編碼氨甲醯磷酸合成酶ii的核苷酸序列的製作方法
2023-05-02 00:32:56 2
專利名稱：編碼氨甲醯磷酸合成酶ii的核苷酸序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ的核苷酸序列，用重組DNA技術生產該酶的方法，以及該序列和酶在治療學上的用途。
由於對傳統藥物具有抗性的人瘧原蟲、主要是惡性瘧原蟲的演化，目前迫切需要開發新的治療瘧疾的化學治療劑。對疫苗進行研究似乎是非常饋贍艿奶媧椒ⅰ但是經過多年研究之後，到目前為止尚未有臨床可接受的產品。而與此同時，抗蚊媒介昆蟲的殺蟲劑效力的下降卻在增長。目前，多於三分之二的世界人口-約5億人-被認為生活在瘧區(Miller，1989)。在世界衛生組織(WHO)所列世界10種最流行疾病中它排在第8位(每年感染2億7千萬人口)，在10種最致命疾病中排在第9位，每年奪取2百萬以上生命(Cox;1991;Marshall，1991)。儘管主要限於貧困國家，但是目前在美國(Marshall，1991)和澳大利亞(Johnson，1991)都有報導，而且旅行者瘧疾病例不斷增加(Steffen和Behrens，1992)。
瘧原蟲、惡性瘧原蟲及其宿主的比較生物化學研究表明許多代謝途徑不同。這些區別之一就是該寄生蟲僅僅依賴於嘧啶從頭合成，因為它不能補救預先形成的嘧啶(Sherman，1979)。而且認為成熟的人血紅細胞不需要嘧啶核苷酸(Gero和O′Sullivan，1990)。主要努力方向是開發嘧啶生物合成途徑的抑制劑(Hammond等人，1985;Scott等人，1986;Prapunwattana等人，1988;Queen等人，1990;Krunhkrai等人，1992)，進一步證實該途徑作為化學治療位置的可能性。可以預期目前對關鍵嘧啶酶的分子生物學研究不僅可以作為更好地理解寄生蟲生物化學的有效工具，也可以作為探察寄生蟲與哺乳動物酶之間具體差異的有效工具。
穀氨醯胺依賴性氨甲醯磷酸合成酶(CSPⅡ，EC 6.3.5.5)催化真核生物的嘧啶從頭生物合成途徑的第一步定型和限速步驟(Jones，1980)。而且由於它催化涉及三個催化單元和七種底物及中間體這樣一個複雜的反應，從生物化學觀點來看它是一種非常值得研究的酶。CPSⅡ與其他嘧啶酶的結構關係隨不同生物體而改變，這使其成為進行研究的一個好的主題。
可以從瘧疾培養物得到的少量原料阻礙了分離足以進行分析量的純蛋白質。而其固有的不穩定性更增加了純化CPS的困難。用P.berghei(一種齧齒動物瘧疾)粗提物進行研究顯示了具有CPS活性的一種高分子量蛋白，據推測它與ATCase有關(Hill等人，1981)，這種狀況也發現於酵母中(Makoff和Radford，1978)。然而，Krungkrai及其同事目前的分析(1990)測定了CPSⅡ和ATCase各自在P.berghai中的活性。儘管到目前的研究為止已經在惡性瘧原蟲中測得了CPS活性(Reyes等人，1982)，但是未指出其大小，也沒有指出其在該途徑中與其他酶鍵合。
CPSⅡ的穀氨醯胺依賴性活性可以分成兩步(1)穀氨醯胺酶(GLNase)反應，使穀氨醯胺(G1n)水解並將氨轉移至氨甲醯磷酸合成酶的位點;和(2)合成酶反應，在該反應中從兩分子三磷酸腺苷(ATP)、碳酸氫鹽和氨合成氨甲醯磷酸。第二種活性涉及三部分反應(a)碳酸氫鹽被ATP活化;(b)活化的羧基磷酸與氨反應形成氨甲酸鹽;和(c)氨甲酸鹽的ATP依賴性磷醯化作用形成氨甲醯磷酸(Powers和Meister，1978)。因此，在CPSⅡ中有兩個主要的區，穀氨醯胺的醯胺轉移酶區(GAT)和氨甲醯磷酸合成酶區(CPS)或簡單合成酶區。穀氨醯胺酶區(GLNase)是GAT的亞區，而在合成酶區中有兩個ATP-結合亞區。
考慮到CPS穀氨醯胺的醯胺轉移酶區與其他醯胺轉移酶之間的相似性，已經提出這些亞單位由表示GLNase區的共同祖代基因(＝20 kDa)趨異進化而產生，而且CPS GAT區(＝42kDa，它包括僅存在於CPS中的推斷結構區)的特殊進化一定包括其他序列的融合和/或插入(Werner等人，1985)。已經提出該哺乳動物CPSⅠ基因的GAT可以通過在該祖代基因的5′末端與未知基因的簡單基因融合來形成(Nyunoya等人，1985)。
