一種斑鳩黴素的生物合成基因簇及其應用的製作方法
2023-05-01 22:07:41
一種斑鳩黴素的生物合成基因簇及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種斑鳩黴素的生物合成基因簇及其應用。斑鳩黴素的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第3411-15678位所示，包含3個基因：雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶基因ikaA、FAD依賴的氧化還原酶基因ikaB及類Michael環化反應酶基因ikaC。本發明所提供的斑鳩黴素的生物合成相關的所有基因和蛋白信息，有助於闡釋多環tetramate大環內醯胺家族天然產物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供理論基礎和材料。本發明所提供的基因及蛋白可以用於自然界中挖掘或創製可用於醫藥衛生及工農業的化合物或基因和蛋白。
【專利說明】一種斑鳩黴素的生物合成基因簇及其應用
【技術領域】
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[0001]本發明屬於微生物基因工程領域，具體涉及一種斑鳩黴素的生物合成基因簇及其應用。
【背景技術】
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[0002]斑鳩黴素(Ikarugamycin)屬於多環tetramate大環內醯胺類化合物,其結構式如圖1的式I所示，其具有獨特5-6-5三環系統以及抗菌及抗腫瘤細胞等多種生物活性。目前斑鳩黴素已作為抗腫瘤先導化合物引起關注，相應的具體藥理機制正在深入研究中。
[0003]近年來蓬勃發展起來的組合生物合成技術，為改造斑鳩黴素的生產菌Streptomyces sp.ZJ306帶來了新的機遇。在闡明了自然界的生物合成途徑、理解自然界聚酮化合物天然組合生物合成機理的基礎上，人們可以採用組合生物合成技術對抗生素的生物合成基因、調控基因進行體內敲除、突變、置換和重組等操作，不但能夠生產「非天然」的天然產物結構類似物，而且還可以提高天然產物的產量，或定向積累所需要的天然產物，為天然產物的發現和藥物開發提供化合物結構和生物活性多樣化。
[0004]迄今為止，有關珠江口源微生物中斑鳩黴素生物合成基因簇、類Michael環化反應酶等生物催化製備斑鳩黴素及基因敲除獲得斑鳩黴素類似物等，國內外尚未見報導。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的是提供一種斑鳩黴素的生物合成基因簇。
[0006]本發明是以珠江口沉積物源放線菌Streptomyces sp.ZJ306中斑鳩黴素為目標分子，在篩選到生物合成基因簇基礎上，綜合運用分子生物學、微生物學、合成生物學、生物化學及有機化學相結合的技術，闡明了斑鳩黴素的生物合成機制，為利用組合生物合成方法修飾改造斑鳩黴素類似物提供依據，為藥物篩選提供化合物實體。
[0007]本發明的斑鳩黴素生物合成基因簇來源於珠江口沉積物放線菌Streptomycessp.ZJ306，其特徵在於，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3411-15678位的鹼基序列所示，包括3個基因,具體為:
[0008](I)負責斑鳩黴素的聚酮-鳥氨酸-聚酮骨架合成的基因，即ikaA，位於核苷酸序列(SEQ ID N0.1，下同)第3411-12785個鹼基處，長度為9375個鹼基對，編碼雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶，3124個胺基酸；
[0009](2)負責斑鳩黴素骨架合成修飾的另一個基因，即ikaB，位於核苷酸序列第12782-14614個鹼基處，長度為1833個鹼基對，編碼FAD依賴的氧化還原酶，610個胺基酸；
[0010](3)負責斑鳩黴素的還原型環化反應的基因，即ikaC，位於核苷酸序列第14614-15678個鹼基處，長度1065個鹼基對，編碼乙醇脫氫酶，354個胺基酸。
[0011]SEQ ID N0.1 (序列表)所示序列的第3411-15678位鹼基序列的互補序列可根據DNA鹼基互補原則隨時得到，且第3411-15678位鹼基序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用合適的限制性內切酶酶切相應DNA或DNA重組技術獲得。
[0012]本發明提供了構建至少包含部分SEQ ID N0.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段的重組DNA載體途徑。
[0013]本發明還提供了創製斑鳩黴素生物合成基因被阻斷或異源表達等其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含SEQ ID N0.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段。
