一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法

2023-05-01 19:12:31

專利名稱：一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法，製備的紫菌紅 素乙在食品行業具有良好的應用前景，屬於食品生物技術領域。
背景技術：
類胡蘿蔔素(carotenoids)是一類呈黃色、橙黃色或紅色的多烯類化合物， 所有的光合生物以及許多非光合細菌、古菌和真菌均可在體內合成類胡蘿蔔素。 類胡蘿蔔素具有著色、抗氧化、抑癌、防動脈硬化、增強免疫、有利視覺保護 等多種功能，在食品、飼料、化妝品、醫藥等方面具有廣泛的應用前景。目前， 類胡蘿蔔素已被FA0和WHO等國際組織認定為A級營養色素，並在50多個國家 和地區作為營養、著色雙重功能的食品添加劑而被廣泛應用於保健食品及醫藥 和化妝品工業。類胡蘿蔔素通常可通過化學合成、植物提取和微生物發酵三種 方法生產，但由於微生物發酵法生產類胡蘿蔔素具有不受環境條件限制、便於 工業化生產、工藝簡單、質量穩定、成本低等優點，因此近年來引起國內外的 普遍重視。
類胡蘿蔔素種類很多，如番茄紅素、a-胡蘿蔔素、胡蘿蔔素、葉黃素、 玉米黃素、紫菌紅素等。紫菌紅素乙(又名玫紅品，Rhod叩in)，是紫菌紅素的 一種，是無環四萜類化合物的天然類胡蘿蔔素。純品為紫色結晶，熔點182 183°C (苯/石油醚)，分子式是C4。H580，結構式為
郝常明等(1999)通過柱層析和薄層色譜分析了光合細菌中的類胡蘿蔔素， 結果表明，光合細菌中存在番茄紅素、紫菌紅素乙和紫菌紅素丁三種類胡蘿蔔 素。呂曉玲等(2003)用薄層層析法、分光光度法以及HPLC法對紅酵母中的色 素成分進行分離和初步鑑定，共分離出四種組分，其中組分4可能是P-胡蘿蔔 素，2和3可能是類胡蘿蔔素中的紫菌紅素和丫-胡蘿蔔素，組分1屬於非類胡 蘿蔔素。平山修(1978)發現在培養Rp.capsulatus達到後期時，在5000 Lux 下培養的菌體含有相當多的螺菌黃素和羥基螺菌黃素，而在100 Lux下培養的 菌體中番茄紅素和紫菌紅素積累較多。
紫菌紅素乙主要來源於微生物，已報導的來源微生物主要有紅假單胞菌、 光合細菌、紅酵母等，目前尚無關於從螢光假單胞菌提取紫菌紅素乙天然色素 的報導。本製備方法的發明人之一趙博光在其發明專利(ZL 200410065471.7)
中公開了一種無菌松材線蟲的培養方法，其中飼餵松材線蟲的食物之一是滅活
的螢光假單胞菌(Pseudomonas fluoresceins)GcM5-lA ( CCTCCNo: M 204065)。 我們在培養這種細菌時發現，在合適的培養基及培養條件下，該菌能積累一種 紫紅色的成分，該成分的吸收光譜與類胡蘿蔔素的吸收光譜相似，我們進一步 優化了適合該菌累積這種色素的培養基、培養條件以及色素提取方法。本發明 首次公開了一種利用螢光假單胞菌(/^et^o/z70/7as /7woresce/7S GcM5-lA)製備 紫菌紅素乙的方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用微生物製備紫菌紅素乙的新方法，該方法 提供了一種可用於製備紫菌紅素乙的新的微生物，即螢光假單胞菌GcM5-lA
(屍sei/a^077as /7"oresce/is GcM5-lA)。依據該方法製備的紫菌紅素乙可廣泛 用作食品或化妝品添加劑。
為實現上述目的，本發明首先培養螢光假單胞菌GcM5-lA，所用的培養基為 改良LB液體培養基(1.0% NaCl，1.0%蛋白腖，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01% MgS04 ，pH7.5)，培養溫度是25-32"C，振蕩培養時，搖床轉速為100 200r/min，大量培養時間為12 24h,再轉接到大量的改良LB培養基中，相同 條件下繼續培養12 64h，得溼菌體。
培養液中的菌體經離心收集，用蒸餾水懸浮後，超聲波細胞破碎後，用1 6倍於蒸餾水體積並添加了終濃度為0. 01% 0. 1%維生素C的丙酮於25-50。C浸 提，為加快提取速度，可在超聲條件下浸提。離心，取上清液，反覆浸提三次， 合併浸提液，減壓濃縮，得到紫菌紅素乙粗品。
紫菌紅素乙粗品經矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先 洗脫出來的色素帶，減壓濃縮後，於-18'C結晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍幹 燥後，即得到紫菌紅素乙純品，所用的洗脫劑石油醚與乙酸乙酯的體積比為2: 1-1: 2，優選體積比為1: 1。
