一株可利用木質纖維素原料發酵生產2,3-丁二醇的嗜熱地衣芽孢桿菌的製作方法

2023-05-02 10:01:31 2

一株可利用木質纖維素原料發酵生產2,3-丁二醇的嗜熱地衣芽孢桿菌的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株可利用木質纖維素原料發酵生產2,3-丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，該菌株名為地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）3F-3，其已於2012年6月27日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC?NO：M2012253。本發明的菌株能以木質纖維素原料(木糖、木糖母液及秸稈水解液)為底物，在42-55℃條件下以高於理論轉化率90%的轉化率生產2,3-丁二醇，其2,3-丁二醇濃度最高可達92克/升，體積生產效率最高可達1.1克/升/小時，具有很好的經濟效益和社會效益。
【專利說明】一株可利用木質纖維素原料發酵生產2, 3- 丁二醇的嗜熱地衣芽孢桿菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株地衣芽孢桿菌，尤其涉及一株可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]2，3-丁二醇廣泛應用於化工、食品、燃料及航天航空等多個領域(Appl MicrobiolBiotechnol, 2001，55(1): 10-18)。因其熱值較高(27，200kJ/kg)，同乙醇(29，100kJ/kg)相當，可用作燃料添加劑；可代替1，4-丁二醇，用於聚酯和聚亞安酯的合成；其脫水產物甲乙酮是一種低沸點溶劑，廣泛應用於塗料、潤滑劑、燃料等行業，同時又可作為有機合成香料、抗氧化劑等的中間體；其脫水產物1，3- 丁二烯可用來合成橡膠單體，是一種重要的石油化工基礎有機原料；同甲乙酮縮合加氫形成辛烷，可用於生產高級航空用油。
[0003]目前2，3-丁二醇的生產方法主要是微生物發酵法，通常採用的菌株包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)等(JBiotechnol, 1993，27 (3): 317-329)。用於2，3- 丁二醇發酵的原料主要為葡萄糖、蔗糖、澱粉、木薯粉等原料，其中葡萄糖和蔗糖等精製糖，其產量較高，均在150克/升以上；但精製糖成本較高，不利於2，3- 丁二醇的工業化生產。
[0004]木質纖維素是世界上最豐富的生物質可再生資源，其主要是由纖維素、半纖維素和木質素組成。目前國內外已知的利用發酵木質纖維素原料生產2，3-丁二醇的菌株多為克雷伯氏菌，但其潛在的致病性，限制了其在2，3-丁二醇生產中的應用。芽孢桿菌具有生物安全性，但芽孢桿菌對木質纖維素原料中木糖的利用能力較弱，如多粘芽孢桿菌，其以木糖為底物發酵24小時2，3- 丁二醇產量為7.2克/升(Appl MicrobiolBiotechnol, 2004，64:11 2 - 119);地衣芽孢桿菌發酵木糖24小時產量為13.8克/升(Biotechnol Bioeng, 2012, 109:1610-1621)，無法實現工業規模化生產。
[0005]嗜熱芽孢桿菌由於其具有較高的發酵溫度(42~60°C)，可大大降低發酵過程中汙染雜菌的機率；同時，以較高的溫度進行發酵，還能降低發酵液粘度，有利於後續步驟的操作或處理，節約能耗和生產成本。然而經檢索，可利用木質纖維素原料發酵生產2，3- 丁二醇的嗜熱地衣芽孢桿菌還未見報導。

【發明內容】

[0006]針對現有2，3- 丁二醇生產中菌株及發酵方法的不足，本發明要解決的問題是提供一株可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌。
[0007]本發明所述可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，其特徵在於:該菌株名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 3F-3,其已於2012年6月27日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏號為:CCTCCN0:M2012253o[0008]上述的可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，其生物學特徵是:形態為棒杆狀，長1.5 μ m~3.0 μ m,直徑0.6 μ m~0.7 μ m,菌落顏色為黃色或白色，產芽孢；生理生化特徵是:VP反應呈陽性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖產酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含70克/升NaCl的培養基中生長，可在 42~60°C條件下生長；16S rDNA序列長度為1369bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0009]上述的可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌的16S rDNA序列與已知的其他地衣芽孢桿菌的16S rDNA序列有99~100%的相似性。