L－脯氨酸3位羥基化酶的製造方法

2023-05-01 18:03:51 3

專利名稱：L－脯氨酸3位羥基化酶的製造方法
技術領域：
本發明是涉及工業上有利地製造作為醫藥品合成原料或食品添加劑的有用的順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用於該方法上的有用的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
作為以往的順式-3-羥基-L-脯氨酸的製造方法，化學合成方法是已經公知的〔Journal of the American Chemical Society(J.Amer.Chem.Soc.)、84 3980(1962)、同書的85、2824(1963)、Nature、289、310(1981)、Journal of Organic Chemistry(J.Org.Chem.)、54、1866(1989)、Acta Chemica Scandinavica、43、290(1989)〕。
但是，在將L-脯氨酸直接在不同位置及立體選擇地羥基化後，製造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法中，同時利用合成化學方法及生物機能的方法，目前尚沒有報導。
以往的用化學合成法製造順式-3-羥基-L-脯氨酸的製造方法，由於(1)原料昂貴、(2)反應工序長、(3)分離精製工序複雜、(4)生產效率低等的缺點，所以作為工業上的製造方法未必是滿意的方法，因而，目前尋求一種工業上有利的順式-3-羥基-L-脯氨酸的製造方法。
本發明的目的在於，提供一個利用發酵法從廉價的糖源在工業上廉價生產出的L-脯氨酸為原料，通過直接用微生物或酶進行羥基化處理後，以工業規模且方便地製造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法及用於該方法的L-脯氨酸3位羥基化酶。
按照本發明的方法，可以提供順式-3-羥基-L-脯氨酸的製造法及新的L-脯氨酸3位羥基化酶，其特徵是將可在L-脯氨酸的3位上催化羥基化反應的酶源、二價鐵離子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在於水溶性介質中，使得L-脯氨酸轉化成順式-3-羥基-L-脯氨酸，而後從該培養物中或該水溶性介質中提取生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
用於本發明的順式-3-羥基-L-脯氨酸製造法中的酶源，只要是在羥基化L-脯氨酸時，具有催化生成順式-3-羥基-L-脯氨酸的活性就可以，例如，微生物的培養物、菌體、菌體處理物、精製酶或粗酶中的任何一種均可。作為微生物的合適例子可舉出鏈黴菌(Streptomyces)屬、或者芽胞桿菌(Bacillus)屬的微生物。具體的可舉出灰色鏈黴菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC 12646、鏈黴菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3，或者這些菌株的繼代培養物、突變體或者衍生物等。
鏈黴菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1是本發明者們從土壤中重新分離出的微生物。以下表示了鏈黴菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1的菌學性質。1.形態的性質表示在表1中。
表1形態的性質
2.培養的性質
TH1株在一般使用的合成及天然培養基中顯示了普通的或旺盛的繁殖，基生菌絲呈淺桃色、橙色或綠褐色。根據不同培養基也可能產生茶色或者黑色的可溶性色素。
在各種培養基上，在28℃下進行14天培養時的特徵表示在表2-(1)及表2-(2)中。此外，顏色的表示是按照顏色協調手冊(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))的顏色分類而進行的。
表2-(1)培養上的性質
表2-(2)培養上的性質
3.生理學方面的性質TH1株的生理學的性質表示在表3中。繁殖溫度範圍是7天後的結果，其它是在28℃、2～3周後的結果。
表3生理學的性質
4.化學分類學方面的性質菌體中的二氨基庚二酸的旋光異構體LL型以上，按形態是在氣菌絲上形成了螺旋狀的由10個以上胞子構成的胞子鏈。按化學分類，細胞壁是I型(LL-二氨基庚二酸)，所以本菌株被分類為放線菌中的鏈黴菌屬。
將本菌株命名為鏈黴菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1，按照布達佩斯條約，平成5年9月1日寄存在工業技術院生物工程技術研究所，寄存號為FERM BP-4399。
芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3是本發明者從土壤中分離出的微生物。以下表示兩菌株的菌學性質。
細胞的大小，TH2是1.5～1.8×3～4μm、TH3是1.2～1.5×3.5～4μm，DNA的鹼基組成(G+C mol％)，TH2是36.46％、TH3是37.74％。此外，2株菌均具有以下的性質。
