化學鎖定的雙特異性抗體的製作方法

2023-05-02 09:07:26 2

本公開提供了用於以高特異性和高均一性形成化學鎖定的雙特異性或異源二聚體抗體(優選IgG類)的方法。更具體地，本公開提供了具有利用生物正交點擊化學(bio-orthogonalclickchemistry)連接的連接區的化學鎖定的雙特異性IgG類抗體。相關申請的交叉引用本專利申請要求2014年5月10日提交的61/991,508號美國臨時專利申請的優先權。
背景技術：
：人免疫球蛋白G或IgG抗體以四個亞類存在，每個亞類具有不同的結構和功能特性。IgG由兩個重鏈-輕鏈對(半抗體)組成，該重鏈-輕鏈對通過直接連接鉸鏈區中的Cys殘基(EU索引編號：半胱氨酸殘基226和229；Kabat編號：半胱氨酸殘基239和242)的重鏈間二硫鍵連接。人IgG4分子以各種分子形式存在，其通過重鏈間二硫鍵的存在或不存在而不同。已經開發了多種多樣的重組抗體形式，例如通過融合IgG抗體形式和單鏈結構域的四價雙特異性抗體(Coloman等，NatureBiotech15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison，NatureBiotech25(2007)1233-1234)。另一種形式具有不再保留的抗體核心結構(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如雙體抗體、三體抗體或四體抗體、微抗體、幾種單鏈形式(scFv、Bis-scFv)。但是這類形式能夠結合兩個或更多的抗原(Holliger等，NatureBiotech23(2005)1126-1136；Fischer和Leger，Pathobiology74(2007)3-14；Shen等，J.ImmunologicalMethods318(2007)65-74；和Wu等，NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。US2005/0163782中報導了用於從包含其中通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體和其中未通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的該兩種類型混合物中將通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體與未通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優先合成通過至少一個鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。雙特異性抗體是難以使用傳統的雜種雜交瘤和化學偶聯方法以足夠數量和質量產生的材料。此外，WO2005/062916和美國專利申請2010/0105874描述了如何通過還原抗體「AA」和抗體「BB」以將二硫鍵分離成具有單一結合區域的單重鏈-輕鏈單元(A或B)(其中A和B兩者結合不同的靶標)來形成雙特異性抗體。然後，抗體允許二硫鍵發生異構化，以使得抗體AB、BA、AA和BB各自以約25％的概率重組。然而，AB和BA兩者是相同的雙特異性抗體，且因此最多表現出約50％的產率。因此，這需要額外的步驟來將形成的所需的雙特異性抗體從原始的重組抗體分離。然而，美國專利申請2010/0105874指向具有CPSC序列的IgG4中的鉸鏈區，並且陳述：「CPSC序列導致更靈活的核心鉸鏈和形成鏈內二硫鍵的可能性….據信具有IgG4樣核心鉸鏈序列的抗體可以具有用於重排二硫鍵的內在活性，其通過本發明方法中使用的條件模擬」(第0013段)。此外，已經製備了其他形式的雙特異性抗體，其具有通過改變抗體A和B的重鏈序列產生的「杵和臼」結構。因此，本公開提供了產生化學鎖定的雙特異性IgG抗體的方法，其滿足本領域對雙特異性抗體的很高產率的需要並且比改變固定的抗體區域中的胺基酸序列的杵和臼方法具有更好的穩定性。技術實現要素：本公開提供了用於從IgG1、IgG2或IgG4類抗體或其Fab2片段「A」和IgG1、IgG2或IgG4類抗體或其Fab2片段「B」產生化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」的方法。該方法包括：(a)在足以切割鉸鏈區中重鏈之間的基本上所有二硫鍵的條件下使所述第一抗體「A」與還原劑接觸，以產生一對第一抗體片段A'，每個第一抗體片段A'包含連接於單一重鏈的單一輕鏈，其中所述重鏈具有一個或多個由所述二硫鍵的還原形成的反應性巰基；(b)將第一異雙官能接頭連接到所述第一抗體片段A'，其中所述第一異雙官能接頭包含(i)用於與所述第一抗體片段A'的所述重鏈的反應性巰基共價連接的第一巰基反應性官能團，和(ii)疊氮化物，從而形成疊氮化物官能化的第一抗體片段；(c)在足以切割鉸鏈區中重鏈之間的基本上所有二硫鍵的條件下使所述第二抗體「B」與還原劑接觸，以產生一對第二抗體片段B'，每個第二抗體片段B'包含連接於單一重鏈的單一輕鏈，所述重鏈具有一個或多個由所述二硫鍵的還原形成的反應性巰基；(d)將第二異雙官能接頭連接到所述第二抗體片段B'，所述第二異雙官能接頭包含：(i)用於與所述第二抗體片段的所述重鏈的反應性巰基共價連接的第二巰基反應性官能團，和(ii)炔；從而形成炔官能化的第二抗體片段；(e)使所述疊氮化物官能化的第一抗體片段與所述炔官能化的第二抗體片段反應以通過所述疊氮化物與所述炔的1,3-偶極環加成將所述第一抗體片段共價連接於所述第二抗體片段，從而形成化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」。還原鉸鏈區中二硫鍵的步驟優選在基本上不還原重鏈和輕鏈之間的二硫鍵的條件下進行，這意味著，在一些實施方式中，至少約90％或至少約95％或至少約99％的這類重鏈和輕鏈之間的二硫鍵在鉸鏈區中的二硫鍵裂解後保持完整。優選地，第一異雙官能接頭具有Q-L-N3的形式，其中Q是巰基反應性官能團，L是烴接頭，且N3是疊氮化物。優選地，該巰基反應性官能團Q是滷代烷(例如，烷基氯、烷基溴或烷基碘)、苄基滷、馬來醯亞胺、滷代馬來醯胺(溴代馬來醯亞胺)或二滷代馬來醯亞胺(二溴代馬來醯亞胺)。優選地，L是在Q和N3之間直鏈中具有3-60個原子(例如，更典型地為6-50個)的烴接頭。更優選地，L是聚環氧烷(PEF)基團或L是其中每個鏈節(mer)單元是–(CH2CH2–O)n或(O–CH2CH2)n–的聚合物(其中「n」獨立地是1-20的整數，更通常為1-8)。優選地，第一異雙功能性接頭(連接到第一抗體片段)是：其中Q可以是適合於將接頭連接到抗體片段上的任何基團，但優選能夠與來自重鏈鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的巰基共價鍵合。示例性基團Q是：其中Z獨立地選自H、Br、I和SPh。優選地，至少一個Z不是H，儘管在馬來醯亞胺的情況下，Z在每次出現時可以是氫。M獨立地為CR*或N。