[0014]本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探針法或Southern雜交等技術，從其他生物體重篩選獲得斑鳩黴素的生物合成基因簇同源基因。
[0015]本發明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用於Streptomyces sp.ZJ306基因組文庫中定位更多的文庫質粒。這些文庫質粒至少包括本發明中的部分序列，也包含Streptomyces sp.ZJ306基因組中鄰近區域未克隆DNA。
[0016]包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被體內外突變等修飾，包括插入、置換、缺失、易錯聚合酶鏈式反應、位點特異性突變、不同序列重組、定向進化等。
[0017]包含本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通過合適表達系統在外源宿主中表達生產相應酶或者提高生物活性化合物產量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈黴菌、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母及動植物等。
[0018]本發明提供的胺基酸序列可以用於分離所需蛋白並可用於抗體製備。
[0019]包含本發明所提供的胺基酸序列或者部分序列的多肽，可能在去除或者替代某些胺基酸之後仍有生物活性甚至新的生物活性，或提高了產量或優化了蛋白動力學特徵或其他致力於得到的性質。
[0020]包含本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達及揭不它們在宿主代謝中的功能。
[0021]包含本發明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過DNA重組技術構建重組載體，以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活，進而獲得其他基於生物合成途徑的新結構化合物。
[0022]本發明提供了斑鳩黴素的生物合成基因簇在製備斑鳩黴素及其類似物中的應用。
[0023]本發明提供了一種類Michael環化反應酶基因ikaC，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1第14614-15678位鹼基所示。
[0024]上述類Michael環化反應酶基因ikaC編碼的類Michael反應環化酶IkaC。
[0025]類Michael反應環化酶IkaC在製備斑鳩黴素中的應用，如催化化合物3形成斑鳩黴素化合物I。
[0026]本發明提供了類Michael環化反應酶基因缺失突變株中斑鳩黴素類似物的創製應用。
[0027]總之本發明所提供的包括斑鳩黴素生物合成相關的所有基因和蛋白信息，幫助人們理解多環tetramate大環內醯胺家族天然產物的還原型環化等關鍵機制，為進一步遺傳改造提供材料和理論基礎。本發明所提供的基因和蛋白質可以用來尋找和發現可用於醫藥、衛生或農業的多環tetramate大環內醯胺家族、基因或蛋白。
[0028]本發明的放線菌Str印tomyces sp.ZJ306於2014年3月13日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)Jia:中國武漢武漢大學，其保藏編號為:CCTCC N0.M2014081。【專利附圖】
【附圖說明】:
[0029]圖1是斑鳩黴素(化合物I)及生物合成中間體化合物3、以及化合物2的化學結構式。
[0030]圖2是Streptomyces sp.ZJ306中斑鳩黴素的生物合成基因簇結構示意圖和限制性內切酶譜(S，SacI ;E, EcoRI;B, BglII;P, Pvu1.)。
[0031]圖3A是遺傳改造Streptomyces sp.ZJ306中斑鳩黴素生物合成基因簇獲得的突變株，在發酵培養基中的丁酮粗提物的HPLC分析圖:1:野生型Streptomyces sp.ZJ306 ；I1:突變株AikaA ；111:突變株AikaB ；IV:突變株Λ ikaC ;圖中阿拉伯數字表示斑鳩黴素及其中間體，其中1、2和3分別代表圖1中的式1、式2和式3表示的化合物。
[0032]圖3B是ikaA、ikaAB和ikaABC在S.1ividans TK64中表達的工程菌株發酵產物HPLC 分析圖。如圖:V:TK64/pCSG3611 (ika cluster) ；V1:TK64/pCSG3615 (ikaA) ;VI1:TK64/pCSG3614 (ikaAB) ；VII1:TK64/pCSG3613 (ikaABC) ; IX:TK64/pSET152。圖中阿拉伯數字表示斑鳩黴素及其中間體，其中1、2和3分別代表圖1中的式1、式2和式3表示的化合物。