1.形態的性質TH2及TH3的形態的性質示於表4。
表4形態性質
2.培養方面的性質在各種培養基上，28℃下培養14天後的繁殖及顏色特徵表示在表5中。此外，顏色的表示是按照(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))顏色分類進行的。
表5培養方面的性質
3.生理學性質TH2及TH3的生理學性質示於表6-(1)及表6-(2)中。
表6-(1)生理學性質
(W弱)
表6-(2)酸及氣體的生成
+生成，-不生成
4.其它各種性質表示在表7中，化學分類學性質表示在表8中。
表7其它的各種性質
+有，-無表8化學分類的性質
將具有以上菌學性質的菌與Bergey’s手冊(Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology，Vol.2，1986年)上記載的相對應。
從以上結果可以鑑定2個菌株均屬於芽胞桿菌(Bacillus)屬的細菌，分別命名為芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH3，並根據布達佩斯條約平成5年9月1日寄存在工業技術院生物工程技術研究所，寄存號分別為FERM BP-4397及FERM BP-4398。
培養這些微生物的培養基，只要是含有可使微生物同化的碳源、氮源、無機鹽類等，並能高效地培養具有以下催化活性的微生物的培養基，即具有使L-脯氨酸羥基化後，生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應的催化活性的話，無論是天然培養基、合成培養基都可以。
作為碳源，只要是可使各種微生物同化的話都可以，例如可使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有這些組分的糖蜜、澱粉或澱粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等有機酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無機酸和有機酸的銨鹽、其它含氮化合物以及腖、肉浸汁、酵母浸汁、玉米澱粉汁(コ-ンスチ-プカ-)、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣加水分解物、各種發酵菌體及其消化物等。
作為無機物可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養可在振蕩培養或者深部通氣攪拌培養等的需氧條件下進行。培養的溫度是15-37℃，培養時間通常是16-96小時。
培養中的pH保持在5.0-9.0。pH的調節，可用無機或者有機的酸、鹼溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進行調節。
作為菌體處理物可舉出菌體的乾燥物、冷凍乾燥物、表面活性劑和/或有機溶劑處理物、酶處理物、超聲波處理物、機械磨碎處理物、溶劑處理物、菌體的蛋白餾分、菌體及菌體處理物的固定化物等。另外也可以使用由該菌體萃取出的具有羥基化酶活性的酶，這些酶的精製標樣、固定化物等。
另外，也可以使用從該菌體萃取得到的具有催化從L-脯氨酸向順式-3-羥基-L-脯氨酸的羥基化反應活性的酶，這些酶的精製標樣、固定物等。作為具有該活性的酶源可以舉出顯示下述(1)-(11)的理化性質的L-脯氨酸3位羥基化酶。
該酶是具有(1)-(11)理化性質的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
(1)作用及基質特異性在2-酮戊二酸及二價鐵離子的存在下，與游離的L-脯氨酸作用後可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，進行20分鐘反應，具有pH6.5-7.5的最佳pH。
(3)pH的穩定性在4℃，進行23小時處理，在pH6.5-8.0的範圍內保持穩定。
(4)最佳溫度在pH7.0，反應15分鐘，具有35-40℃的最佳溫度。
(5)溫度的穩定性在pH7.5、50℃下，處理30分鐘後，失活。
(6)阻礙劑用Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及乙二胺四乙酸(EDTA)進行阻礙。
(7)活化活化時，不需要輔酶，向反應液中添加L-抗壞血酸可以促進反應。
(8)Km值在100mM的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩衝液(pH7.0)中含有5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標準樣品的反應液中測得的，對於L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對於2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點用Phast系統(Phast system；弗爾瑪西亞公司制)測定的等電點是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺電泳法測定時，是35,000±5,000。