X1、X2、X3、X2、X4和X5獨立地選自鍵(即不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–(C＝O)–(CH2)n–、(C＝O)–O–(CH2)n–、(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中「n」為0或1-10的整數。Ra、Rb、Rc和Rd獨立地選自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和2-8元的環狀烴、雜環、芳基或雜芳基環；其中「n」獨立地為0或1-10的整數；和其中「l」、「p」、「q」和「r」獨立地為0或1-10的整數。Ω是鍵(即，其不存在)或者是C3-26烴環或稠環系統，任選地包含至多四個稠合環，其中每個環具有3-8元和任選地在每個環中包含1-4個選自O、S和N的雜原子。優選地，Ω是與環辛烷環稠合或與8元雜環或環系統稠合的1,2,3-三唑環。R*和RN在每次出現時獨立地為H或C1-12烴，任選被1-6個選自滷素、O、S和N的雜原子取代；和其中任何兩個基團R*和/或RN可以一起形成3-8元環。所述第二異雙官能接頭具有Q-L-G的形式，其中Q是巰基反應性官能團，L是烴接頭，和G是含炔基團。巰基反應性官能團Q選自烷基滷(例如烷基氯、烷基溴或烷基碘)、苄基滷、馬來醯亞胺、滷代馬來醯胺(例如溴代馬來醯亞胺)和二滷代馬來醯亞胺(如，二溴代馬來醯亞胺)。L是在Q和G之間直鏈中具有3-60個原子(例如，優選6-50個)的烴接頭。優選地，L是聚環氧烷基團(PEG)，優選地，L是單元–(CH2CH2–O)n–或–(O–CH2CH2)n–(其中「n」獨立地為1-20的整數，更通常為1-8)的聚合物。G是能夠與疊氮化物發生環加成的任何含炔基團。在一些實施方式中，G包含末端炔，例如-C≡CH。在其它的實施方式中，G包括在環中具有-C≡C-鍵的環或環系統。在一個實施方式中，G包含具有-C≡C-鍵的C8環。在一個實施方式中，含-C≡C-的環是應變的(strained)。第二異雙功能接頭具有以下形式：Q與第一異雙功能接頭中的相同或不同。Q通常是以下形式的巰基反應基團：其中Z在每次出現時獨立地選自H、Br、I和SPh。在一些實施方式中，至少一個Z不是H，儘管在馬來醯亞胺的情況下，Z在每次出現時可以是氫。M在每次出現時獨立地為CR*或N。G通常是包含能夠與疊氮化物發生1,3偶極環加成反應的-C≡C-鍵的C8-20烴基。在一些實施方式中，G具有-C≡C-H的形式。在其它實施方式中，G包含具有-C≡C-鍵的環。特別地，G可以包含具有三鍵的8-元環(例如環辛炔)。該環可任選地與一個、兩個或更多的另外的環稠合，該另外的環通常為C3-6環烴環，包括芳基、雜芳基和雜環。含三鍵的8-元環可以在環中包括一個或多個(例如1-4個)雜原子，例如氮和氧。在一個實施方式中，8元環在環中含有氮原子，其提供與L的連接點，如在以下所示的示例性結構中：優選地，G具有以下形式：X1、X2、X3、X2、X4和X5在每次出現時獨立地選自鍵(即，不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–、–NRN–(C＝O)–O–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中「n」為0或1-10的整數；Ra、Rb、Rc和Rd在每次出現時獨立地選自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元環狀烴、雜環、芳基或雜芳基環；其中「n」在每次出現時獨立地為0或1-10的整數；和其中「l」、「p」、「q」和「r」獨立地為0或1-10的整數；Ω是鍵(即，不存在)或者為C3-26烴環或稠環系統，任選地包含至多四個稠合環，每個環具有3-8元和在每個環中任選地包含獨立地選自O、S和N的1-4個雜原子；在一個實施方式中，Ω將包括與環辛烷環稠合或者與8元雜環或環系統稠合的1,2,3-三唑環。R*和RN在每次出現時獨立地為H或C1-12烴，任選地被1-6個選自滷素、O、S和N的雜原子取代；並且其中兩個基團R*和/或RN可以一起形成3-8元環。疊氮化物和炔之間的環加成反應可以通過1,3偶極環加成反應進行。該反應可以由銅離子催化。在一些實施方式中，環加成反應在中性或生理pH下發生。本公開還提供了一種用於具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號：殘基226-229；Kabat編號：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的還原抗體「A」和具有鉸鏈殘基序列(殘基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗體「B」以形成半抗體A和半抗體B的方法，該方法包括：(a)還原各個抗體A和抗體B，由此還原條件破壞具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號：殘基226-229；Kabat編號：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的各抗體鉸鏈區中的任何鏈間或鏈內二硫鍵；(b)將選自於以下的化合物連接於半抗體A的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的半抗體A：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；(c)將選自以下的化合物連接於抗體B的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基226和229(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的抗體B：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑中進行的，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優選地，具有一個或兩個Cys殘基的抗體A的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分A連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N。優選地，具有一個或兩個Cys殘基的抗體B的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分B連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，以形成連接的半抗體B。本公開還提供了一種化學鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N，結合於連接的抗體B以形成具有圖10所示結構的雙特異性抗體AB。