假定各種生物體較大合成酶區的基因進行了祖代激酶基因的基因複製，得到具有相應兩半的多肽(Simmer等人，1990)。與大腸桿菌的亞單位結構和酵母的精氨酸特異性CPS不同，有人提出編碼GAT和合成酶區的基因進一步融合形成了對高級真核生物嘧啶生物合成具有特異性的單基因。相反，Simmer及其同事(1990)提出精氨酸特異性CPS(象酵母中的cpa1和cpa2一樣)以及大鼠線粒體CPSⅠ是由嘧啶嵌合體消融而產生的。
本發明人已經分離出了編碼惡性瘧原蟲CPSⅡ酶(pfCPSⅡ)的完整基因，並確定了其特徵。本文報導的是包括5′和3′未轉譯區的cDNA序列。如此，本發明人已經識別了各個穀氨醯胺酶和合成酶區。與酵母，D.discoideum和哺乳動物中的CPSⅡ基因不同，沒有證據表明與隨後的酶，精氨酸轉氨甲醯酶(ATC ase)鍵合。這與Hill等人(1981)有關P.berghei酶的報告形成對照。然而本發明人已經發現了在天然惡性瘧原蟲基因中的兩種大插入物，而這在從前未描述過。
因此，本發明第一方面在於編碼惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ的核酸分子，該核酸分子包括實質上如表1中1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或2071-3762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列，或功能等同序列。
在本發明優選的具體方案中，該核酸分子包括表1中1225-7695所示的序列或功能等同序列。
本發明第二方面在於分離的多肽，該多肽包括實質上如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的胺基酸序列。
本文所用術語「功能等同序列」是指該核酸序列中包括了少數變化，這種變化因密碼簡併所引起，而不會導致該序列編碼不同的多肽。
本發明第三方面在於生產惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ的方法，該方法包括在本發明第一方面的核酸序列能夠表達的條件下培養用該核酸分子轉化的細胞，並回收該表達的氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ。
該細胞可以是細菌或真核細胞。優選細胞的例子包括大腸桿菌、酵母和Dictyostelium discoideum。
正如本領域專業人員所容易理解的，闡明CPSⅡ的核苷酸序列使得產生一系列治療劑成為可能。這些包括反義核苷酸、核糖酶以及用其他途徑使RNA和DNA序列成為靶向，例如形成三聯體。
正如可以從表1中所列序列看出的，該惡性瘧原蟲CPSⅡ基因包括在其他氨甲醯磷酸合成酶基因中未發現的兩個插入序列。第一個插入序列分離出了推斷結構區和穀氨醯胺酶區，而第二個插入序列分離出了兩個該合成酶亞單位的ATP結合亞區CPSa和CPSb。
表1.惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ基因的核苷酸與推斷的胺基酸序列
GAT區由兩個亞區組成推斷的結構區(1-750)和穀氨醯胺酶區(1447-2070)。這兩個亞區被第一個插入序列(751-1446，有下劃線的)分開。合成酶亞單位的兩個ATP結合亞區CPSa(2071-3762)和CPSb(5572-7173)被第二個插入序列(3763-5571，有下劃線的)分開。
由於在其他氨甲醯磷酸合成酶基因中未發現這些插入序列，因此它們代表治療的主要目標，包括但不限於反義核苷酸、核糖酶和形成核苷酸的三聯體，因為降低了與基因宿主同源染色體進行有害反應的可能性。
已知反義RNA分子適用於調節細胞內的基因表達。與部分CPSⅡ互補的反義RNA分子可以從CPSⅡ序列產生。這些反義分子可以用作檢測是否細胞中存在CPSⅡ基因的診斷探針，也可以用作調節CPSⅡ基因表達的治療劑。用CPSⅡ序列製備的反義核苷酸包括與CPSⅡ mRNA互補並能干擾其體內功能的核苷酸和含有恰好能在活細胞內轉錄以產生反義核苷酸的CPSⅡ序列成分的基因。該基因可以包括細胞、病毒、病原體信使mRNA(聚合酶Ⅱ)或結構RNA基因(聚合酶Ⅰ和Ⅲ)的啟動子成分或合成啟動子成分。在「基因調節反義RNA和DNA的生物學」(R.P.Erickson和J.G.Izant，Raven Press 1992)中回顧了反義設計。還可參見US5208149，其中包括有關反義核苷酸設計的更多例子。這些參考文獻的說明書均引入本文作為參考。