(11)N末端胺基酸序列具有用序列號1表示的N末端胺基酸序列。
(N末端)1 MetCysSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal這些酶源在反應液中的酶活性量是根據使用的基質量等確定的，一般是10-10,000,000U/l、優選的是1,000-2,000,000U/l。使用微生物的菌體及菌體處理物時，其濃度，通常以溼菌體計為1-300g/l。
用於反應的L-脯氨酸的濃度是1mM-2M。
反應時，需要二價鐵離子，通常使用1-100mM。作為使用的二價鐵離子，只要所含的二價鐵不阻礙反應，使用任何種類的都可以。例如可舉出硫酸亞鐵等的硫化物、氯化亞鐵等的氯化物，碳酸亞鐵等之外，檸檬酸鹽、乳酸鹽、富馬酸鹽等之類的有機酸鹽。
另外，在反應中需要2-酮戊二酸，可以向反應液中添加酮戊二酸或也可以使用通過所用菌體及菌體處理物具有的代謝活性可轉換成2-酮戊二酸的化合物。這樣的化合物可舉出葡萄糖類的糖質、穀氨酸、琥珀酸等。這些化合物可單獨使用，也可數種並用。
作為水溶性介質，可舉出水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷等緩衝液(TRIS)、甲醇、乙醇等的醇類、醋酸乙酯等的酯類、丙酮等的酮類、乙醯胺等的醯胺類等。
反應可在具有使L-脯氨酸羥基化後，可以生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應的催化活性的上述微生物的培養物中進行，也可以使用從該培養物分離出的菌體或者該菌體的處理物或者用精製酶和粗酶，在水介質中進行。
反應通常是在溫度15-50℃、pH6.0-9.0條件下，進行1-96小時。
必要時，在菌體處理或反應時，添加表面活性劑和有機溶劑。
作為表面活性劑可舉出聚氧化乙烯·硬脂醯胺(如萘明(ナイシ-ン)S-215、日本油脂社制等)、十六烷基三甲基銨·溴化物、陽離子FB、陽離子F2-40E等的陽離子表面活性劑、油醯胺硫酸鈉、NureXTAB、臘披索爾(ラビゾ-ル)80等的陽離子表面活性劑、聚氧化乙烯山梨糖醇酐·單硬脂酸酯(如，非離子ST 221)等兩性表面活性劑、其它叔胺PB、六癸基二甲胺等，只要是促進反應任何的都可以使用。使用的濃度通常為0.1-50mg/ml，優選1-20mg/ml的濃度。
作為有機溶劑可以使用甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯、醋酸乙酯等。使用的濃度通常是0.1-50μl/ml，優選1-20μl/ml。
作為從培養物中或水溶性介質中回收順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，可以使用離子交換樹脂等的柱色譜或結晶法等的通常分離方法。被回收的順式-3-羥基-L-脯氨酸可用13C-NMR譜、1H-NMR譜、質譜、比旋光度等通常的分析手段確認其結構。
以下，說明本發明的順式-3-羥基-L-脯氨酸的製取方法。
這種酶的製取方法是首先培養具有生產L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，在培養物中生成積蓄了L-脯氨酸3位羥基化酶，從該培養物中提取L-脯氨酸3位羥基化酶而得到。
只要是具有生產L-脯氨酸3位羥基化酶的微生物，無論是野生株、或其繼代培養物、突變體、誘變體等任何一種微生物都可以使用。適宜的例子有屬於鏈黴菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌(Bacillus)屬，而且具有生產L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物。具體的可舉出上述的灰色鏈黴菌(Streptomyces canus)ATCC12647及ATCC 12646、鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3、或者這些菌株的繼代培養物、突變體或誘變體。
培養這樣微生物的培養基，只要含有可同化微生物的碳源、氮源、無機鹽類等，並且有效地培養具有生成L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，無論天然培養基、合成培養基都可以使用。
作為碳源可以使用各種可同化微生物的碳源，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖類的糖蜜、澱粉或者澱粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有機酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無機酸和有機酸銨鹽、其它的含氮化合物以及腖、肉汁、酵母汁、玉米澱粉汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣及大豆渣子加水分解物、各種發酵菌體及其消化物等。
作為無機物，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養可在振蕩培養或者深部通氣攪拌培養等的需氧條件下進行。培養的溫度是15-37℃，培養時間通常是16-96小時。
