大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法
2023-05-02 11:50:26 1
專利名稱：大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法
技術領域：
本發明涉及蒽醌的分離，具體是大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法。
背景技術：
大黃來源蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim, ex Balf.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)的乾燥根及根莖，功效為瀉熱通 腸，涼血解毒，逐瘀通經。
大黃成分主要有蒽醌類、二苯乙烯苷類、色酮類、萘酚苷類、鞣質等，其中蒽醌類含 量為3%-5%，分為結合型蒽醌和游離型蒽醌，游離型蒽醌包括有大黃酸(rhein)、大黃素 (emodin)、 戸荼大黃素(aloe-emodin)、 大黃素甲醚(physcion)、 異大黃素(isoe modin)、 大黃酚(chysophanol)等，結合型蒽醌主要包括蒽醌苷和雙蒽醌酮苷。大黃中的蒽醌類衍生 物成分主要有瀉下作用、抗菌作用、止血活血、退熱作用、抗炎作用、防治腸源性肺損傷等 作用。
鞣質在大黃中含量為5%左右，具有收斂作用，故在致瀉後可產生繼發性便秘。大黃鞣質 可降低血管的通透性，改善脆性、興奮胃腸道的局部血管，提高離體血管條的收縮力和自發 節律性，同時也顯著增加纖維蛋白原活性，使凝血時間與出血時間明顯縮短，有助止血；另 外，鞣質還能降低抗凝血酶？的活性，升高？巨球蛋白的含量，競爭性地抑制纖溶酶及纖溶酶 原活化素的活力，使纖溶酶活力降低，並增加血小板的粘附性和聚集能力，從而加速止血， 說明大黃鞣質是大黃祛瘀止血的有效成分。
根據大黃的理化性質，其結合型蒽醌易溶於水，受熱易分解為游離型蒽醌。大黃傳統的 炮製方法，用冷水悶潤浸透再切片，在浸潤過程中， 一部分結合型蒽醌流失， 一部分由於長 時間悶潤分解，因此，飲片的結合型蒽醌含量比原淨制後的大黃根或根莖(又稱個子貨)含 量減少很多。為了增強大黃的瀉下作用，湯劑入藥一般後下，這樣既可避免結合型蒽醌分解 ，也可相對較少提取出鞣質成分。即使這樣，由於鞣質極易溶於水，大量的大黃鞣質仍可伴 隨著結合型蒽醌一起提取出來。
目前除去藥用植物中的鞣質的方法有熱處理、冷放置法、石灰乳一硫酸沉澱法、明膠沉 澱法、聚醯胺吸附法、酸性及鹼性醇沉法、鉛鹽沉澱法等。但是鞣質的其它雜質。
鞣質為大分子多元酚類混合物，有與蛋白結合成不溶性鞣酸蛋白的性質，曾有利用這個 性質用明膠除鞣質。
大豆製品在慢性腎功能衰竭中的應用曾受到嚴格限制，近年來的研究發現大豆蛋白對延 緩慢性腎衰竭有一定的有益作用。試驗中觀察到補充大豆蛋白的膳食幹預，可使收縮壓下降 4.23mmHg，舒張壓下降3 mmHg，顯示大豆蛋白可以預防高血壓，美國FDA也認可大豆蛋白具 有降膽固醇的作用。
中國專利1349966公開了 "大黃總蒽醌的提取純化方法及其在製備治療腎衰藥品中的應 用"，提取方法包括如下步驟(l)將大黃飲片和濃乙醇按l : 4一8的重量比混合，按回流法 提取三次；(2)濾過提取液，回收乙醇，將濾液製成浸膏；(3)將浸膏加入大孔吸附樹脂柱， 用重量為大黃飲片8 — 16倍的稀乙醇衝洗，棄去衝洗液，繼續用濃乙醇衝洗；(4)取洗脫液，
回收乙醇至無醇味後將洗脫液的PH值調至酸性；(5)濾過洗脫液，將沉澱得到的固體物質幹
燥即成。以大黃總蒽醌為有效成份的治療腎衰的藥品，其中大黃總蒽醌的含量應在50%以上 。本發明提取大黃總蒽醌的工藝簡單、成本低廉、且無環境汙染問題，提取出的大黃總蒽醌 對腎衰有明顯的療效。
中國專利1810756公開了 "一種超臨界二氧化碳萃取大黃總蒽醌的方法"，在本發明中 ，大黃粉末直接或經不同濃度酸溶液處理後用乙醇等溶液對其進行浸潤，放入萃取釜中以超 臨界狀態的二氧化碳為萃取溶劑，以乙醇為夾帶劑和溶劑進行提取，萃取環境為壓力20 60Mpa、溫度30 6(TC的條件下萃取0. 5 3小時，分離釜中在溫度15 45。C下減壓解析分離 ，收集含大黃總蒽醌的乙醇溶液，經減壓濃縮乾燥後得到總蒽醌提取物。
《時珍國醫國藥》2005年第16巻第8期756-758，公開的"大黃總蒽醌提取與醇化工藝的 研究"，它是用大黃加水重沸煎煮3次，每次加水15倍量，20min/次，有效成分可提取完全 。通過大孔吸附樹脂富集與醇化，用70%乙醇洗脫，總蒽醌得洗脫收率在80%以上，總固物收 率明顯降低至6. 45%。
發明內容
本發明的目的是提供一種大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法。 本發明是按照如下技術方案實現
一種大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，按重量份數比稱取淨制後的中藥材大黃個 子貨1份，加入4-15份沸水煎煮15-35min， 60-80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切片後用 沸水提取3-4次，每次加水量10-25份，時間10-40分鐘，過濾，合併全部藥液；將大豆蛋白粉O. l-0.5份加入藥液中，靜置24小時，60-80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白 提取物，實現大黃鞣質分離；取上清液通過已處理好的大孔樹脂，用50%-90%濃度乙醇洗脫 ，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
由於在本發明中使用的是大豆蛋白粉，大豆蛋白是一種食品成分，無毒無害，可以將大 黃有效成分蒽醌類成分及有效成分大黃鞣質分離。後者是與大豆蛋白結合成大黃鞣酸蛋白， 除分離得到的有效成分大黃蒽醌外，所得的大黃鞣酸蛋白也具有較高的利用價值。使用大豆 蛋白沉澱大黃提取液，既對蒽醌類成分幾乎沒有什麼影響，也可以吸附大部分鞣質，使提取 物中的鞣質含量顯著減少。因此，通過本發明可以一舉兩得，分別獲得大黃結合型蒽醌提取 物和大黃鞣酸蛋白提取物。