[0010]本發明所述嗜熱地衣芽孢桿菌在利用木質纖維素原料發酵生產2，3- 丁二醇中的應用。[0011]將本發明所述嗜熱地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253以常規方法先接入種子培養基中，在42~55°C培養8~12小時，然後再以常規方法轉接入發酵培養基，發酵條件為: 培養溫度42~55°C，培養方式為攪拌培養(通氣量為0.5vvm~1.0vvm)，攪拌轉速200~ 500轉/分鐘，旋轉半徑為33_，培養時間18~60小時，製得含有2，3- 丁二醇的發酵液。[0012]將發酵液8，OOO轉/分鐘離心10分鐘，取上清液稀釋，檢測2，3_ 丁二醇含量。[0013]上述種子培養基每升中含有:木糖30~50克，酵母粉5~10克，玉米漿乾粉5~ 15克，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉2~6克，氯化鉀I~2克，硫酸鎂0.2克，餘量為水；pH為 6~7。115°C滅菌20分鐘。[0014]上述發酵培養基每升中含有:酵母粉5~20克，蛋白腖5~20克，玉米漿乾粉5~ 20克,大肽5~20克,大豆蛋白腖5~20克五種氮源中的至少一種；另外每升發酵培養基中還含有:木質纖維素原料(如木糖、秸杆水解液或木糖母液等)80~160mL，其中原料中含有初糖量不少於500克/升，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉I~6克，氯化鉀2克，硫酸鎂0.2克，其餘為水；pH為6~7。115°C滅菌20分鐘。[0015]上述發酵條件優選培養溫度50~55°C ,培養時間18~48小時。[0016]本發明的特點及有益效果是:本發明提供的嗜熱地衣芽孢桿菌CCTCC NO: M2012253是生物安全菌株，可同時利用木質纖維素原料中的葡萄糖和木糖；該菌株以木質纖維素原料為底物，在42~55°C條件下發酵獲得的2，3- 丁二醇最高濃度可達92克/升， 生產強度可達1.1克/升/小時；相比已有產2，3- 丁二醇菌株明顯產量高，生產強度大；本發明提供的嗜熱地衣芽孢桿菌CCTCC NO舊2012253在生產2，3-丁二醇中，利用高溫發酵過程的優勢，汙染雜菌的機率小，並充分利用木質纖維素原料，符合可持續發展的國策，具有很好的經濟效益和社會效益。【具體實施方式】[0017]下面通過實施例進一步闡明本發明，但不僅限於此。[0018]實施例1:利用木糖發酵生產2，3- 丁二醇篩選嗜熱地衣芽孢桿菌菌株[0019]從果園等地取得土樣，用篩選培養基浸泡2小時，在500mL錐形瓶中裝浸泡液 IOOmL,在50°C條件下，置於搖床上以180轉/分鐘的轉速培養24小時。將培養液以10_2、 10_3、10_4、10_5、10_6五個稀釋度塗布在固體篩選培養基的培養皿中，50°C培養12小時。挑單菌落，擴大培養，以木糖為碳源，通過VP反應進行初篩。根據反應時間和顏色變化篩選出陽性菌株。篩選原理是2，3- 丁二醇在鹼性條件下氧化為雙乙醯，與肌酸或胍類衍生物所合成紅色物質，加入α-萘酚、肌酸可以促進反應。然後測定初篩的陽性細菌的2，3-丁二醇產量，挑選其中最高產量的菌株。
[0020]上述得到的產量最高的菌株為地衣芽孢桿菌3F-3。
[0021]上述篩選培養基配方為:1L蒸餾水中含:50克木糖，10克蛋白腖，5克酵母粉，10克NaCl，115 °C條件下滅菌20分鐘。固體篩選培養基是在上述配方的基礎上加入20克/升的瓊脂粉。
[0022]上述地衣芽孢桿菌3F-3菌株形態為棒杆狀,長1.5 μ m~3.0 μ m,直徑0.6 μ m~
0.7 μ m，菌落顏色為黃色或白色，產芽孢，VP反應呈陽性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖產酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含70克/升NaCl的培養基中生長，可在42~60°C條件下生長。其16S rDNA序列長度為1369bp，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,與已知的其他地衣芽孢桿菌的16S rDNA序列有99~100%的相似性。
[0023]上述菌株名為地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)3F_3,其已於2012年6月27日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCC NO:M2012253。
[0024]實施例2:製備地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株的細胞液體培養物
[0025]挑取固體含糖LB培養基斜面培養的地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株一環，接種在裝有滅菌的IOOmL種子培養基的500mL錐形瓶中，在50°C條件下，置於搖床上以180轉/分鐘的轉速培養12小時，即製得地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株的細胞液體培養物。
[0026]上述含糖固體LB培養基每升含有:40克木糖，10克蛋白腖，5克酵母粉，10克NaCl，20克瓊脂粉，115 °C條件下滅菌20分鐘。