培養中的pH保持在5.0-9.0的調節，可用無機或者有機的酸、鹼溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進行調節。
在培養時，根據需要也可添加L-脯氨酸。
在這樣得到的菌體中是否生成了L-脯氨酸3位羥基化酶，可通過向培養物中或在含有該菌體或菌體處理物的適合於酶反應的水性介質中加入L-脯氨酸、二價鐵離子及2-酮戊二酸，進而需要時，添加表面活性劑和有機溶劑觀察是否使L-脯氨酸轉化成順式-3-羥基-L-脯氨酸而加以確定。
用此反應來確認順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成，在菌體中確認其生成的L-脯氨酸3位羥基化酶的活性，可用以下的方法測定。酶的活性，可用在下述測定條件下，把1分鐘內生成1nmol的順式-3-羥基-L-脯氮酸的活性作為1個單位(U)來表示。
在含有5mML-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵及5mML-抗壞血酸的100mM的TES緩衝溶液(pH7.0)中，添加酶標品，合計100μl，在35℃下反應10分鐘。在100℃下，加熱反應液2分鐘，停止反應後，用高速液相色譜定量測定在反應液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
定量時，只要是可以定量測定順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，採用任何的方法都可以。例如可舉出通常使用的高速液相色譜的後置柱衍生化法或者預先使用NBD氯化物(7-氯-4-硝基苯並-2-氧-1，3-二唑)使反應液中的目的化合物NBD衍生化，將其放在使用高速液相色譜的逆相色譜上分離NBD衍生物後，使用螢光(激勵波長503nm、螢光波長541nm)進行定量的方法(前置柱衍生物化法)等。再者，用前置柱衍生物化法的鑑定可以按照烏利姆·J.林德布拉特及羅伯特·F·狄蓋爾曼等人的方法〔(Analytical Biochemistry)、138、390、(1984)〕上的方法進行。
從培養液離析精製酶時，可採用通常的酶的離析、精製法。例如，離心分離營養液併集菌後，通過超聲波破碎和法式擠壓機、曼特高林機(マントンガウリン)、動力磨等的機械破碎，得到無細胞提取液。將得到的離心沉澱後的上清液，通過進行如用硫銨等的鹽析、DEAE(二乙胺乙基)-瓊脂糖等陰離子交換色譜層析、丁基纖維素、苯基纖維素等疏水性的色譜層析、使用分子篩的凝膠過濾法、等電點電泳等的電泳法等，可得到精製酶標樣。得到酶標樣的理化特徵，可用通常酶學的方法鑑定。
用這種方法得到的L-脯氨酸3位羥基化酶具有下述(1)-(11)的理化性質。
(1)作用及基質特異性在2-酮戊二酸及二價鐵離子的存在下，作用在游離的L-脯氨酸後，可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，反應20分鐘時，具有最佳pH6.5-7.5。
(3)pH穩定性在4℃下，進行23小時處理，在pH6.5-8.0的範圍保持穩定。
(4)最佳溫度在pH7.0、反應15分鐘時，具有最佳溫度35-40℃。
(5)溫度穩定性在pH7.5、50℃下處理30分鐘失活。
(6)阻礙劑由於Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及EDTA可受到阻礙。
(7)活化活化時，無必要使用輔酶。向反應液中添加L-抗壞血酸可促進反應。
(8)Km值在100mM的TES緩衝溶液(pH7.0)中，含有L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標樣的反應液中進行測定的對於L-脯氨酸的Km值是0.49，對於2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點用Phast(Phast system；フルマミア社制)系統測定的等電點是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺電泳法測定時是35,000±5,000。
(11)N末端胺基酸序列具有用序列號1表示的N末端胺基酸。
以下說明本發明的實施例。
實施例1順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將SR3培養基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性澱粉1.0％、酵母浸汁0.5％、胰腖0.5％、肉浸汁0.3％及磷酸鎂0.05％，用6N NaOH調節成pH 7.2的培養基〕，分別以10ml注入到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養基上用一鉑環移植在HT瓊脂平板培養基上〔含可溶性澱粉1％、NZ胺0.2％、酵母浸汁0.1％、肉浸汁0.1％及瓊脂1.5％，用6N NaOH調到pH7.2後，在120℃下，殺菌20分鐘的培養基〕繁殖的鏈黴菌(Strep-tomyces sp.)TH1，並在28℃下振蕩培養2天，作為種培養液使用。將本種培養液進而分注到2升的三角燒瓶中，移植到在120℃下進行20分鐘殺菌了的200ml的SR3培養基上，在28℃下振蕩培養2天。將此培養液無菌地接種到在5升的發酵缸中分注了2升的DF3培養基上〔含有可溶性澱粉5％、玉米澱粉汁3.0％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水鹽0.05％及碳酸鈣0.5％，用6N NaOH調節為pH7.0的培養基〕，並在700rpm、1vvm的條件下於28℃，培養2天。培養中不調節pH值。將得到的培養液用15000×g、4℃下離心分離10分鐘，每1升培養液得到75g溼菌體。在4℃下，用生理鹽水洗滌溼菌體，離心後至使用時為止要冷凍保持在-80℃下。