本公開提供了來自IgG類抗體「A」或其片段和IgG類抗體「B」的化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」，其包含具有選自以下結構的半抗體A：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；和其中Z是離去基團；和具有選自以下的結構的半抗體B：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh。本公開進一步提供了雙特異性抗體，其包含：(a)第一抗體片段A'，其包含來自抗體A的單一重鏈和輕鏈，所述重鏈具有一個或多個反應性巰基基團；(b)第二抗體片段B'，其包含單一重鏈和輕鏈，所述重鏈具有一個或多個反應性巰基基團；其中所述第一和第二抗體片段通過經由疊氮化物和炔的環加成反應形成的1,2,3-三唑共價連接，所述疊氮化物通過接頭連接於所述第一抗體片段的反應性巰基，和炔通過接頭連接於所述第二抗體片段的反應性巰基。上文描述了接頭。抗體片段A'和B'衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白或其Fab2片段。本公開進一步提供了與接頭共價鍵合的抗體片段，其中所述接頭包含具有能夠與疊氮化物發生環加成反應的-C≡C-鍵的C8環。本公開還提供了與接頭共價鍵合的抗體片段，其中所述接頭包含能夠與-C≡C-鍵發生環加成反應的疊氮化物。優選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B在還原劑中進行，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優選地，具有一個或兩個Cys殘基的抗體A的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分A連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N連接於半抗體A的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的半抗體A；(c)將選自以下的化合物連接於抗體B的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基226和229(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的抗體B：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑中進行的，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優選地，具有一個或兩個Cys殘基的抗體A的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分A連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh其中N3是–N＝N＝N。優選地，具有一個或兩個Cys殘基的抗體B的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分B連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，以形成連接的半抗體B。本公開還提供了一種化學鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N；結合於連接的抗體B以形成具有圖10所示結構的雙特異性抗體AB。本公開提供了來自IgG類抗體「A」和IgG類抗體「B」的化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」，其包含具有選自以下的結構的半抗體A：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N，和其中Z是離去基團，其結合於；和具有選自於以下的結構的半抗體B：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh。附圖說明圖1顯示了設置通過與IgG類抗體的鉸鏈區中的單個Cys殘基的化學偶聯來產生雙特異性mAb的示意圖。圖2顯示了根據本公開通過與IgG類抗體的鉸鏈區中的單個Cys殘基化學偶聯的鏈間交聯的示意圖。圖3顯示了與IgG類抗體的鉸鏈區內的兩個Cys殘基鏈內交聯的示意圖。圖4顯示(上和下)通過與IgG類抗體的鉸鏈區內的兩個Cys殘基的鏈間交聯產生雙特異性mAb的示意圖。圖5顯示化學鎖定的半mAb片段的SDSPAGE分析。圖6顯示來自裸mAb(上)、疊氮化物偶聯的mAb片段(中間)和炔偶聯的mAb片段(下)的HCFab的MS分析。圖7顯示來自疊氮化物連接的半mAb和炔連接的半mAb片段的交聯產物的SDSPAGE。圖8顯示來自初始mAb(上)和交聯產物(下)的(Fab)2的MS分析。圖9顯示了本文實施例4中產生的化學修飾的半抗體片段的非還原SDSPAGE(泳道2和3)。圖10顯示通過兩個半抗體片段之間的點擊偶聯(Clickconjugation)產生雙特異性抗體。圖11顯示半抗體片段(a)和點擊產物(b)的非還原SDSPAGE。半抗體-疊氮化物在凝膠(a)的泳道2中，和半抗體-DBCO在凝膠(a)中的泳道3。點擊產物在凝膠(b)中的泳道2中。圖12顯示了示出雙特異性抗體CBA-0710的質量的IdeS消化的點擊產物的質譜。圖13顯示雙特異性抗體CBA-0710的SEC尺寸排阻色譜。圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710在BIAcore上的結合。更具體地，圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710與BIAcore上的兩種抗原的2個同時的結合。圖15顯示雙特異性抗體CBA-0710與三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231結合。該細胞表達抗原-1和抗原-2。STI-A0607是抗抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗抗原-2單克隆抗體。圖16顯示雙特異性抗體CBA-0710在三陰性乳腺癌細胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗抗原2單克隆抗體。HGF是抗原-1的天然配體。圖17顯示了響應於雙特異性抗體CBA-0710的IFN-γ釋放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。競爭mAb是人源化抗抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。圖18顯示響應於雙特異性抗體CBA-0710的IL-2釋放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。競爭mAb是人源化抗抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。