圖l是大黃水提取原液高效液相色譜圖譜；
圖2是大黃水提取液經大豆蛋白沉澱後的上清液高效液相色譜圖譜；
圖3是大黃洗脫液高效液相色譜圖譜。
具體實施例方式
實施例l:
(1) 挑選、洗淨的中藥材大黃個子貨(根或根莖)lkg，加沸水15 kg，煎煮30分鐘， 80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切成0.5mm-2mm的薄片，分別加IO kg沸水提取3次，每 次20分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉222g，靜置24小時，80目篩過濾，將沉澱物低溫幹 燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；上清液通過已處理好的大孔樹脂，用70%濃 度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
(2) 含量測定方法大黃結合型蒽醌含量測定，參考發明專利申請200510094530.8 " 治療腸源性內毒素血症複方藥物顆粒及其製備方法"中"結合型蒽醌的含量測定"方法。 鞣質含量測定方法參考中國藥典2005年版一部附錄XB "鞣質含量測定法"測定。
結合型蒽醌的含量測定精密吸取相當於大黃藥材O. lg的提取液於圓底燒瓶中，烘乾 ，加乙醚30 ml於40 °C水浴回流提取30分鐘，取出，放至室溫，小心吸出乙醚液，第 二次加乙醚20 ml於40 °C水浴回流提取20分鐘，取出，放至室溫，小心吸出乙醚液， 第三次加乙醚20 ml於40 °C水浴回流提取15分鐘，取出，放至室溫，小心吸出乙醚液； 殘渣揮幹乙醚，加20%硫酸溶液2.5 ml，室溫振搖5分鐘，加氯仿50 ml於80 °C水浴 回流水解60分鐘，取出，放至室溫，分取氯仿液；第二次加氯仿30 ml，振搖，稍靜置， 分取氯仿液第三次加氯仿液20 ml，振搖，稍靜置，分取氯仿液；合併氯仿液，加適量無殘渣加甲醉定容至25 ml容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的甲醇溶液為對照，色譜柱用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇1%高氯酸之比85 : 15為流動相；檢測波長254nm。
鞣質的含量測定
對照品溶液的製備
精密稱取沒食子酸對照品(購自中國藥品生物製品檢定所，批號0831 501) 54. lmg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每lml中含沒食子酸0.0541mg)。
標準曲線的製備
精密量取對照品溶液O. 5ml、 l.Oml、 2. Oml、 3. Oml、 4. Oml、 5. Oml，分別置25ml棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液lml，再分別加水11.5ml、 llml、 10ml、 9ml、 8ml、 7ml，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應的試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在760nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪製標準曲線，曲線方程為C=8. 6061 XA-0. 3763。
供試品溶液的製備
精密量取相當於約40mg藥材的提取液或洗脫液，加入50ml棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法-總酚
精密量取供試品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照標準曲線的製備項下的方法，自"加入磷鉬鎢酸試液lml"起，加水10ml，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。
-不被吸附的多酚
精密量取供試品溶液25ml，加至已盛有乾酪素0.6g的100ml具塞錐形瓶中，密塞，置30'C水浴中保溫1小時，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液2ml，置25ml棕色量瓶中，照標準曲線的製備項下的方法，自"加入磷鉬鎢酸試液lml"起，加水10ml，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。
按下式計算鞣質含量
鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量大黃鞣酸蛋白含量
大黃鞣酸蛋白含量=大黃提取液鞣質含量-蛋白吸附後上清液中鞣質含量
(3) 未經大豆蛋白粉吸附沉澱鞣質的提取液通過大孔樹脂吸附後的結合型蒽醌含量6.005mg/g，鞣質含量20.96mg/g。而本發明所述結合型蒽醌含量5. 966mg/g，且與未經吸附沉澱鞣質的大黃提取物中結合型蒽醌圖譜一致(見附圖)，含量基本沒有損失，鞣質含量7.59mg/g，減少了63.8%。
(4) 比較未經大豆蛋白吸附工藝的提取物與本發明所述的大黃提取物的瀉下作用，主要藥理實驗為小鼠小腸炭末推進法。經數據統計，有瀉下作用增強的趨勢，平均推進率由69. 2%延長至76. 3%。
(5) 本發明通過大豆蛋白吸附鞣質及大孔樹脂富集精製，即減小了提取物的體積，又增強了其瀉下藥理作用，其副產品大黃鞣酸蛋白也具有開發價值。
實施例2:
挑選、洗淨的中藥材大黃個子貨(根或根莖)lkg，加10kg沸水，煎煮20分鐘，80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切成0.5mm-2mm的薄片，分別加15kg沸水提取4次，每次15分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉125g，靜置24小時，80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；上清液通過已處理好的大孔樹脂，用60%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