將得到的溼菌體1.0g懸浮在10ml的反應液(a)中〔在含有5mML-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、5mML-抗壞血酸及1mM硫酸亞鐵的100mM TES緩衝液(pH7.5)中添加1.4％(v/v)奈明(ナイミ-ン)溶液而製成的(其奈明溶液是將4g奈明S-21J(日本油脂株式會社制)溶解在10ml二甲苯中的溶液)〕進行懸浮，而後在30℃下，反應5小時。
反應後，從菌體反應液離心除去菌體，對於上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進行分析。
分析是在高速液相色譜上，使用後置柱衍生物化法，在以下的條件下分析。檢測是將目的化合物從柱中洗脫出後，在線上NBD衍生物化，使用NBD衍生物的螢光進行的。
高速液相色譜分析條件〔1〕裝置島津製作所制高速液相色譜色譜紙束(chromatopack) CR6A系統控制器 SCL-6B自動注射器 SIL-6B送液泵 LC-6A柱烘箱 CTO-6A化學反應槽 CRB-6A螢光檢測器 RF-550A
〔2〕使用柱SUMCHIRAL OA5000(株式會社住化分析中心制)(直徑4.5mm×250mm)〔3〕分析條件1)移動相1mM硫酸銅水溶液2)移動相流速1.0ml/分3)柱溫度38℃4)緩衝液0.3M硼酸緩衝液(pH9.6)25mM EDTA5)緩衝液流速0.2ml/分6)NBD氯化物溶液0.5g/l甲醇溶液7)上述溶液的流速0.5ml/分8)反應溫度 60℃9)反應時間 約3分10)檢測波長 激勵波長503nm螢光波長541nm11)試樣 10μl其結果，在反應液中生成了910μM(119mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實施例2
順式-3-羥基-L-脯氨酸的精製將實施例1得到的溼菌體100g懸浮在1升的反應液(a)中，在2升的燒杯中，邊攪拌，邊在30℃下反應5小時。
反應後，對於從菌體反應液離心除去菌體的上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進行分析，其結果，反應液中生成了809μM(106mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。將反應上清液調節pH為4.5後使其通過裝有200ml迪阿翁離子交換樹脂SKIB(NH4+型、三菱化成社制)的塔內。在減壓下濃縮出含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分後，通過含有迪阿翁離子交換樹脂PA412(OH-型、三菱化成社制)20ml的塔。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分後，使pH值調節到9.6後，加入10％體積的鄰苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％體積的β-巰基乙醇溶液(10％v/v水溶液)，在60℃下，保持5分鐘，使夾雜的直鏈(一級)胺基酸進行鄰位苯二甲醛化。再通過含有10ml的分離珠離子交換樹脂SP207(三菱化成社制)，分離鄰位苯二甲醛化的夾雜一級胺基酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分後，再次通入含有20ml迪阿翁離子交換樹脂PA412(OH-型、三菱化成社制)的塔中，得到含有順式-3-羥基-L-脯氨酸的餾分。乾燥此餾分，得到順式-3-羥基-L-脯氨酸的白色結晶68mg(收率63％)。
上述化合物的理化性質如下。
比旋光度〔α〕D21＝-93.4°(C＝0.503、H2O)FAB-質譜132(M+H)+13C-NMR譜(D2O、125MHz)ppm33.9、44.5、68.3、71.6、171.31H-NMR譜(D2O、500MHz)ppm2.18(1H)、2.27(1H)、3.52(1H)、3.62(1H)、4.18(1H)、4.77(1H)上述的用比旋光度、質譜測定的分子量、1H-NMR譜、13C-NMR譜等的分析結果，與文獻記載的數值是相一致的〔the Jour-nal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem.)、241、1300(1966)〕〔Journal of Antibiotics、45、824(1992)〕及按照文獻記載的方法合成的化學合成順式-3-羥基-L-脯氨酸〔(Liebigs Ann.Chem)、1881、(1979)〕〔四面體(Tetrahedron)、42、2421、(1986)〕。