本發明方法優化了適合螢光假單胞菌GcM5-lA累積紫菌紅素乙的培養基、 培養條件以及色素提取方法，提供了一種製備紫菌紅素乙的新方法，工藝簡單， 操作方便。本發明得到的紫菌紅素乙純品經薄層層析分析和EIMS鑑定，結構與 紫菌紅素乙標準品的結構一致。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。 實施例1:
第一步，細菌培養與色素提取
挑取螢光假單胞菌(Psewc/o/z o77as/7woresce/7sGcM5-lA)單菌落於20mL改 良LB液體培養基(1.0% NaCl，1.0%蛋白腖，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，28。C，165r/min振蕩培養24h;後轉接到2L改良LB 培養基中，相同條件下繼續培養48h。 8000g離心15min收集菌體，得溼菌體 15. 9g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，0。C條件下進行超聲波細胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反覆15次)後，加入300ml添加了終濃度為0.05%維生素(作為抗 氧化劑的丙酮，封口後，於45。C下超聲波振蕩浸提4h， 4'C，10000g離心10min， 取上清液。反覆浸提3次，合併浸提液，減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品浸膏1. lg。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上矽膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:l) 作為洗脫劑，共得到三個明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮後，於-18。C結晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍乾燥後，得紫菌紅素乙純品 48. 6mg。
紫菌紅素乙的結構鑑定
採用Agilent5973型質譜儀(EI離子源)對樣品給出產品質譜，數據處理 後的譜圖與標準譜庫中的紫菌紅素乙的譜圖匹配，匹配度達90%;純品與紫菌 紅素乙標準品的丙酮溶液同時進行TLC(GF254)分析，分別以石油醚-乙酸乙酯(2: 1)，石油醚-丙酮(2: 1)，石油醚-乙酸乙酯(3: 1)做展開劑，兩者的RF值 均一致，確定所得到的產品為紫菌紅素乙。
實施例2:
第一步，細菌培養與色素提取
挑取螢光假單胞菌(/^e"t/o/Ho/7as/7i/aresce77sGcM5-lA)單菌落於20mL改 良LB液體培養基(1.0% NaCl，1.0%蛋白腖，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0. 01% MgS04 ， pH7. 5)中，25°C， 200r/min振蕩培養12h;後轉接到2L改良LB 培養基中，相同條件下繼續培養64h。 8000 g離心15min收集菌體，得溼菌體 16.7g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，0。C條件下進行超聲波細胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反覆15次)後，加入50ml添加了終濃度為0.0W維生素C作為抗氧 化劑的丙酮，封口後，於25。C下超聲波振蕩浸提5h， 4。C，10000g離心10min， 取上清液。反覆浸提3次，合併浸提液，減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品浸膏0. 99g。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上矽膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=2:l) 作為洗脫劑，共得到三個明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮後，於-18。C結晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍乾燥後，得紫菌紅素乙純品 41. 3mg。