[0033]圖4是orfl、orf2、orf3、orf4和orf5的雙交換突變株，在發酵培養基中的丁酮粗提取的 HPLC 圖。(i)野生型 Streptomyces sp.ZJ306; (ii) Aorfl 突變株;(iii) Δ orf2突變株；(iv) Aorf3突變株；(V) Δ orf4突變株；(vi) Δ orf5突變株，其中1、2和3分別代表圖1中的式1、式2和式3表不的化合物。
[0034]圖5是化合物I的1H核磁共振譜結果。
[0035]圖6是化合物I的13C和EDPT核磁共振譜結果。
[0036]圖7A和7B分別是化合物2的HRESMS和MS/MS結果。
[0037]圖 8-14 分別是化合物 3 的 HR-ES1-MS JHJ3CjDP^HSQCJH-1H COSY、HMBC和 NOESY的核磁共振譜結果。
[0038]圖15A是純化的重組IkaC的SDS-PAGE結果。
[0039]圖15B是圖1中式3表示的化合物作為底物在IkaC催化作用下生成斑鳩黴素的HPLC分析圖。(i)斑鳩黴素標準品I; (ii)標準反應體系:3，IkaC和NADPH;(iii)3, heat-denatured IkaC和 NADPH;(iv)3 和 IkaC0
[0040]圖16提出的斑鳩黴素生物合成途徑。
【具體實施方式】
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[0041]以下是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0042]1.克隆分析斑鳩黴素的生物合成基因簇
[0043]斑鳩黴素(圖1的式I所示)屬於多環tetramate大環內醯胺家族(PTM)天然產物，由雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶催化產生，因此針對聚酮/非核糖體聚肽合成酶基因的保守結構域，設計兼併引物C5F/C7R。通過PCR擴增獲得一個約0.8kb的PCR片段，連接到T載體中，測序後，進行序列比對，結果表明與PTM的雜合聚酮/非核糖體聚肽合成酶基因具有高度同源性。根據測序結果，設計特異引物306-CF/306-CR，對Str印tomyces sp.ZJ306基因組文庫約2000個克隆進行篩選，獲得10個不同的陽性克隆。通過限制性內切酶酶切分析，確定了 10個不同的陽性克隆相對位置。經過末端測序分析，選取陽性克隆PCSG3500使用鳥槍法全測序，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0044]2.斑鳩黴素的生物合成基因簇中各基因體內功能分析。
[0045]本發明對斑鳩黴素的生物合成機制進行了研究。對PCSG3500測序結果，運用生物信息學分析，顯示包含25個0RF，預測ikaA、ikaB和ikaC負責斑鳩黴素的生物合成(表1和圖2)。
[0046]構建了 Streptomyces sp.ZJ306的遺傳作業系統，在斑鳩黴素生產菌株進行體內基因敲除，構建雙交換突變株(檢測引物和基因敲除引物見表2)。
[0047]對突變株進行發酵及代謝產物HPLC分析，進一步證實ikaA、ikaB和ikaC負責斑鳩黴素的生物合成(圖3A), orf 1-5不參與斑鳩黴素的生物合成(圖4)。採用PCR-targeting技術，敲除了雜合的聚酮/非核糖體肽合成酶基因ikaA的突變株AikaA喪失了生產斑鳩黴素及相關化合物的能力；敲除了 FAD依賴的氧化還原酶基因ikaB的突變株Λ ikaB不再生產斑鳩黴素，而產生了新化合物2。敲除了類Michael環化反應酶基因ikaC的突變株，也不再生產斑鳩黴素，產生了新化合物3。
[0048]表1斑鳩黴素的生物合成基因簇的基因及其功能
[0049]
【權利要求】
1.一種斑鳩黴素的生物合成基因簇，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3411-15678位的鹼基序列所示。
2.權利要求1所述的斑鳩黴素的生物合成基因簇在製備斑鳩黴素及其類似物中的應用。
3.一種類Michael環化反應酶基因ikaC，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1第14614-15678位鹼基所示。
4.一種權利要求3所述的類Michael環化反應酶基因ikaC編碼的類Michael反應環化酶IkaC。
5.權利要求4所述的類Michael反應環化酶IkaC在催化式3所述的化合物3形成斑鳩黴素中的應用；
6.放線菌Str印tomyces sp.ZJ306，其保藏編號為:CCTCC N0.M2014081。
【文檔編號】C12R1/465GK104073507SQ201410120626
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】張長生, 張光濤, 張文軍, 張慶波, 朱義廣, 張海波, 李蘇梅, 馬亮 申請人:中國科學院南海海洋研究所