實施例3順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成使用灰色鏈黴菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC12646、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3進行L-脯氨酸的羥基化。
將SR3培養基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性澱粉1.0％、酵母浸汁0.5％，胰蛋白腖0.5％，肉浸汁0.3％以及磷酸鎂0.05％，並用6N NaOH調節至pH7.2的培養基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，進行20分鐘殺菌。而後用一鉑環將生長在HT瓊脂培養基上的各菌株移植在此培養基上，在28℃、振蕩培養1天，作為種培養液使用。
另一方面，將Df4培養基〔含有甘油2.5％、葡萄糖2.5％、大豆粉1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，並用6N NaOH調節pH為7.0的培養基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養基上無菌地接種種培養液1ml，在28℃下，振蕩培養1天。得到的培養液2ml用15000×g、4℃下離心分離10分鐘。而後用80mM TES緩衝液(pH7.5)洗滌得到的菌體後，離心分離。把得到的溼菌體懸浮在1ml的反應液(a)中，在30℃下，進行3小時反應。
其結果，在反應液中分別生成了242μM、202μM、318μM、141μM的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實施例4順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將芽胞桿菌屬菌(Bacillus，sp)TH2及TH3使用添加了L-脯氨酸1g/l的Df2培養基〔含有可溶性澱粉5％、乾燥酵母1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，用6NNaOH調節為pH7.0的培養基〕代替Df4培養基，與實施例3同樣地進行1天種培養，在Df2培養基上進行1天培養。其結果，在培養液的上清液中生成TH2株745μM(97.6mg/l)、TH3株327μM(42.8mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實施例5L-脯氨酸3位羥基化酶的離析精製(1)無細胞提取液的配製將由實施例2得到的冷凍菌體30g溶解後，在冰冷下懸浮在200ml的緩衝液(A)中〔含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.2mMEDTA、0.1％(V/V)吐溫(Tween 20)及10％(V/V)甘油的20mM哌嗪緩衝液(用6N HCl調節pH為5.3)〕，在冰冷下，用超聲波破碎懸浮液中的菌體，在4℃下，用30000×g進行30分鐘離心後得到上清液。
以後的操作均在冰冷乃至4℃下進行。
(2)用柱色譜進行離析及精製(2)-1.酸處理將由上述工序得到的上清液的pH用6N鹽酸調節到4.5後，用15,000×g，進行30分鐘離心、分離除去生成的沉澱，得到上清液。
(2)-2.RESOURCE Q柱色譜(I)將由上述工序得到的上清液，通過裝有用緩衝液(A)進行平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，6ml)的柱。用緩衝液(A)洗滌後，用在緩衝液(A)中制定的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-3.RESOURCE Q柱色譜(II)將由上述工序得到的活性餾分用緩衝液(B)〔含有1mMDTT、0.2mM EDTA及10％(V/V)甘油的20mM TES緩衝液(pH調節為7.5)〕稀釋3倍後，通過裝有用緩衝液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩衝液(B)洗滌後，使用在緩衝液(B)中制定的從0-0.3M間的食鹽線性濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-4.苯基瓊脂糖色譜在上述工序得到的活性餾分中，添加、溶解食鹽，使食鹽濃度達到2M，並使其通過裝有用含2M食鹽的緩衝液(B)平衡的苯基瓊脂糖柱(Phenyl Sepharose HP Hiload，1ml)的塔。用含2M食鹽緩衝液(B)洗滌後，使用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)緩衝液(B)洗脫出含該酶的餾分。