圖19顯示與常規抗-c-MetIgG1和抗-PD-L1IgG1抗體相比，由A抗c-Met抗體和B抗PD-L1抗體組成的化學鎖定雙特異性抗體改善的功效。圖20顯示通過化學偶聯產生雙特異性F(ab)'2的示意圖。圖21顯示F(ab)'2和F(ab)'的SDS_PAGE凝膠分析。第1列是用IdeS消化的抗體A。第2列是用IdeS消化的抗體B。第3列是經消化並除去FC的抗體A。第4列是經消化並除去FC的抗體B。第5列是經消化並去除FC，用2MEA和TCEP還原和與DBCO(二苯並環辛基)-馬來醯亞胺偶聯的抗體A。第6列是經消化並去除FC，用2MEA和TCEP還原和與疊氮化物-馬來醯亞胺偶聯的抗體B。圖22顯示通過兩個F(ab)'片段之間的點擊偶聯產生F(ab)'2化學鎖定雙特異性抗體的示意圖。圖23顯示了來自本文實施例7的點擊F(ab)'2的SEC。圖24顯示點擊雙特異性F(ab)'2片段分析SDSPAGE。第1列是經消化並除去FC的抗體A，並用與DBCO(二苯並環辛基)-馬來醯亞胺偶聯的2MEA和TCEP還原。第2列是經消化並且除去FC的抗體B，並用與疊氮化物-馬來醯亞胺偶聯的2MEA和TCEP還原。第3列是點擊_雙特異性F(ab)'2。圖25顯示了點擊產物的質譜，其示出了雙特異性F(ab)'2的質量。圖26示出了點擊F(ab)'2的SEC。圖27顯示雙特異性F(ab)'2與OctetRed上的兩種抗原的同時結合。圖28顯示了通過化學偶聯產生雙特異性IgG2的示意圖。圖29顯示IgG2片段分析SDSPAGE。第1列是抗體A。第2列是用TCEP還原並與疊氮化物-馬來醯亞胺偶聯的抗體A。第3列是抗體B。第4列是用TCEP還原並與疊氮化物-馬來醯亞胺偶聯的抗體B。圖30A-C顯示了質譜圖，其示出了與接頭偶聯的IgG2_A(圖30A)、與接頭偶聯的IgG2_B(圖30B)和IgG2_A與IgG2_B之間形成的雙特異性IgG2(圖30C)的質量。圖31顯示了IgG2_A、IgG2_B和點擊產物的SEC。具體實施方式雙特異性抗體(BsAb)由在鉸鏈區化學連接的兩個半抗體片段組成(圖1)。初始抗體是IgG1或IgG4同種型。初始抗體可以含有修飾的鉸鏈區，其中Cys殘基首先突變為Ser，在鉸鏈處僅留下一個二硫鍵。雙特異性抗體的產生涉及三個主要步驟。第一步是選擇性地還原抗體A和B兩者以形成半抗體片段。第二步是通過基於半胱氨酸的偶聯將功能性部分X或Y引入每個半抗體片段的鉸鏈區中，分別導致化學修飾的抗體片段半體A'和B'。在最後一步中，兩個抗體片段半體通過X和Y部分之間的化學接合連接在一起，以形成雙特異性抗體。本公開提供了用於從IgG類抗體「A」和IgG類抗體「B」產生化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」的方法，其包括：(a)還原具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號：殘基226-229；Kabat編號：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第一抗體「A」和具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號：殘基226-229；Kabat編號：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗體「B」以形成半抗體A和半抗體-B，其中抗體A結合第一靶標和抗體B結合第二靶標，由此還原條件破壞具有鉸鏈殘基序列(殘基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的一類抗體的鉸鏈區中的任何鏈間或鏈內二硫鍵；(b)將來自式I的化合物連接於半抗體A的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的半-抗體A，其具有選自於以下的結構：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；(c)將來自式II的化合物連接於抗體B的鉸鏈核心序列的一個或兩個Cys殘基(EU索引編號：殘基226和229；Kabat編號：殘基239和242)以形成連接的抗體B，其具有選自於以下的結構：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優選地，在還原劑，如L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合中進行抗體A的還原以形成半抗體A和抗體B的還原以形成半抗體B。優選地，具有兩個Cys殘基的抗體A的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分A連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh其中N3是–N＝N＝N。優選地，具有兩個Cys殘基的抗體B的鉸鏈區與具有選自以下的結構的部分B連接：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh。本公開進一步提供了一種化學鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N；結合於連接的抗體B以形成具有圖10所示結構的雙特異性抗體AB。本公開提供了來自IgG類抗體「A」和IgG類抗體「B」的化學鎖定的雙特異性抗體「AB」或「BA」，其包含具有選自以下的結構的半抗體A：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；和具有選自於以下的結構的半抗體B：M＝N、CM』＝N、CZ＝I、Br、SPh。優選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑如，L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合中進行的。優選地，抗體A和B是單克隆抗體。單克隆抗體可以通過雜交瘤方法或通過重組DNA和蛋白質表達方法產生。此外，抗體A和B是全長抗體或是抗體片段。抗體A和B具有CPPC核心鉸鏈區序列或CPSC核心鉸鏈區序列或SPPC核心鉸鏈區序列或SPSC核心鉸鏈區序列(EU索引編號：殘基226-229；Kabat編號：殘基239-242)。此外，步驟(d)溫育還包括添加還原劑的步驟，其中還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。可以使用常規生物化學技術如吸光度測量、HP-SEC、SDS-PAGE、非變性PAGE和RP-HPLC來分析所得的雙特異性抗體的質量和純度。應當注意，因為式I的接頭對式II的接頭的親和性的特異性，所公開的方法通常避免任何純化步驟。然而，在US2010/0105874中提供了各種純化步驟，其公開內容通過引用併入本文。所公開的方法還包括配製雙特異性抗體用於治療用途的步驟。這通過在適合人類使用的，特別是適於腸胃外或靜脈內施用的水性溶液中有效量的雙特異性抗體的製劑來實現。