實施例3:
第一步，細菌培養與色素提取
挑取螢光假單胞菌(/^ewc/o/z o/7as/7woresce/7sGcM5-lA)單菌落於20mL改 良LB液體培養基(1.0% NaCl，1.0%蛋白腖，0. 5%酵母提取物，1. 0%葡萄糖， 0.01%MgS04 ，pH7.5)中，32°C， 100r/min振蕩培養12h;後轉接到2L改良LB 培養基中，相同條件下繼續培養12h。 8000g離心15min收集菌體，得溼菌體 11.8g。
菌體懸浮在50ml蒸餾水中，(TC條件下進行超聲波細胞破碎(160w，工作10s， 間隔15s，反覆15次)後，加入300ml添加了終濃度為0. 1呢維生素C作為抗氧 化劑的丙酮，封口後，於50。C下超聲波振蕩浸提2h, 4。C,10000g離心10min， 取上清液。反覆浸提3次，合併浸提液，減壓濃縮,得紫菌紅素乙粗品浸膏0. 91g。 第二步，紫菌紅素乙的純化
將紫菌紅素乙粗品上矽膠柱(2. 6X20 cm)，以石油醚-乙酸乙酯(v/v=l:2) 作為洗脫劑，共得到三個明顯的洗脫帶，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃 縮後，於-18。C結晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍乾燥後，得紫菌紅素乙純品 39. 4mg。
權利要求
1.一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法，其特徵在於按如下步驟操作用改良LB液體培養基培養螢光假單胞菌GcM5-1A；培養液中的菌體經離心收集，用蒸餾水懸浮後，超聲波細胞破碎，用1～6倍於蒸餾水體積並添加了終濃度為0.01％～0.1％維生素C的丙酮於25-50℃浸提，離心，取上清液，反覆浸提三次，合併浸提液，減壓濃縮，得到紫菌紅素乙粗品；紫菌紅素乙粗品經矽膠柱層析，以體積比為21-12的石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃縮後，於-18℃結晶，得紫色的晶體，過濾、冷凍乾燥後，即得到紫菌紅素乙純品。
2、 根據權利要求1所述的一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法， 其特徵在於所用的改良LB液體培養基為1. 0% NaCl， 1. 0%蛋白腖，0. 5%酵母提 取物，1.0%葡萄糖，0.01% MgS04 ，pH7.5，培養溫度是25-32°C，振蕩培養時， 搖床轉速為100 200r/min,大量培養時間為12 24小時，再轉接到大量改良 LB培養基中，相同條件下繼續培養12 64小時，得溼菌體。
3、 根據權利要求1所述的一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法， 其特徵在於對菌體進行超聲波細胞破碎的條件是(TC，16(k，工作10s，間隔15s， 反覆15次。
4、 根據權利要求1所述的一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法， 其特徵在於為加快紫菌紅素乙的提取速度，採用超聲振蕩浸提2-5小時。
5、 根據權利要求1所述的一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法， 其特徵在於洗脫劑石油醚與乙酸乙酯的優選體積比為1: 1。
全文摘要
本發明涉及一種利用螢光假單胞菌製備紫菌紅素乙的方法。用改良LB液體培養基培養螢光假單胞菌GcM5-1A；培養液中的菌體用蒸餾水懸浮後，超聲波細胞破碎，用1～6倍於蒸餾水體積並添加了終濃度為0.01％～0.1％維生素C的丙酮浸提，將浸提液減壓濃縮，得紫菌紅素乙粗品；粗產品經矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，收集最先洗脫出來的色素帶，減壓濃縮，低溫結晶，紫色晶體經過濾、冷凍乾燥後，即得到紫菌紅素乙純品。本方法優化了適合螢光假單胞菌GcM5-1A累積紫菌紅素乙的培養基、培養條件以及色素提取方法，工藝簡單，操作方便，製備的紫菌紅素乙可廣泛用作食品或化妝品添加劑。
文檔編號C12P7/04GK101368191SQ20081013982
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月11日 優先權日2008年9月11日
發明者李榮貴, 趙博光, 郭群群, 郭道森 申請人:青島大學;趙博光