(2)-5.RESOURCE Q柱色譜(III)對於上述工序得到的活性餾分，使用以緩衝液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制PD-10柱脫鹽後，通過裝有用緩衝液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩衝液(A)洗滌後，使用在緩衝液(A)中製得的從0-0.3M間的食鹽的直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-6.RESOURCE Q柱色譜(IV)
將由上述工序得到的活性餾分，用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)的緩衝液(B)稀釋3倍後，通過裝有用緩中液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的柱(RESOURCETMQ，1ml)的柱。用緩衝液(B)洗滌後，使用在緩衝液(B)中製得的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精製的概要總結在表9中表9L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精製的概要餾分 總蛋白 全活性 比活性 收率(mg) (U) (U/mg蛋白)(％)無細胞提取液 542 3540 6.5 100pH4.5處理上清液106 1800 17 56RESOURCEQ(I)pH5.3 7.5 1553 207 44RESOURCE Q(I)pH7.5 3.3 1036 306 29苯基瓊脂糖 0.43188 437 5.3RESOURCE Q(III)pH5.3 0.1690.5 566 2.6RESOURCE Q(IV)pH7.50.035 60.3 17231.7實施例6L-脯氨酸3位羥基化酶的性質(1)電泳分析用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺電泳法(使用ATTO社制聚丙烯醯胺PAGELNPU-12.5L及BIORAD社制分子量標準SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range)分析實施例5得到的精製酶標樣。其結果，明顯地看出該酶是由分子量35000±5000大致均一的亞單位構成的。
(2)關於酶反應的性質使用以下的反應液，通過進行反應成分基質省略試驗(Omis-sion test)及添加物試驗研究L-脯氨酸3位羥基化酶反應的必需化合物、促進化合物、阻礙化合物。
基本反應液組成是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標樣的100mM的TES緩衝液(pH7.0)，總計液量為100μl。通過添加酶開始反應，在35℃下反應10分鐘。反應液在100℃下加熱2分鐘，停止反應後，按照前置柱衍生物化法，使用高速液相色譜定量在反應液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。向100μl反應液中添加0.3M硼酸緩衝液(pH10.7)100μl、10％(V/V)巰基乙醇水溶液4μl及5％(W/V)鄰苯二甲醛的乙醇溶液16μl，在60℃下放置30秒。進而加入2％(W/V)NBD氯化物的乙醇溶液50μl，在60℃下反應40分鐘。加入1N鹽酸30μl停止反應後，通過離心、過濾除去沉澱後，用高速液相色譜進行分析，定量生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
在以下條件進行高速液相色譜分析移動相10mM檸檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(V/V)流速1ml/分柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制、6×150mm)柱溫度50℃檢測螢光檢測、激勵波長503nm、螢光波長541nm從其結果可看出，在L-脯氨酸3位羥基化時，L-脯氨酸、2-酮戊二酸、Fe++離子是必需的，L-抗壞血酸有促進反應的作用，另外，Zn++、Cu++、Co++及Ba++離子及EDTA的添加可阻礙反應。
其結果表示在表10中。
表10酶反應成分的研究反應液成分 添加物(+)2)相對活性3)無添加(-)標準反應液1)100-酶標樣0-L-脯氨酸 0-2-酮戊二酸0-Fe++0-L-抗壞血酸25+2mM EDTA 5+1mM Zn++0+1mM Cu++4+1mM Co++13+1mM Ba++42
1)標準反應液成分是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標樣的100mM TES緩衝液，pH是7.0，液量總計100μl。反應是在35℃下進行10分鐘。
2)添加物(+)，在標準反應液中添加以表中+表示的化合物進行反應。無添加(-)，從標準反應液中除去以表中-表示的化合物進行反應，表中表示的濃度是反應液的濃度。
3)活性，以標準反應液的活性作為100表示其相對值。
(3)最佳pH在L-脯氨酸3位羥基化酶活性測定法中，用下述緩衝液置換反應液中的緩衝液成分，進行反應，即pH5.5-6.0時，用MES〔2-(N-嗎啉)乙磺酸〕緩衝液、pH6.5-7.5時，用PIPES〔哌嗪-N，N』-雙(2-乙磺酸)〕緩衝液、pH7.0-8.0時，用TES緩衝液、pH8.0-9.0時，用TAPS〔N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)〕緩衝液進行反應的結果，pH為6.5-7.5時顯示了最高活性的80％以上。其結果表示在表11中。
