬，引起細胞免疫或體液免疫，或兩者兼有的免疫應答。
所述的疫苗多糖玻璃體可以進一步分散在功能性的高分子溶液，製備成緩釋微球、免疫細胞能吞噬的微粒(0.5μm-10μm)、或塗在各種支架的表面塗層、製備成骨架、栓塞劑等。
本發明方法製備的疫苗和抗體多糖玻璃體微粒表面光滑圓整，顆粒規整無粘連，粒徑可以根據需要進行調控從0.1μm到10μm。進一步把疫苗和抗體多糖玻璃體分散在控釋高分子材料中，根據臨床的需要製備不同的劑型，如緩釋微球、APC細胞吞噬的0.5μm-10μm的小微球等，可以長期保持活性和治療效果。製備的載有疫苗或抗體多糖玻璃體微粒可以直接用於吸入劑型，保護結構脆弱的疫苗或抗體；載有疫苗或抗體多糖玻璃體微粒的熱敏液-膠體可以直接用於臨床皮下注射給藥或植入皮下起緩控釋疫苗或抗體的效果。載有疫苗或抗體的玻璃體可以通過S/O/W或S/O/O復乳方法製備成緩釋微球，粒徑在500nm-10,000nm的微球可以誘導細胞免疫或細胞和體液免疫，在20μm-120μm微球可以緩控釋疫苗起到以體液免疫為主免疫治療和預防。多糖相不僅可以在製劑過程中保護疫苗或抗體，還可以用來改善其釋放動力學。對於給定疫苗或抗體擔載量的微球來說，多糖的用量是一個方便的因素可用來調控疫苗或抗體的釋放速率和釋放模式。增加多糖的用量，則釋放速率提高，不完全釋放的問題得到改善，但突釋的可能性增大。減小多糖的用量則起到相反的效果。仔細地選擇多糖的用量同時結合可降解高分子的分子量及親水-疏水性能可以達到既控制突釋，又避免不完全釋放的目的。
具體實施例方式
實施例的基本條件疫苗或抗體—多糖玻璃體的製備和微球的製備或載蛋白質-多糖玻璃體的敏感型凝膠製備。可以根據具體疫苗和抗體的性質，可以選定三種製備疫苗或抗體--多糖玻璃體的方法一種、兩種或三種。
實施例11.低溫水相-水相乳液法製備疫苗或抗體-多糖玻璃體①製備疫苗疫苗或抗體、PEG和多糖水溶液用超純水分別製備10％的PEG和10％的多糖水溶液，精確稱取10克PEG和10克多糖水分別放在100毫升的燒杯裡加水90克，然後把兩個燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下來冷卻待用。用電子天平精確稱取800毫克疫苗或抗體溶於7.2毫升水中待用。
備疫苗或抗體、PEG和多糖水相-水相乳液在0℃-4℃條件下，將1.的多糖、疫苗或抗體和PEG水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成水相-水相乳液；或稱取按照多糖和PEG的質量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水溶解，再按照多糖和疫苗或抗體的重量比為1∶1加入，使之形成形成水相-水相乳液。
凍疫苗或抗體、PEG和多糖水相-水相乳液將製備疫苗或抗體、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些沒有分配到多糖相的蛋白質，在降溫過程中再分配到多糖分散相中，冷凍過夜。
④完成步驟③的樣品在真空冷凍乾燥機凍幹；⑤完成步驟④的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續相獲得載疫苗多糖玻璃體。
得到的疫苗或抗體多糖玻璃體的粒徑大都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻。可以使疫苗或抗體的結構得到好的保護，避免了在劑型製備過程失活。
2.載有疫苗或抗體多糖玻璃體的微球製備稱取1g和5g的PVA和NaCl，加超純水94g，同時加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無氣泡後，停止攪拌，放於4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精確稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩渦振蕩，使PLGA溶於二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現用現配，以防二氯甲烷揮發。
稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散於0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉速1800rpm，充分攪拌使得蛋白質-多糖玻璃體微粒均勻分散於PLGA溶液中，將所得初乳再次分散於含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉速勻漿成復乳(S/O/W)，於一分鐘內轉移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時後收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預凍過夜，再真空冷凍乾燥，製得粒徑為50μm-120μm的微球。製備微球還可以用S/O/O復乳法和噴霧乾燥法製備的微球，可以用於皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實施例21.低溫誘導相分離法製備疫苗或抗體-多糖玻璃體①製備疫苗或抗體、PEG和多糖水溶液用超純水分別製備5％的PEG和5％的多糖水溶液，精確稱取5克PEG和5克多糖水分別放在100毫升的燒杯裡加水95克，然後把兩個燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和5％的多糖全部溶解取下來冷卻待用。用電子天平精確稱取400毫克蛋白溶於3.6毫升水中待用。
②疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液將①的多糖、疫苗或抗體和PEG水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成均相溶液；或稱取按照多糖和PEG的質量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水，使之溶解形成均相溶液。
③冷凍疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液將製備疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液在降溫過程中發生相分離，使多糖成為分散相，PEG成為連續相。但是避免速凍條件下冷凍過夜。
④完成步驟③的樣品在真空冷凍乾燥機凍幹；⑤完成步驟④的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續相獲得載疫苗或抗體多糖玻璃體。
2.載有疫苗或抗體多糖玻璃體的微球製備稱取1g和5g的PVA和NaCl，加超純水94g，同時加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無氣泡後，停止攪拌，放於4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精確稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩渦振蕩，使PLGA溶於二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現用現配，以防二氯甲烷揮發。
稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散於0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉速1800rpm，充分攪拌使得蛋白質-多糖玻璃體微粒均勻分散於PLGA溶液中，將所得初乳再次分散於含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉速勻漿成復乳(S/O/W)，於一分鐘內轉移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時後收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預凍過夜，再真空冷凍乾燥，製得粒徑為50μm-120μm的微球。
製備微球還可以用S/O/O復乳法和噴霧乾燥法製備的微球，可以用於皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實施例3穩定的水相-水相乳液法得到的載疫苗或抗體多糖分散相玻璃體的粒徑大多數都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻。可以使疫苗或抗體的結構得到好的保護，避免了在劑型製備過程失活。
稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩渦混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然後稱取10mg的疫苗或抗體多糖玻璃體加入乙腈的溶液中，並在磁力攪拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性劑span80，在電力攪拌器以200rpm攪拌下充分混勻。把分散有疫苗或抗體多糖玻璃體的乙腈溶液逐滴加入攪拌中的外油相溶液中，攪拌固化5個小時，抽濾，得到的微球顆粒用50ml石油醚洗三次，減壓乾燥10個小時，收集微球，在現微鏡觀察微球的粒徑為50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。
可以緩控釋疫苗，起到維持體內的疫苗濃度，從而激發體液免疫，維持體內抗體濃度達到治療和預防目的。
實施例4載有疫苗或抗體多糖玻璃體溫敏型凝膠製備稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，在4℃均勻分散於0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉速1800rpm，充分攪拌使得疫苗或抗體多糖玻璃體微粒均勻分散於PLGA-PEG-PLGA溶液中，將所得均勻分散於PLGA-PEG-PLGA的混懸液加熱到37℃固化，做體外釋放。而臨床應用則現配現用。
實施例5模型疫苗BSA緩控釋劑的製備和體外釋放行為可以在保持疫苗成分或抗體的自然構像的溫和條件下將其製成多糖玻璃體微粒。這種微粒具有對有機溶劑、溫度等條件的耐受性，可以進一步將得到保護的疫苗顆粒製成諸如高分子緩釋微球等各種維持體內的疫苗濃度、提高抗體的滴度，或者通過交叉抗原提呈刺激細胞免疫。
一、溶液配置1.BSA溶液製備稱取肌紅蛋白20.7mg，加入超純水2ml中渦選溶解，得到肌紅蛋白溶液濃度約10mg/ml。
2.葡聚糖溶液製備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
3.PEG溶液製備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒製備1.BSA葡聚糖微粒製備分別稱取肌紅蛋白溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.50g、0.16g和1.00g(注兩份)，在0℃的條件下，採用勻漿器E檔(22，000rpm)勻漿3×5s。上述乳液在-20℃放過夜，再冷凍乾燥24h。乾燥物置於二氯甲烷5ml中，12,000rpm離心5min，傾去上層清夜，重複二氯甲烷洗滌過程三次。將最後得到的肌紅蛋白葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白對照葡聚糖微粒製備分別稱取葡聚糖溶液和PEG溶液0.15g和1.00g，按上面製備方法同法製備。