實施例3:
挑選、洗淨的中藥材大黃個子貨(根或根莖)lkg，力Q4 kg沸水，煎煮15分鐘，80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切成0.5mm-2mm的薄片，分別加20kg沸水提取3次，每次30分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉333g，靜置24小時，80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；上清液通過已處理好的大孔樹脂，用80%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
實施例4;
挑選、洗淨的中藥材大黃個子貨(根或根莖)lkg，力陽kg沸水，煎煮20分鐘，80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切成0.5mm-2mm的薄片，分別加15kg沸水提取4次，每次20分鐘，合併全部藥液；加大豆蛋白粉166g，靜置24小時，80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；取上清液通過已處理好的大孔樹脂，用85%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
實施例1 -4中所述大豆蛋白粉購自河南安陽漫天雪蛋白有限公司，所用全溶解大豆蛋白粉中蛋白質含量》90% 。
權利要求
1.一種大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，其特徵在於按重量份數比稱取淨制後的中藥材大黃個子貨1份，加入4-15份沸水煎煮15-35min，60-80目篩過濾，收集藥液；大黃個子貨切片後用沸水提取3-4次，每次加水量10-25份，時間10-40分鐘，過濾，合併全部藥液；將大豆蛋白粉0.1-0.5份加入藥液中，靜置24小時，80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；取上清液通過已處理好的大孔樹脂，用50％90％濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。
2 根據權利要求l所述大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，其特 徵在於按重量份數比稱取的大黃個子貨l份，加沸水15份，煎煮30min，大黃個子貨切片後 ，分別加10份沸水提取3次，每次20分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉0.222份，上清液通 過大孔樹脂用70%濃度乙醇洗脫。
3 根據權利要求l所述大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，其特 徵在於按重量份數比稱取的大黃個子貨l份，加沸水IO份，煎煮20min，大黃個子貨切片後 ，分別加15份沸水提取4次，每次15分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉O. 125份，上清液通 過大孔樹脂用60%濃度乙醇洗脫。
4 根據權利要求l所述大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，其特 徵在於按重量份數比稱取的大黃個子貨l份，加沸水4份，煎煮15min，大黃個子貨切片後， 分別加20份沸水提取3次，每次30分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉0.333份，上清液通過 大孔樹脂用80%濃度乙醇洗脫。
5 根據權利要求l所述大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，其特 徵在於按重量份數比稱取的大黃個子貨l份，加沸水5份，煎煮20min，大黃個子貨切片後， 分別加15份沸水提取4次，每次20分鐘，合併全部藥液，加大豆蛋白粉O. 166份，上清液通過 大孔樹脂用85%濃度乙醇洗脫。
6.根據權利要求l-5所述任意一項大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離 方法，其特徵在於所述淨制後的原料藥材大黃個子貨是挑選、洗淨的大黃根或根莖。
7.根據權利要求l-5所述任意一項大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離 方法，其特徵在於所述大豆蛋白粉中蛋白質含量》90%。
全文摘要
本發明公開了一種大黃結合型蒽醌與大黃鞣質的分離方法，屬於蒽醌的分離。本發明按重量份數比稱取中藥材大黃個子貨1份，加入4-15份沸水煎煮，收集藥液；大黃個子貨切片後用沸水提取3-4次，每次加水量10-25份，過濾，合併全部藥液；將大豆蛋白粉0.1-0.5份加入藥液中，靜置、60-80目篩過濾，將沉澱物低溫乾燥得大黃鞣酸蛋白提取物，實現大黃鞣質分離；取上清液通過已處理好的大孔樹脂，用50％-90％濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，乾燥，得大黃結合型蒽醌提取物。由於大豆蛋白是一種食品成分，無毒無害。因此，本發明一舉兩得，分別獲得大黃結合型蒽醌提取物和大黃鞣酸蛋白提取物。
文檔編號A61K36/185GK101664449SQ20091030731
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月18日 優先權日2009年9月18日
發明者伍孝先, 劉俊紅, 卓玉珍, 吳鹹中, 李棣華, 趙連根 申請人:天津市南開醫院