表11反應的最佳pHpH (緩衝液) 相對活性1)5.5 (MES) 15.06.0 (MES) 70.96.5 (PIPES) 83.37.0 (PIPES) 92.17.0 (TES) 1007.5 (PIPES) 80.47.5 (TES) 85.08.0 (TES) 72.28.0 (TAPS) 76.38.5 (TAPS) 52.99.0 (TAPS) 44.51)活性是對最高活性作為100時的相對活性(4)pH穩定性緩衝液(B)中的本發明的酶液用100mM緩衝液〔pH5.5-6.5時，用MES緩衝液、pH6.1-7.5時，用PIPES緩衝液、pH7.0-8.0時，用TES緩衝液、pH8.0-9.0時，用TAPS緩衝液〕稀釋3倍，在4℃，保持23小時後，測定活性。pH範圍保持在6.5-8.0範圍的酶具有保持前面的活性的80％以上的活性，說明pH在6.5-8.0的範圍內活性保持穩定。
(5)最佳溫度在測定L-脯氨酸3位羥基化酶的活性時，在15-50℃的溫度範圍內，進行15分鐘反應，其結果顯示出在35-40℃時，有最高活性的80％以上的活性。結果表示在表12中。
表12反應的最佳溫度反應溫度相對活性1)15 1920 2925 5330 7435 10040 8945 6450 281)活性是以最高活性為100時的相對活性表示的(6)溫度的穩定性將本發明的酶在緩衝液(B)中，在0-60℃的溫度範圍內保持30分鐘後，測定其活性。結果表明，本發明酶在50℃下，處理30分鐘完全失活。
(7)Km值在含有100mM TES緩衝液(pH7.0)、1mM硫酸亞鐵、5mML-抗壞血酸及酶標樣反應液中測定，對於L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對於2-酮戊二酸Km值是0.11mM。
(8)等電點用Phast系統(Phast system；弗爾瑪西亞社制)測定等電點的結果，等電點是4.3。
(9)N末端胺基酸序列使用Protein sequencer model PPSQ-10(島津製作所社制)分析本發明酶蛋白的N末端胺基酸序列，得到以下結果(N末端) 1MetCsSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal(序列號1)實施例7L-脯氨酸的羥基化使用實施例5得到的精製酶標樣進行L-脯氨酸的羥基化。
使用含有20mM 2-酮戊二酸、20mM L-脯氨酸、5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及106U的精製酶標樣的200mM TES緩衝液(pH7.0)100μl，在35℃反應30分鐘。其結果，在反應液中生成18mM(2.4g/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
序列表序列號 1序列長度29序列類型胺基酸拓譜學 直鏈狀序列的種類 肽起源鏈黴菌屬(Streptomyces sp)株名TH1(FERM BP-4399)序列Met Cys Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly1 5 10 15Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val20 25根據本發明，可以提供對於用發酵法從糖源工業性地生產的L-脯氨酸，通過微生物或酶的直接羥基化，在工業上有效地製造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用於該方法的有用的新的L-脯氨酸羥基化酶。
權利要求
1.L-脯氨酸3位羥基化酶的製造方法，其特徵在於培養屬於鏈黴菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌屬(Bacillus)，並且具有生產L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，通過酸處理、陰離子交換色譜層析、疏水性色譜層析的組合精製方法精製所說的微生物的細胞提取液。
全文摘要
L－脯氨酸3位羥基化酶的製造方法,其特徵在於培養屬於鏈黴菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌屬(Bacillus),並且具有生產L－脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物,通過酸處理、陰離子交換色譜層析、疏水性色譜層析的組合精製方法精製所說的微生物的細胞提取液。
文檔編號C12N9/02GK1375555SQ0113746
公開日2002年10月23日 申請日期1994年9月5日 優先權日1993年9月7日
發明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎剛, 安藤勝彥, 落合惠子, 千葉繁, 宇於崎洋一 申請人:協和發酵工業株式會社