(注將上述兩種微粒在PCS測定其粒徑分布和大小及掃描電鏡觀察形態呈球形，微粒大多數粒徑在1～2um左右。)三、模型疫苗BSA緩釋製劑的製備1∶5膜控釋製劑製備稱取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，渦選溶解。加入700ul搖勻的BSA葡聚糖微粒混懸液，渦旋使分散均勻。通過S/O/W方法製備成PLGA微球。我們可以清楚的看到球中有分散均勻的BSA葡聚糖微粒。
四、釋放液測定釋放液樣品採用micro-BCA試劑盒測定。以BSA標準蛋白製備標準曲線。BSA-葡聚糖PLGA微球釋放液吸收值減除同法製備的空白微球釋放液吸收值進行校正，帶入上述標準曲線中計算釋放液BSA濃度。依次繪製不同葡聚糖/PLGA比例塗層中BSA的釋放曲線。我們可以看出其釋放行為良好，無明顯突釋行為。
實施例6模型抗體β-半糖乳糖苷酶蛋白緩控釋劑的製備和體外釋放行為目前國際上已經有500種抗體用於診斷和治療，FDA已經批准20個抗體上市，其中8種用於腫瘤治療的靶向抗體。如針對血管表皮生長因子[VEGF]的抗體Avastin，使晚期結腸癌患者生存期平均延長五個月，但是治療費用及其昂貴。由於抗體的分子量較大，結構複雜，通常四級結構，在體內惡劣的環境下，構像更易發生變化，比化學藥更容易失活。因此需要一個的輸送完整結構抗體的體系，直接送到腫瘤細胞的血管周圍，抑制腫瘤細胞的血管生長。或其它殺傷腫瘤細胞的抗體，起到局部緩釋抗體，提高局部血藥濃度，減少藥的用量和毒性，節約治療成本。故我們選擇了一個與抗體分子量大小相當，也具有空間四級結構的模型蛋白β-半糖乳糖苷酶蛋白來說明此體系對抗體的保護作用。
一、模型β-半糖乳糖苷酶蛋白-葡聚糖微粒製備按照實例5製備二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒製備和微球製備按照事例5製備三、釋放試驗按照實例5進行釋放液測定；四、本發明方法對β-半糖乳糖苷酶蛋白的保護作用為了驗證本發明對生物活性物質有較好的保護作用，設計如下實驗有機溶液存在條件下葡聚糖微粒對結構易變的蛋白大分子的保護作用，把β-半糖乳糖苷酶(一個具有四級結構、分子量為500KD的酶)載進葡聚糖微粒進行了測試。先將蛋白質以0.67mg/mlβ-半糖乳糖苷酶溶於葡聚糖溶液，按照1∶20的比例，然後將其加入實例1所描述的PEG溶液中乳化。冷凍乾燥後，用二氯甲烷反覆洗滌幾遍除去PEG。接下來的步驟中，將所回收的載著蛋白質的葡聚糖微粒在緩衝液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，測試對底物-ONPG的水解催化活性。酶的催化作用在經歷了從實例5到實例6所描述的操作過程(包括乳化、冷凍乾燥以及二氯甲烷洗滌)後，只是下降了不到10％。此10％的活性下降還包括了由於在乳化過程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷凍乾燥過程中損失的蛋白活性。也就是說，在與微囊包過程所用的有機溶液—二氯甲烷的接觸中，葡聚糖微粒有效地保存了蛋白酶的活性。
實施例7被抗原提呈細胞(APC)吞噬的微粒疫苗製備當微粒的粒徑在500nm-10,000nm容易被APC細胞吞噬，一些抗原可以通過不同的途徑從內吞體逃逸到細胞漿。這一途徑又稱吞噬體-胞質溶膠(phagosome-cytosol)方式；或MHCI類分子經內質網和高爾基體直接進入內體與外源性抗原結合，並將其提呈到細胞表面；在溶酶體中外源性抗原肽經胞吐作用被釋放到胞外，與細胞表面的MHCI類分子結合。基於上述非經典外源性抗原MHCI類分子提呈原理，設計了保證疫苗的完整結構，並且應用可以幫助疫苗從內吞體逃逸出來的高分子材料(PEI)，來保證有更多的疫苗從內吞體到細胞漿，從而有更多的機會刺激細胞免疫。
一、溶液配置1.戊肝疫苗溶液製備稱取戊肝疫苗4.05mg，加入超純水1ml中渦選溶解，得到戊肝疫苗溶液濃度約4.05mg mg/ml。
2.葡聚糖溶液製備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
3.PEG溶液製備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
二、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒製備1.戊肝疫苗葡聚糖微粒製備分別稱取戊肝疫苗溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.05g、0.02g和8.00g(注兩份)，另一分添加小分子1mg的PEI在多糖相在0℃的條件下，採用勻漿器E檔(22,000rpm)勻漿3×5s。上述乳液在-20℃放過夜，再冷凍乾燥24h。乾燥物置於二氯甲烷5ml中，12,000rpm離心5min，傾去上層清夜，重複二氯甲烷洗滌過程三次。將最後得到的戊肝疫苗葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白對照葡聚糖微粒製備分別一份稱取葡聚糖溶液和PEG溶液0.02g和8.00g，和另一份0.02g葡聚糖溶液和加4mg的PEI及PEG溶液和8.00g，按上面製備方法同法製備。