本文所用術語「核苷酸」包括但不限於所有天然產生的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以及任何核苷酸類似物的寡聚物。核苷酸類似物包括所有能與另一個核苷酸形成序列特異性複合物(例如雙鏈核酸分子或異源雙鏈核酸分子)的化合物(包括甲基膦酸類或硫代磷酸類)，而且它可以具有有利的擴散或穩定性質。該核苷酸的定義包括通過磷酸二酯鍵、肽鍵或任何其他共價鍵連接的天然鹼基或類似鹼基。這些核苷酸可以通過在活細胞中活體內的任何結合來合成、體外酶促合成或化學合成。
適用於調節CPSⅡ基因表達的核糖酶包括具有專一性和催化區的CPSⅡ序列以促使CPSⅡmRNA體外或體內分裂的核苷酸。該催化區包括錘頭、髮夾、δ-病毒成分、核糖體RNA基因內區及其衍生物。有關核糖酶設計的更多資料可見於下列文獻Haseloff，J. Gerlach，W.L.(1988)Nature 334，585;Kruger，K，Grabowski，P.J，Zaug，A.J.Sands，J，Gottschling，D.E. Cech，T.R(1982)Cell 31，147;國際專利申請WO 88/04300，US4987071和US5254678。這些參考文獻的說明書均引入本文作為參考。該催化成分可以增強通過促進降解或一些其他機理進行的CPSⅡ靶mRNA的人工調節。
三螺旋寡核苷酸可以用於抑制從基因組轉錄。本文對CPSⅡ基因提出的給定序列將能夠設計寡核苷酸，它們將形成三聯體，因而抑制CPSⅡ基因的轉錄。有關適用於三聯體形成的寡核苷酸產生的資料可見於Griffin等人的Science 245967_971(1989)，該參考文獻的說明書引入本文作為參考。
三聯體劑包括所有能夠通過與DNA或染色質形成複合物與CPSⅡ基因結合的核苷酸。該相互反應可以實現三鏈Hoogsteen結構的形成或其他機理，例如依賴於CPSⅡ序列信息的鏈侵入。
因此，本發明第四方面在於能夠分裂氨甲醯磷酸合成酶ⅡmRNA的核糖酶，該核糖酶包括從本發明第一方面的核酸分子得到的、與部分mRNA互補的序列。
在本發明此方面優選的具休方案中，該核糖酶包括從本發明第一方面的核酸分子的第一或第二種插入序列得到的、與mRNA互補的序列。
本發明的第五方面在於能夠阻礙本發明第一方面的核酸分子表達的反義寡核苷酸。
如上所述，本發明一方面涉及通過重組技術生產CPSⅡ的方法。通過該方法產生的蛋白質和本發明的多肽適用於嘗試體外藥物結合研究，以開發其他的抗瘧療法。
為了更清楚地理解本發明的性質，將參照下列實施例和圖對克隆惡性瘧原蟲CPSⅡ基因的方法進行說明。
實施例篩選基因(其中的胺基酸序列先前未檢測出)的常規方法是通過異源探測，即使用密切相關生物體目的酶的基因片段。這已經被7位工作者用惡性瘧原蟲證明是不成功的，主要是因為其基因組的高A-T含量。經過用酵母ura2基因片段分離惡性瘧原蟲CPSⅡ基因的最初無效嘗試之後(Souciet等人，1989)，本發明人選擇了用聚合酶鏈反應(PCR)(Saiki等人，1988)放大部分CPSⅡ基因，以使用放大的產物作為篩選用探針。
本發明人使用從保存的CPS基因的氨基端GAT區和第一半合成酶區序列設計的寡核苷酸分離並克隆了PCR產物。核苷酸測序證實已經得到了部分CPSⅡ基因。用限制性酶使全部寄生蟲DNA分裂，並用CPSⅡ特異性基因探針進行Southern分析。測定與基因探針雜交的DNA片段大小，然後用相應帶的DNA構建「小文庫」。用這種方法篩選pf CPSⅡ基因的較小克隆群。
為了分離全長pf CPSⅡ基因，使用已知序列的不同片段構建一系列小文庫，以使用「基因巡察」獲得該基因5′和3′末端的未知側面區信息。所使用的策略總結於
圖1中。
在首先的Southern分析中，用HindⅢ和EcoRI消化全部惡性瘧原蟲DNA，並用pfCPSⅡ 453bp PCR產物進行雜交。3.0kb HindⅢ和較小的EcoRI片段與該探針進行雜交。隨後篩選HindⅢ pTZ18U小基因庫導致含有3.0kb pfCPSⅡ基因片段CPS2的重組體分離。將453bp PCR產物定位於該片段的中間。
用CPS2的5′和3′末端的兩個區分離每端鄰近的序列，以得到更多的基因序列。CPS2的5′端HindⅢ/EcoRⅠ片段是分離進一步的1.5kb片段CPS1的工具，該CPS1由基因的全部5′區和一些非編碼序列組成。