圖2顯示了通過化學偶聯產生雙特異性單克隆抗體(mAb)的方案。本文所述的雙特異性mAb由在鉸鏈區化學連接的兩個半抗體片段組成。雙特異性mAb產生的過程包括三個主要步驟(圖2)。第一步是分別在兩種不同mAbA和B中選擇性還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過接頭X或Y誘導每個mAb中相同重鏈上的兩個半胱氨酸之間的鏈內連接。鏈內連接過程產生兩個化學鎖定的mAb片段A'和B'。在最後一步中，兩個mAb片段通過X和Y之間的化學接合連接在一起，以形成雙特異性抗體AB。具有鉸鏈突變(CPSC)的IgG1、wtIgG4和具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4用於本研究中。第一步是還原抗體A和抗體B中的每一個。在一個實施方式中，用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM的二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理抗體(10mg)2小時。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM的離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進行總共三次洗滌。蛋白質濃度對於1.0mg/mL溶液使用在280nm處1.58的吸光度值來定量，並且使用150,000g/mol的分子量測定摩爾濃度。在還原步驟的另一個實施方式中，將抗體(10mg)用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理2小時。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘，從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進行總共3次洗滌。在還原步驟的另一個實施方式中，將mAb(10mg)用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0摩爾當量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理2小時。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用於偶聯步驟。第二步是偶聯步驟。將在0.1MPBS中的來自還原步驟的部分還原的mAb「抗體A」加入到2.5摩爾當量的交聯劑Z-X-Z中(圖2和圖3)。交聯劑取自預製備的DMSO儲備溶液(1mg/mL)。在反應混合物中，部分還原抗體濃度為8.0mg/mL，和DMSO含量為5％(v/v)。在24℃下進行偶聯2小時。用半胱氨酸(1mM終濃度)來淬滅任何未反應的過量交聯劑。使用磷酸鹽緩衝鹽水平衡的PD-10柱純化偶聯的mAb。偶聯的mAb結構示於圖4中。在相同條件下，將第二mAb(抗體B)與交聯劑Z-Y-Z(圖5和圖6)偶聯並純化。偶聯的mAb結構示於圖7和圖8中。第三步是鏈間偶聯步驟。在圖9中說明了用於鏈間交聯的點擊偶聯。簡言之，對於在0.5mLPBS(0.1M，pH7.4)中的疊氮化修飾的抗體片段(3.0mg)，加入0.5mLPBS(0.1M，pH7.4)中的3.0mg的炔修飾的抗體片段。向該混合物中加入50μL乙腈且乙腈的最終含量為5％(v/v)。在室溫下反應3小時後，使用100kDa過濾器離心管在3,000RPM下離心20分鐘來純化混合物。將混合物用PBS洗滌3次，並將所得產物進行體外表徵。實施例1該實施例表明了根據所公開的方法的雙特異性抗體的合成。圖4顯示了通過與IgG類抗體的鉸鏈區中的兩個Cys殘基的化學偶聯產生雙特異性單克隆抗體(mAb)的方案。所公開的雙特異性mAb由在其各自鉸鏈區處化學連接的兩個半抗體片段組成。合成雙特異性mAb的方法包括圖5中所示的三個主要步驟。第一步是分別在兩種不同的mAb(A和B)中選擇性地還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過接頭X或Y在每個mAb中誘導相同重鏈上的兩個半胱氨酸之間的鏈內連接。鏈內連接過程產生兩個化學鎖定的mAb片段A'和B'。在最後一步中，兩個mAb片段通過X和Y之間的化學接合連接在一起以形成雙特異性抗體AB。更具體地，我們獲得了抗體「A」，一種具有鉸鏈突變(CPSC)的IgG1，和抗體「B」，一種野生型IgG4。第一步是抗體還原。條件1：將抗體(10mg)單獨地用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理2小時。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb中純化掉。用0.1MPBS進行總共三次洗滌。對於1.0mg/mL溶液使用280nm處1.58的吸光度值對蛋白質濃度進行定量，並使用150,000g/mol的分子量測定摩爾濃度。條件2：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理抗體(10mg)2小時。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進行總共3次洗滌。條件3：用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩爾當量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理mAb(10mg)2小時。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用於偶聯。實施例2該實施例顯示，在實施例1中製備的雙特異性抗體保留了其原始半Mab的兩種結合特徵。1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮的合成：向在60mLTHF中的2.5g3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)和1gNMM滴加MeOCOCl(10mmol，940mg，在10mlDCM中)，攪拌20分鐘，然後將反應溶液用60mLDCM稀釋，用水洗滌3次，將有機相用無水硫酸鈉攪拌，濃縮，得到2.65g3,4-二溴-2,5-二氧代-2H-吡咯-1(5H)-羧酸甲基酯。向311mg，1mmol該化合物中加入2-(2-疊氮基乙氧基)乙胺(130mg，1mmol)和5mLDCM，TLC顯示反應在20分鐘內完成，然後通過DCM和鹽水萃取，用NH4Cl溶液洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，且然後濃縮用於柱純化，用2:1己烷和乙酸乙酯閃蒸，得到230mg的1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮。1HNMR：3.32ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.40ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.50ppm(q，J＝5.0Hz，1H)，3.62ppm(t，J＝，1H)，3.63-3.69ppm(m，3H)，3.84ppm(t，J＝5Hz，1H)。Fw：365.9，C8H8Br2N4O3；質譜峰(1:2:1)：366.9,368.9,370.9。實施例3該實施例說明了使用位於IgG類抗體的鉸鏈區中的單個Cys殘基來化學產生雙特異性抗體。本文所述的起始mAb含有工程化的鉸鏈區，其中各條鏈上相同位置處的一個Cys突變為Ser，從而產生僅留下單一二硫鍵的鉸鏈。雙特異性mAb產生的過程包括三個主要步驟(圖1)。第一步是分別在兩種不同的mAbA和B中選擇性地還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過基於半胱氨酸的偶聯引入功能性基團X或Y。Cys-連接步驟產生兩個化學鎖定的mAb片段A'和B'。在最後一步中，兩個mAb片段通過X和Y之間的化學接合連接在一起以形成雙特異性抗體AB。在本研究中使用具有鉸鏈區突變(SPPC)的IgG1單克隆抗體。條件1：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理抗體(10mg)2小時。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進行總共三次洗滌。對於1.0mg/mL溶液使用在280nm處1.58的吸光度值來定量蛋白質濃度，並且使用150,000g/mol的分子量測定摩爾濃度。條件2：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理抗體(10mg)2小時。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1M的PBS進行總共3次洗滌。條件3：用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩爾當量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理mAb(10mg)2小時。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用於偶聯。實施例4該實施例顯示了根據本文公開的方法製備雙特異性抗體且具有將各個半抗體片段的鉸鏈區彼此連接的所公開的化學連接結構的方法。抗體支架是：具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4。我們首先通過化學修飾改變各Ig抗體以產生半抗體。具體地，緩衝液交換反應將抗體(0.5-3mg)加入到15mL的過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並添加適當量的pH8.0的PBS1mMDTPA(二亞乙基三胺五乙酸)緩衝液至管上的50mL標記。將管在5℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉移到1.5mL塑料小瓶中並使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計)檢查濃度。最終抗體濃度在5-8mg/mL之間。製備在pH8.0PBS(1.0mMDTPA)緩衝液中1mg/mLTCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲備溶液。我們使用下表計算需要加入到抗體中的TCEP溶液的體積，這取決於緩衝液交換後回收的抗體的當量數和最終質量。將適當量的TCEP溶液(通過上表計算)加入到抗體溶液中，輕輕渦旋，並將小瓶置於轉盤上。在室溫下進行還原反應90分鐘。基於上表的計算製備在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的DBCO-馬來醯亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)儲備溶液。將DMSO中的DBCO-馬來醯亞胺加入到抗體樣品(無TCEP的純化)中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下在通過轉盤的混合條件下將偶聯反應進行1小時。將每個樣品置於單獨的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並加入適當量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無鈣或鎂)緩衝液至管上的50mL標記。將樣品以3,000RPM在5℃下離心20分鐘。再次重複洗滌步驟。洗滌後，將樣品轉移到單獨的1.5mL塑料小瓶中，並置於冰箱(5℃)中。對於IgG4抗體，4.0當量的TCEP提供了大量的半抗體。對於IgG1抗體，3.5當量的TCEP提供了大量的半抗體。對於兩種類型的抗體使用5.0當量的DBCO。向在DMSO(0.12mL)中的DBCO-馬來醯亞胺(1.0mg，1.0當量)溶液中加入在DMSO(0.6mL)中的疊氮基-PEG4-疊氮化物(2.5mg，5.0當量)。將混合物在室溫下攪拌2小時。如通過LC/MS所示反應完成。所得疊氮化物-馬來醯亞胺的分子量為627.65g/mol。疊氮化物-馬來醯亞胺合成(方案1)：方案1.疊氮化物-馬來醯亞胺的合成將DMSO中的疊氮化物-馬來醯亞胺(5.0當量)加入到抗體樣品中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在通過轉盤的混合下將偶聯反應在室溫下進行1小時。如前所述洗滌樣品。通過疏水相互作用柱(HIC)純化各半抗體片段。HIC分析使用TOSOH丁基-NPR柱在40℃柱溫和0.6mL/min流速下進行。在50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)中降低的鹽濃度(從1.5至0M硫酸銨)和增加的有機改性劑(從0％至25％異丙醇)的30分鐘梯度實現洗脫。通過SDSPAGE分析半抗體片段。具體地，對於每個待分析的樣品，需要0.6mg/mL濃度的20μL。我們遵循建立方案運行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)。圖9顯示化學修飾的半抗體片段(泳道2和3)的非還原SDSPAGE。實施例5該實施例說明了通過點擊反應產生雙特異性抗體。圖10顯示通過兩個半抗體片段之間的點擊偶聯產生雙特異性抗體。兩個半抗體片段之間的點擊反應示於圖10中。向在PBS中的半抗體疊氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的半抗體-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。反應在室溫下在通過轉盤的混合條件下進行2小時。