[0027]上述種子培養基每升含有:木糖50克，酵母粉5克，玉米漿乾粉15克，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉2克，氯化鉀I克，硫酸鎂0.2克，餘量為水；所述種子培養基的pH為6~7，115°C條件下滅菌20分鐘。
[0028]實施例3:利用地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株以發酵培養基I在5L發酵罐中發酵生產2，3-丁二醇
[0029]將通過實施例2的方法獲得的地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株的細胞液體培養物，以體積比10%的接種量接種在裝有滅菌的4L發酵培養基的5L發酵罐中，在50°C條件下，發酵罐攪拌轉速400轉/分鐘,通氣量為0.5vvm~1.0vvm, DNS法檢測木糖含量,當木糖濃度低於20克/升時補加木糖，發酵36小時，可得到濃度為75~92克/升的2，3- 丁
二醇發酵液。
[0030]上述發酵培養基I配方如下:
[0031]木糖60克/升，酵母粉10克/升，玉米漿乾粉15克/升，磷酸二氫鉀4克/升，乙酸鈉2克/升，氯化鉀2克/升，硫酸鎂0.2克。115°C條件下滅菌20分鐘。
[0032]實施例4:利用地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株以發酵培養基2在5L發酵罐中發酵生產2，3-丁二醇
[0033]將通過實施例2的方法獲得的地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株的細胞液體培養物，以體積比10%的接種量接種在裝有滅菌的4L發酵培養基的5L發酵罐中，在50°C條件下，發酵罐攪拌轉速400轉/分鐘，通氣量為0.5vvm~l.0vvm，DNS法檢測總糖含量(葡萄糖和木糖)，總糖濃度低於20克/升時補加玉米秸杆水解液，發酵48小時，可得到濃度為65~73克/升的2，3- 丁二醇發酵液。[0034]上述發酵培養基2配方如下:[0035]玉米秸杆水解液100ml/升，酵母粉10克/升，玉米漿乾粉10克/升，磷酸二氫鉀 4克/升，乙酸鈉I克/升，氯化鉀2克/升，硫酸鎂0.2克。115°C條件下滅菌20分鐘。[0036]其中玉米秸杆水解液含有葡萄糖400克/升，木糖115克/升，為長春大成新資源集團有限公司提供。[0037]實施例5:利用地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株以發酵培養基3在5L發酵罐中發酵生產2，3-丁二醇[0038]重複實施例3的操作，只是將發酵培養基I改為發酵培養基3，發酵至第36小時 2，3- 丁二醇的濃度達到61.0g/L。[0039]上述發酵培養基3配方如下:[0040]玉米秸杆水解液120ml/升，玉米漿乾粉15克/升，磷酸二氫鉀4克/升，乙酸鈉 6克/升，氯化鉀2克/升，硫酸鎂0.2克。115°C條件下滅菌20分鐘。[0041]其中玉米秸杆水解液為長春大成新資源集團有限公司提供。[0042]實施例6:利用地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2012253菌株以發酵培養基4在5L發酵罐中發酵生產2，3-丁二醇[0043]重複實施例3的操作，只是將發酵培養基I改為發酵培養基4，發酵至第54小時 2，3- 丁二醇的濃度達到57.0g/L。[0044]上述發酵培養基4配方如下:[0045]木糖母液80ml/升，玉米漿乾粉15克/升，蛋白腖5克/升，磷酸二氫鉀4克/升， 乙酸鈉3克/升，氯化鉀2克/升，硫酸鎂0.2克。115°C條件下滅菌20分鐘。[0046]其中，木糖母液中含有葡萄糖90克/升，木糖450克/升，阿拉伯糖146克/升； 山東龍力生物科技股份有限公司 提供。
【權利要求】
1.一株可利用木質纖維素原料發酵生產2，3- 丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，其特徵在於: 該菌株名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)3F_3,其已於2012年6月27日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCC NO:M2012253。
2.如權利要求1所述的可利用木質纖維素原料的發酵生產2，3-丁二醇嗜熱地衣芽孢桿菌，其生物學特徵是:形態為棒杆狀，長1.5 μ m~3.0 μ m,直徑0.6 μ m~0.7 μ m,菌落顏色為黃色或白色，產芽孢；生理生化特徵是:VP反應呈陽性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖產酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含70克/升NaCl的培養基中生長，可在42~60oC條件下生長；16S rDNA序列長度為1369bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
【文檔編號】C12R1/10GK103497917SQ201310473033
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】馬翠卿, 李理想, 高超, 許平 申請人:山東大學