藉助於CPS2 3′端的已知序列，得到550bp逆PCR(IPCR;Triglia等人，1988)產物。
該IPCR產物用於篩選3′區側CPS2。通過小文庫技術分離含有CPS3的3.3kb HindⅢ重組體和相關的3.3 kb XBaI克隆(未示於圖1中)。使用CPS3 3′端的200kb XbaⅠ/HindⅢ片段進行1.3kb XbaⅠ片段CPS4的克隆，該CPS4含有推測的終止密碼子和一些3′非編碼區。
這四種基因片段(CPS1、CPS2、CPS3和CPS4)結合(除去其重疊部分)得到總共8 8kb的序列，它由約7.0kb的編碼序列和1 8kb的側面序列組成。
該惡性瘧原蟲CPSⅡ基因的完整核苷酸序列與其5′和3′側面序列一起示於表1中。
對於本領域專業人員來說顯而易見的是，由本發明人分離的該基因及其側序展現了一系列治療惡性瘧原蟲感染的新途徑。本發明利用重組DNA技術能夠產生一定量的惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ。該酶的特徵使其能夠用作化學治療位點。
該基因的分離還使得能夠產生反義分子，核糖酶或其他基因失活劑，它可用於防止寄生蟲在感染個體中的增殖。
對於本領域專業人員顯而易見的是，在不背離本發明廣義描述的精神和範圍條件下，對如具體實施方案所示的本發明可以進行各種改變和/或修改。因此，本發明的具體實施方案將被認為是對所有方面的說明，而非限制。
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權利要求
1.編碼惡性瘧原蟲或其部分的氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ的核酸分子，該核酸分子包括實質上如表1中殘基1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或2071-3762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列或功能等同序列。
2.如權利要求1的核酸分子，其中該核酸分子包括如表1中1225-7695所示序列或功能等同序列。
3.分離的多肽，該多肽包括實質上如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的胺基酸序列。
4.生產惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ或其部分的方法，該方法包括在權利要求1或權利要求2的核酸序列能夠表達的條件下培養用該核酸分子轉化的細胞，並回收該表達的氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ。
5.如權利要求1的方法，其中該細胞是大腸桿菌、酵母或Dictyostelium discoideum。
6.能夠分裂氨甲醯磷酸合成酶Ⅱ mRNA的核糖酶，該核糖酶包括從權利要求1或權利要求2所述的核酸分子得到的、與部分m RNA互補的序列。
7.如權利要求6所述的核糖酶，其中所述核糖酶包括從權利要求1或2所述的核酸分子的第一或第二個插入序列得到的、與部分mRNA互補的序列。
8.能夠阻斷如權利要求1或2所述的核酸分子表達的反義寡核苷酸。
9.多核苷酸結構，它在細胞中產生如權利要求6或7所述的核糖酶或權利要求8所述的反義寡核苷酸。
全文摘要
本發明提供了編碼惡性瘧原蟲氨甲醯磷酸合成酶II的核苷酸序列。氨甲醯磷酸合成酶II催化嘧啶從頭生物合成途徑的第一步定型和限速步驟。惡性瘧原蟲僅僅依賴於嘧啶從頭生物合成，因為它不能補救嘧啶。而且認為成熟的人血紅細胞不需要嘧啶核酸。因此，該酶代表主要的化學治療位點。本發明涉及編碼氨甲醯磷酸合成酶II的序列在重組製備氨甲醯磷酸合成酶II中的用途，還涉及由該序列設計的反義分子、核糖酶及其他基因失活劑。
文檔編號C12R1/01GK1090327SQ9312169
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月3日 優先權日1992年12月3日
發明者託馬斯·斯坦利·斯圖爾特, 瑪麗亞·維加·弗洛裡斯, 威廉·詹姆斯·O·沙利文 申請人:友尼瑟馳有限公司