將混合物進行SDSPAGE分析(圖11)並通過離子交換色譜純化。在Agilent1200HPLC上使用ThermoWCX-10柱以0.6mL/min流速純化雙特異性抗體。用在pH5.7的10mMMES緩衝液中增加的鹽濃度(從0至100mMNaCl)的30分鐘梯度實現洗脫。通過IdeS蛋白酶消化雙特異性抗體STICBA-0710，並在WaterXevoG-2QTOF質譜上進行分析和確認(圖12)。通過雙特異性抗體的尺寸排阻色譜(SEC)確定雙特異性抗體STICBA-0710的生物物理性質(圖13)。具體地，在Agilent1200HPLC上使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)分析雙特異性抗體。緩衝液為0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。表2.雙特異性抗體CBA-0710的SEC數據主HMWSLMWS98.3％1.2％0.5％圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710在BIAcore上的結合。使用標準NHS/EDC偶聯方法將第一抗原固定在CM5傳感器晶片上至約1500RU。運行緩衝液用作基線。加載雙特異性抗體，然後緩衝液，然後進行針對第二抗原的結合。實施例6該實施例顯示了本文產生的雙特異性抗體的各種測定結果。存在雙特異性抗體的基於細胞的結合和功能。雙特異性抗體CBA-0710結合MDA-MB-231(人乳腺癌)細胞(圖15)，如通過流式細胞術測定的。測定了抗體的EC50值。用無酶細胞解離緩衝液(GIBCO)收穫表達抗原-1和抗原-2兩者的MDA-MB-231三陰性乳腺癌(TNBC)細胞，並轉移至V-形底96孔板(50,000個細胞/孔)。將細胞與FACS緩衝液(PBS+2％FBS)+NaN3中的雙特異性抗體CBA-0710或者親本單特異性抗抗原-1或抗抗原-2抗體的系列稀釋物在冰上溫育45分鐘。在FACS緩衝液中洗滌2次後，加入1：1000稀釋的藻紅蛋白偶聯抗人IgG(γ-鏈特異性的)，並溫育30分鐘。在最後洗滌後，在Intellicyt高通量流式細胞儀(HTFC)上測量螢光強度。使用GraphpadPrism軟體和非線性回歸擬合分析數據。數據點顯示為陽性標記細胞的中值螢光強度(MFI)+/-標準誤差。EC50值報告為達到與細胞的50％最大結合的抗體濃度。結果示於表3和圖15中，並且顯示與親本類型相比，雙特異性抗體與MDA-MB-231細胞的結合改善，具有類似於抗-抗原-2抗體的亞納摩爾EC50值，和與抗抗原-1抗體一樣高的結合強度。表3.雙特異性抗體和親本型抗體的結合數據顯示了雙特異性抗體CBA-0710的拮抗活性。具體來說，按照Phospho-Met(panTyr)SandwichELISA試劑盒#7333方案運行雙特異性抗體CBA-0710對c-MET磷酸化的抑制。簡言之，將細胞裂解物加入重構的檢測抗體並溫育，然後加入重構的HRP-接頭二級抗體。洗滌後，加入TMB底物並溫育。加入STOP溶液後，讀取結果。圖16顯示雙特異性抗體CBA-0710在三陰性乳腺癌細胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗-抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗-抗原2單克隆抗體。HGF是抗原-1的天然配體。存在雙特異性抗體CBA-0710的免疫調節活性。為了測量雙特異性抗體CBA-0710調節T細胞反應性的能力，將純化的CD4+細胞與同種異基因樹突細胞一起培養，其通過在GM-CSF和IL-4中培養單核細胞7天而製備。設置平行平板以允許在第3天和第5天收集上清液而使用商業ELISA試劑盒分別測量IL-2和IFNγ。競爭的人源化抗-抗原-2(免疫檢查點)mAb內部產生並用作陽性對照IgG1，並且不相關的STI人mAb用作陰性對照IgG抗體。圖17顯示響應於雙特異性抗體CBA-0710的IFN-γ釋放增加。STI-A1010是抗-抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。競爭mAb是人源化抗-抗原-2(免疫檢查點)單克隆抗體。實施例7該實施例說明了使用F(ab)'2抗體A'和B'合成所公開的雙特異性抗體的方案。本文所述的雙特異性F(ab)'2由在鉸鏈區化學連接的兩個F(ab)'片段組成(圖20)。起始抗體是IgG1或IgG4同種型。起始抗體含有修飾的鉸鏈區，其中Cys殘基突變為Ser殘基，從而在鉸鏈區僅留下一個二硫鍵。雙特異性F(ab)'2化學鎖定雙特異性抗體的產生涉及四個主要步驟。第一步是除去Fc片段。第二步是分別選擇性還原抗體A和B。第三步是通過基於半胱氨酸的偶聯在鉸鏈區中引入功能性部分X或Y，從而分別產生化學修飾的抗體片段A'和B'。在最後一步中，兩個抗體片段通過X和Y之間的化學接合連接在一起以形成雙特異性F(ab)'2。該合成的方案示於圖21中。具體地，我們進行了用具有鉸鏈突變(SPPC)的IgG1A抗體和具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4B抗體合成F(ab)'2化學鎖定雙特異性抗體的方法。使用酶IdeS(其是僅在鉸鏈區之下的一個特異性位點切割IgG的消化酶)，將抗體(1.5mg)加入到IdeS(A0-FR1-008)的各個管中，並在37℃下在翻轉式搖床(headtoheadspinner)上溫育過夜。然後使用蛋白A純化除去Fc片段。將抗體(1-10mg)加入到15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並加入適當量的50mM磷酸鈉，150mMNaCl，5mMEDTA，pH7.7緩衝液至管上的50mL標記。將管在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉移到1.5mL塑料小瓶中，並使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計)檢查濃度。最終抗體濃度高達10mg/mL。向含有6mg2-巰基乙胺·HCl的一個小瓶中加入1mL的50mM磷酸鈉，150mMNaCl，5mMEDTA，pH7.7緩衝液(得到50mM2-MEA)。加入50mM2-MEA至F(ab)'2終濃度15mM，充分混合。在37℃下溫育15分鐘。使用NAP-5(GE17-0853-02)脫鹽柱從還原的F(ab)'2分離2-MEA。製備在pH8.0的PBS(1.0mMDTPA)緩衝液中的1mg/mLTCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲備溶液。取決於蛋白A純化後回收的F(ab)'2的當量數和最終質量，將5當量的TCEP加入到脫鹽的F(ab)'中，充分振搖，並在室溫下溫育5分鐘。