三、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒的PLGA微球的製備1.稱取疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒10mg，50mg PLGA50/50(平均分子量6,500)溶於1ml乙腈，含0.5％(w/v)司盤的棉子油8ml，將兩液體混合，10krpm勻漿30-60秒，顯微鏡下觀察小於10um(S/O/O法製備)，將此乳液滴入100ml棉子油萃取揮發4小時，最後加入100ml石油醚洗滌15min。最後過濾揮幹。
四、戊肝疫苗-葡聚糖納米粒的PLGA微球的製備過程的免疫活性的回收分別稱取2mg的戊肝疫苗-葡聚糖納米粒，和2mg PLGA微球，其中微球用4ml二氯甲烷洗滌4次，用1200轉/min離心，去上清液。最後揮乾重新溶解在磷酸緩衝液，再用廈門大學提供的試劑合(ELISIA)測定。其回收的免疫活性，我們發現除掉物理損失，活性幾乎全部保持。可以預防戊肝。
權利要求
1.一種載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所製備的疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低於室溫高於冰點的溫度下混合，或將疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與並含有0.2-2％的聚電解質的聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合，或將疫苗或抗體-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍乾燥；④將所得到的凍乾粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的-多糖玻璃體微粒。
2.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的聚乙二醇，其分子量為1,000-30,000；其濃度為0.2％-50％之間。
3.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的多糖，其分子量為10,000-2,000,000；其濃度為2％-20％。
4.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的聚電解質為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負電荷的聚電解質。
5.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是所述的多糖分散相顆粒，含有緩衝物質、鹽類和小分子糖類物質。
6.根據權利要求5所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的緩衝物質為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
7.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的疫苗為亞單位疫苗、活病毒疫苗、減活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
8.根據權利要求7所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的亞單位疫苗為A肝疫苗、B肝疫苗、C肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、愛滋病疫苗、炭疽疫苗、腫瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸蟲病疫苗；所述的活病毒疫苗為麻疹疫苗、脊髓灰質炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
9.根據權利要求1或者7或者8所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的抗體為重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％，所述的亞單位疫苗的重量百分比0.001％-50％。
10.根據權利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法，其特徵是，所述的抗體，為抗血管增生的抗體，病毒抗體、腫瘤抗體和細胞因子抗體或者抗細胞因子的抗體。
全文摘要
本發明涉及的是一種生物醫藥技術領域的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的製備方法。具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所製備的疫苗或抗體－多糖在冰點以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相－水相乳濁液冷凍乾燥；④將所得到的凍乾粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的－多糖玻璃體微粒。本發明製備的疫苗和抗體多糖玻璃體微粒表面光滑圓整，顆粒規整無粘連，粒徑可以根據需要進行調控從0.1μm到10μm。可以長期保持活性和治療效果。
文檔編號A61K39/12GK1887275SQ200610029129
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月20日 優先權日2006年7月20日
發明者金拓, 袁偉恩, 吳飛 申請人:上海交通大學