對於DBCO(二苯並環辛基)-馬來醯亞胺和疊氮化物-馬來醯亞胺偶聯，製備DBCO-馬來醯亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的儲備溶液，並且將在DMSO中的20當量的DBCO-馬來醯亞胺加入到F(ab)'(A)樣品(沒有TCEP的純化)中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉盤的混合進行偶聯反應2小時。將在DMSO中的疊氮化物-馬來醯亞胺(20當量)加入到F(ab)'(B)樣品中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉盤的混合進行偶聯反應2小時。對於洗滌步驟，將每個樣品置於單獨的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並加入適當量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無鈣或鎂)緩衝液至管上的50mL標記。將樣品在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。再次重複洗滌步驟。洗滌後，將樣品轉移到單獨的1.5mL塑料小瓶中，並置於冰箱(5℃)中或用於點擊步驟。對於F(ab)'片段分析，使用SDSPAGE程序。對於每個待分析的樣品，需要濃度為0.6mg/mL的20μL。遵循已建立的方案運行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)(圖21)。兩個F(ab)'片段之間的點擊反應方案示於圖23中。向PBS中的F(ab)'-疊氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的F(ab)'-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。在室溫下通過轉盤的混合進行反應過夜。將混合物進行SEC分析(圖24)。使用尺寸排阻色譜(SEC)分析在本實施例中製備的雙特異性抗體的生物物理性質。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC分析F(ab)'_A、F(ab)'_B和雙特異性點擊_F(ab)'2(圖24)。緩衝液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。通過質譜法證實雙特異性F(ab)'2。在WaterXevoG-2QTOF9上分析雙特異性F(ab)'2(圖25)。使用尺寸排阻色譜(SEC)純化雙特異性F(ab)'2。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC用於純化雙特異性點擊_F(ab)'2(圖26)。緩衝液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。體外親和力測量是使用OctetRed的測量(圖27)。傳感器AR2G用於測量OctetRed(ForteBio，Inc.)上的雙特異性F(ab)'2抗原相互作用。簡言之，測量方案如下：300秒基線；300秒加載10μg/ml雙特異性F(ab)'2，120秒基線；300秒抗原A；300秒解離；300秒抗原B和300秒解離(圖27)。在PBS中進行傳感器水合及基線-和解離測量。實施例8該實施例說明了使用IgG2抗體A'和B'合成所公開的雙特異性抗體的方案。本文所述的雙特異性IgG2由在鉸鏈區化學連接的兩個IgG2片段組成(圖29)。起始抗體是IgG2同種型。雙特異性IgG2的產生涉及三個主要步驟。第一步是還原IgG2抗體鉸鏈區中的(四個中的)一個或兩個二硫鍵，其仍然保持同源二聚體結構。第二步是通過基於半胱氨酸的偶聯在鉸鏈中引入功能性部分X或Y，從而分別導致化學修飾的抗體片段A'和B'。在最後一步中，通過X和Y之間的化學接合將兩種抗體連接在一起以形成雙特異性IgG2。具體地，我們進行了用於合成IgG2化學鎖定的雙特異性抗體的方法。將抗體(1-10mg)加入到15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並加入適當量的50mM磷酸鈉、150mMNaCl、5mMEDTA，pH7.7緩衝液至管上的50mL標記。將管在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉移到1.5mL塑料小瓶中，並使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計)檢查濃度。最終抗體濃度高達10mg/mL。製備在pH8.0的PBS(2.0mMDTPA)緩衝液中的1mg/mL的TCEP((三(2-羧基乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲備溶液。根據IgG2的當量數和所得質量，將2當量的TCEP加入到IgG2溶液中，充分搖動並在室溫下溫育90分鐘。DBCO(二苯並環辛基)-馬來醯亞胺和疊氮化物-馬來醯亞胺為了偶聯，製備DBCO-馬來醯亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的儲備溶液，並將DMSO中的5當量的DBCO-馬來醯亞胺加入到IgG2_A樣品(沒有TCEP的純化)。抗體樣品中的DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉盤的混合進行1小時偶聯反應。將DMSO中的疊氮化物-馬來醯亞胺(5當量)加入到IgG2(B)樣品中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉盤的混合進行1小時偶聯反應。對於洗滌步驟，將每個樣品置於單獨的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，並加入適當量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無鈣或鎂)緩衝液至管上的50mL標記。將樣品在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。再次重複洗滌步驟。洗滌後，將樣品轉移到單獨的1.5mL塑料小瓶中，並置於冰箱(5℃)中或用於點擊步驟。對於每個待分析的樣品，需要0.6mg/mL濃度的20μL。遵循已建立的方案運行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)(圖29)。對於質譜，用TCEP還原抗體A，並與DBCO偶聯，在WaterXevoG-2QTOF上進行分析。該數據表明2個DBCO(僅一個二硫鍵還原)或4個DBCO(兩個二硫鍵還原)與我們的IgG2偶聯(圖30A-C)。使用尺寸排阻色譜(SEC)分析在該實施例中製備的雙特異性抗體的生物物理性質。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC來分析雙特異性IgG2(圖31)。緩衝液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp