一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法

2023-05-02 07:29:31 1

一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，該方法利用pH=8的1×TE buffer、10%Tween80和10 mM的焦磷酸鈉進行土壤懸浮液的製備；利用流式細胞儀測定樣品DNA螢光強度；流式細胞儀上樣樣品的製備及土壤中的噬菌體豐度快速分析。在FL1-H和SSC-H散點圖上圈定噬菌體範圍，根據圈定的噬菌體範圍，計算噬菌體佔總微生物量的比例。本發明的方法制樣簡單，準確性高，重複性好，操作簡便快速，為噬菌體豐度的快速測定提供了方法依據。
【專利說明】一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種測定土壤中噬菌體豐度的方法，特別是一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，屬生物【技術領域】，專用於土壤中噬菌體豐度的快速鑑定。

【背景技術】
[0002]噬菌體在自然環境中數量巨大，在調節微生物種群的結構與多樣性、促進微生物間遺傳物質的傳遞與協同進化、參與微食物環的形成等方面發揮重要角色。噬菌體對宿主菌的每一次感染都潛在著將新的遺傳信息導入宿主菌的可能。不論是在實驗室還是自然界環境中，越來越多的證據表明在微生物群落的生態和進化過程中細菌和噬菌體共同進化是關鍵驅動因素。
[0003]噬菌體作為微食物環中重要的成分，對傳統意義「微生物食物環」中的主要成分均有相當程度的影響，它使得微生物食物環變得更加複雜。病毒可在各式各樣的環境中存在，是自然環境中重要而完整的部分。而病毒豐度的變化往往與環境中的溫度、元素等其他因素相關聯。在摸索並建立起病毒豐度與環境的相應規律後，也可以通過病毒來對環境變化進行指示。
[0004]由於病毒體積微小，多數病毒直徑在20-200 nm之間。而傳統方法一般是將土樣製備成懸浮液後，分別用直接過濾除菌和切向流的膜濃縮樣品的方法分別獲得細菌液和混合病毒液，超速離心後將病毒和細菌在金屬網格上進行負染，利用透射電鏡觀察病毒樣顆粒和細菌形態，按形態分類統計後計算噬菌體豐度。還有利用SYBR-Green I螢光染料對超速離心後的病毒和細菌濃縮液染色，在螢光顯微鏡下對病毒樣顆粒和細菌顆粒計數，測定非培養條件下噬菌體和細菌總數，但是估算計數的精度不夠高，誤差較大，重複性較差。對於可培養的噬菌體大多採用測定效價來計算噬菌體的豐度，而自然界中可培養的微生物種類不到1%，而且可培養噬菌體豐度的測定必須基於宿主細菌的分離培養，因此成本高、時間久。
[0005]根據相關文獻，流式細胞儀測定噬菌體豐度的主要原理是使特異性核酸螢光染料與噬菌體的核酸物質相結合，根據其在流式細胞儀上所顯示出的側向散射光(與大小有關)和綠螢光(與核酸含量有關)信號來進行區分及計數。流式細胞儀作為一種以單細胞為對象的檢測技術，其優勢在於能快速分析大量細胞，並獲取數據易於進行多元數據分析，還能檢測低濃度下的細胞數量，檢測下限與靈敏度都得以提高，準確性提高，誤差減小，具有快速、客觀準確、重複性好，可同時測定多個指標等優點，在醫學臨床研究中的應用十分廣泛，但在土壤微生物尤其是噬菌體豐度測定中的應用相對較少，且先前相關報導得知處理土樣的方法只是用無菌水進行溶解離心和過膜的簡單處理，存在較大誤差與不穩定性。


【發明內容】

[0006]本發明提供一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，針對現有的傳統方法估算計數的精度不夠高的問題，將流式細胞儀應用於噬菌體豐度的測量，分析噬菌體豐度與水文參數間的關係，初步建立測量方法，從而更好的揭示環境微生物中生物群落結構關係；根據此前相關文獻處理土樣的方法只是用無菌水進行溶解離心和過膜的簡單處理，存在較大誤差與不穩定性，所以在土樣處理過程中，通過分別添加TweenSO和焦磷酸鈉逐步摸索條件並做了進一步優化，最後測得同時添加TweenSO和焦磷酸鈉測得的噬菌體豐度更高，而且更加準確，從而更加真實的反應環境中噬菌體的豐度，為進一步了解病毒在微生物食物環乃至整個海洋生態系統中的地位及其在生物地球化學循環中的作用提供了便利。
[0007]本發明利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，包括以下步驟:
(1)稱取1~10g 土樣，加入10-30 ml經過0.02 um濾膜過濾的pH=8的TE buffer,渦旋震蕩1~10 min後，加入體積百分比10~15%的Tween80 50-100 μ 1U-10 mM的焦磷酸鈉l~10ml，充分震蕩混勻後超聲30~45s，停止30~60s，重複3~5次，離心前充分震蕩，1000-1500 g離心1~5 min, 2500-3000 g進行二次離心1~10 min，上清液經過布氏漏鬥過濾，收集濾液；按終濃度為I μ g/ml的比例向濾液中加入DNAse I (脫氧核糖核酸酶I)和RNAse A(核糖核酸酶A)，在37°C或室溫中消化30 min後，按樣品終濃度為0.5%(v/v)的比例在分裝有樣品的凍存管中加入質量百分比濃度為25%的戊二醛，4°C避光固定15~20 min後，放入液氮迅速冷凍後，於-80°C保存；
(2)用濾過的pH=8 的 TE buffer 將 10000X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 分別稀釋到100XSYBR GoldUOOXSYBR Green I，將步驟(I)樣品取出後，37°C水浴解凍，按終濃度為0.5X染液的比例將100X染液加入到步驟(I)樣品中，常溫避光染色5 min後，80°C水浴鍋中孵育10 min，避光冷卻到室溫；流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔；將已染色的樣品進行上樣，在分析軟體中建立SSC-H/FL1-H散點圖，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光FLl-H和側向角散射光SSC-H，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點，在SSC-H/FL1-H散點圖上根據核酸含量圈定噬菌體範圍(0~102數量級)，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI
2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體範圍(0~102數量級)和計數。
[0008]所述pH=8的IXTE buffer配製如下:
I M Tris-HC:取121.1 g Tris，加濃鹽酸約42 ml高溫高鹽滅菌後，冷卻到室溫後調pH=8.0 ；
0.5 M EDTA (pH8.0) (IL):186.1 g Na2EDTA.2H20，用 NaOH 調 pH 至 8.0，高溫高壓滅囷，室溫保存；
10ΧΤΕ Buffer (ρΗ8.0) (I L):1M Tris-HCl (ρΗ7.4，7.6，8.0)取 100 ml,0.5 M EDTA(ρΗ8.0)取20 ml，高溫高壓滅菌，室溫保存。
[0009]IXTE緩衝液用10XTE緩衝液稀釋10倍即可。
[0010]本發明將流式細胞儀技術應用於土壤噬菌體豐度的測定，建立了土壤噬菌體量監測分析的體系；與現有技術相比，有益效果是:
(O克服了可培養方法成本高、時間長、數據有限的缺點；
(2)比螢光顯微鏡法更加準確，更加快速；
(3)對土壤前期處理方法進行了優化，土壤樣品經TweenSO和焦磷酸鈉同時處理測得的噬菌體豐度明顯高於其他處理方法；
總之，本發明的方法準確性高，重複性好，制樣簡單，操作簡捷快速，I?3min就可以測定樣品豐度，可節省大量的人力、物力和財力。同時我們對土壤樣品採用TweenSO和焦磷酸鈉分別和同時處理，進一步證明土壤樣品在TweenSO和焦磷酸鈉同時處理測得的噬菌體豐度明顯高於其他處理方法，為土壤微生物尤其是噬菌體豐度的測定提供技術支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是未經處理的納帕海採集的溼地土壤樣品SSC-H/FL1-H的散點圖；
圖2是經TWeen80處理的納帕海採集的溼地土壤樣品SSC-H/FL1-H的散點圖；
圖3是經焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品SSC-H/FL1-H的散點圖；
圖4是經TweenSO和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品陰性對照SSC-H/FLl-H的散點圖；
圖5是經TWeen80和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品SSC-H/FL1-H的散點圖；
圖6是經TweenSO和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品陽性對照SSC-H/FLl-H的散點圖；
圖7是經TWeen80和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的淤泥土壤樣品SSC-H/FL1-H的散點圖。

【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的保護範圍不局限於所述內容。
[0013]實施例1:流式細胞儀測定未經處理的納帕海採集的溼地土壤樣品的噬菌體豐度
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(E99°38' 09"，N27° 50' 34"，3271m)，稱取5g土樣，加入20ml無菌水，最大渦旋震蕩3min後，在59Hz超聲45s，停30s，重複3次，離心前充分震蕩，1500g離心5min, 2500g離心1min進行二次離心,上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。按I μ g/ml終濃度加入DNAse I和RNAse A，在37°C或室溫中消化30min後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% (v/v)加入25%戊二醛，4°C避光固定15min後，放入液氮迅速冷凍後，於-80°C超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的pH=8 的 TE buffer 將 10000X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 分別稀釋到100XSYBR GoldUOOXSYBR Green I，將步驟(I)樣品取出後，37°C水浴解凍，對樣品稀釋10倍，按終濃度為0.5X染液的比例將100X染液加入到步驟(I)樣品中，常溫避光染色5 min後，80°C水浴鍋中孵育10 min，避光冷卻到室溫；流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔；將已染色的樣品進行上樣，在分析軟體中建立SSC-H/FL1-H散點圖，取I管樣品進行上樣(每個樣品400 μ I )，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光FLl-H和側向角散射光SSC-H，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點，連續測定3次，在SSC-H/FL1-H散點圖上根據核酸含量圈定噬菌體範圍，如圖1所示，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度為4.70 X 15個/ml。
[0014]實施例2:流式細胞儀測定經TWeen80處理的納帕海採集的溼地土壤樣品的噬菌體豐度
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(E99°38' 09"，N27° 50' 34"，3271m)，稱取5g土樣，加入20ml經過0.02um濾膜過濾的pH=8的TE buffer,最大潤旋震蕩3min,加入10%(v/v)的Tween80 50 μ 1，充分震蕩混勻，15min後在59Hz超聲45s，停30s，重複3次，離心前充分震蕩，1500g離心5min, 2500g離心1min進行二次離心,上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液；按I μ g/ml終濃度加入DNAse I和RNAse A，在37°C或室溫中消化30min後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% (v/v)加入25%戊二醛，4°C避光固定15min後，放入液氮迅速冷凍後，於-80°C超低溫冰箱中長期保存；
(2)流式細胞儀上樣樣品的製備
用濾過的 pH=8 的 TE buffer 將 10000 X SYBR Gold 和 10000 X SYBR Green I 稀釋到100X SYBR GoldUOOXSYBR Green I，分裝成 20 μ I/管，-20°C避光保存，I 周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出，樣品從_80°C冰箱中取出後，置於37°C水浴，輕晃凍存管加速解凍；按染液終濃度為0.5X加入100X染液到樣品中，每個樣品400 μ 1，常溫避光染5min後，80°C水浴鍋中孵育lOmin，避光冷卻到室溫。流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FL1-H進行檢測。
[0015](3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立SSC-H/FL1-H散點圖，取I管樣品進行上樣(每個樣品400ul)，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(FLl-H)和側向角散射光(SSC-H)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次；在SSC-H/FL1-H散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖2所示，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度為4.09 X 16個/ml。
[0016]實施例3:流式細胞儀測定經焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品的噬菌體豐度
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(E99° 38' 09"，N27。50' 34"，3271m)，稱取5g 土樣，加入20ml經過0.02 μ m濾膜過濾的pH=8的TE buffer,最大潤旋震蕩3min,加入1mM的焦磷酸鈉6ml，充分震蕩混勻，15min後在59Hz超聲45s，停30s，重複3次，離心前充分震蕩，1500g離心5min, 2500g離心1min進行二次離心,上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。按I μ g/ml終濃度加入DNAse I和RNAse A，在37°C或室溫中消化30min後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% (v/v)加入25%戊二醛，4°C避光固定15min後，放入液氮迅速冷凍後，於-80°C超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的pH=8 TE buffer 將 10000 X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 稀釋到100X SYBR GoldUOOXSYBR Green I，分裝成20 μ I/管，_20°C避光保存，I周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出。樣品從-80°C冰箱中取出後，置於37°C水浴，輕晃凍存管加速解凍，按染液終濃度為0.5X加入100X染液到樣品中，每個樣品400 μ 1，常溫避光染5min後，80°C水浴鍋中孵育lOmin，避光冷卻到室溫，流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立SSC-H/ 散點圖，取1管樣品進行上樣(每個樣品400^ 1),調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(511-?)和側向角散射光(330?)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次，在散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖3所示，通過與80流式細胞儀相連的11=101 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度為5.08 X 106個加1。
[0017]實施例4:流式細胞儀測定經1冊61180和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品的陰性對照
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(￡99°09〃，吧7。5(^ 34〃，3271110，稱取土樣，加入201111經過0.02 0 III濾膜過濾的的丁3 1x1打61'，最大潤旋震蕩3111111，加入10%(乂八)的1冊61180 50^ 1，充分震蕩混勻，加入10禮的焦磷酸鈉601，充分震蕩混勻，15-11後在59?超聲458，停308,重複3次，離心前充分震蕩，1500^離心5-11, 2500^離心10—進行二次離心，上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。將濾液通過0.22 9 ！！！收集細菌，除去噬菌體，用同體積的邱=8的1X1打虹清洗濾膜，使細菌完全溶於呢1x1打虹緩衝液中。按1 9 8/1111終濃度加入0嫩86 I和謂\86八，在371或室溫中消化30111111後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% 「八)加入25%戊二醛，41避光固定15-11後，放入液氮迅速冷凍後，於-801超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的邱=8的 12 1x1 打61~ 將 10000X3懂和 10000X3懂 61-0011 I 分別稀釋到100X3懂601(1,100X8181？ 61-0011 I，分裝成20^1/管，-201避光保存，1周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出。樣品從-801冰箱中取出後，置於371水浴，輕晃凍存管加速解凍；按染液終濃度為0.〖X染液加入100乂染液到樣品中，每個樣品4009 1，常溫避光染5111111後，801水浴鍋中孵育10111111，避光冷卻到室溫，流式細胞儀檢測時，選擇側向角880-?和通道進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立33(:-11/ 散點圖，取1管樣品進行上樣(每個樣品400^ 1),調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(511-?)和側向角散射光(330?)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次，在散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖4所示。通過與80流式細胞儀相連的11=101 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度幾乎為零。
[0018]實施例5:流式細胞儀測定經1冊61180和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品的噬菌體豐度
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(￡99° 38, 09"，?27。50, 34〃，3271111),稱取58 土樣，加入201111經過0.02 4 III濾膜過濾的邱=8的！'3 1x1打61'，最大潤旋震蕩3111111，加入10% 「八)的1冊61180 50 ^ 1，充分震蕩混勻，加入10禮的焦磷酸鈉601，充分震蕩混勻，15111111後在59?超聲458，停308,重複3次，離心前充分震蕩，15008離心5-11, 2500^離心10111111進行二次離心，上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。按1 4 8/1111終濃度加入0嫩86 I和觀八86八，在371或室溫中消化30111111後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5^0(^/V〉加入25%戊二醛，41避光固定15-11後，放入液氮迅速冷凍後，於-801超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的邱=8的 12 1x1 打61~ 將 10000X3懂和 10000X3懂 61-0011 I 分別稀釋至Ij 100X SYBR Gold、100X SYBR Green I，分裝成 20 μ I/管，_20°C避光保存，I 周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出。樣品從_80°C冰箱中取出後，置於37°C水浴，輕晃凍存管加速解凍；按染液終濃度為0.5X染液加入100X染液到樣品中，每個樣品400 μ 1，常溫避光染5min後，80°C水浴鍋中孵育lOmin，避光冷卻到室溫，流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立SSC-H/FLl-H散點圖，取I管樣品進行上樣(每個樣品400 μ 1)，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(FLl-H)和側向角散射光(SSC-H)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次，在SSC-H/FL1-H散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖5所示。通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度為6.75 X 17個/ml。
[0019]實施例6:流式細胞儀測定方法測定經Tween80和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的溼地土壤樣品陽性對照的噬菌體豐度
(1)土壤樣品採自於納帕海的溼地(E99°38' 09"，N27° 50' 34"，3271m)，稱取5g土樣，加入20ml經過0.02 μ m濾膜過濾的pH=8的TE buffer,最大潤旋震蕩3min,加入10%(v/v)的Tween80 50 μ 1，充分震蕩混勻，加入1mM的焦磷酸鈉6ml，充分震蕩混勻，15min後在59Hz超聲45s，停30s,重複3次，離心前充分震蕩，1500g離心5min, 2500g離心1min進行二次離心，上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。將濾液通過0.22 μ m除去細菌，收集噬菌體液。按I μ g/ml終濃度加入DNAse I和RNAse A，在37°C或室溫中消化30min後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% (v/v)加入25%戊二醛，4°C避光固定15min後，放入液氮迅速冷凍後，於-80°C超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的pH=8 的 TE buffer 將 10000X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 分別稀釋至Ij 100X SYBR Gold、100X SYBR Green I，分裝成 20 μ I/管，_20°C避光保存，I 周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出。樣品從_80°C冰箱中取出後，置於37°C水浴，輕晃凍存管加速解凍；按染液終濃度為0.5X染液加入100X染液到樣品中，每個樣品400 μ 1，常溫避光染5min後，80°C水浴鍋中孵育lOmin，避光冷卻到室溫，流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立SSC-H/FLl-H散點圖，取I管樣品進行上樣(每個樣品400 μ 1)，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(FLl-H)和側向角散射光(SSC-H)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次，在SSC-H/FL1-H散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖6所示。通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數隻得到噬菌體的豐度，而細菌的豐度幾乎為零。
[0020]實施例7:流式細胞儀測定方法測定經Tween80和焦磷酸鈉處理的納帕海採集的淤泥土壤樣品的噬菌體豐度
(I)樣品採集自納帕海的淤泥(E99° 37' 28"，N27° 53' 34"，3265m)，稱取1g 土樣,加入30ml經過0.02 μ m濾膜過濾的pH=8的TE buffer,最大潤旋震蕩3min,加入15%(v/v)的Tween80 70 μ 1，充分震蕩混勻，加入5mM的焦磷酸鈉10ml，充分震蕩混勻，15min後在59Hz超聲40s,停40s,重複4次,離心前充分震蕩，100g離心5min,3000g離心Imin進行二次離心，上清經過布氏漏鬥過濾，收集濾液。按1 4 8/1111終濃度加入0嫩86 I和觀八86八，在371消化30111111後，在分裝有樣品的凍存管中按終濃度為0.5% 「八)加入25%戊二醛，41避光固定15-11後，放入液氮迅速冷凍後，於-801超低溫冰箱中長期保存；
(2)用濾過的邱=8的 12 1x1 打61~ 將 10000X3懂和 10000X3懂 61-0011 I 分別稀釋到100X3懂601(1,100X8181？ 61-0011 I，分裝成20^1/管，-201避光保存，1周內用完，使用前檢查是否沉澱或析出。樣品從-801冰箱中取出後，置於371水浴，輕晃凍存管加速解凍；按染液終濃度為0.〖X染液加入100乂染液到樣品中，每個樣品4009 1，常溫避光染5111111後，801水浴鍋中孵育10111111，避光冷卻到室溫，流式細胞儀檢測時，選擇側向角880-?和通道進行檢測；
(3)測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道通暢，噴嘴清潔，在分析軟體中建立33(:-11/ 散點圖，取1管樣品進行上樣(每個樣品400^ 1),調整並確定流式細胞儀的前向角散射光(511-?)和側向角散射光(330?)基本參數，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點結束，連續測定3次，在散點圖上圈定噬菌體範圍，如圖7所示。通過與80流式細胞儀相連的11=101 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體的範圍和計數，通過計數可得到噬菌體豐度為8.34 X 107個加1。
【權利要求】
1.一種利用流式細胞儀測定土壤中噬菌體豐度的方法，其特徵在於按如下步驟進行: (1)稱取1~10g 土樣，加入10-30 ml經過0.02 μ m濾膜過濾的pH=8的TE buffer,渦旋震蕩1~10 min後，加入體積百分比10~15%的Tween80 50-100 μ 1U-10 mM的焦磷酸鈉l~10ml，充分震蕩混勻後超聲30~45s，停止30~60s，重複3~5次，離心前充分震蕩，1000-1500 g離心1~5 min, 2500-3000 g進行二次離心1~10 min，上清液經過布氏漏鬥過濾，收集濾液；按終濃度為I μ g/ml的比例向濾液中加入DNAse I和RNAse A，在37°C或室溫中消化30 min後，按樣品終濃度為0.5% v/v的比例在分裝有樣品的凍存管中加入質量百分比濃度為25%的戊二醛，4°C避光固定15~20 min後，放入液氮迅速冷凍後，於_80°C保存； (2)用濾過的pH=8 的 TE buffer 將 10000X SYBR Gold 和 10000X SYBR Green I 分別稀釋到100XSYBR GoldUOOXSYBR Green I，將步驟(I)樣品取出後，37°C水浴解凍，按終濃度為0.5X染液的比例將100X染液加入到步驟(I)樣品中，常溫避光染色5 min後，80°C水浴鍋中孵育10 min，避光冷卻到室溫；流式細胞儀檢測時，選擇側向角SSC-H和通道FLl-H進行檢測； (3)將已染色的樣品進行上樣，在分析軟體中建立SSC-H/FL1-H散點圖，調整並確定流式細胞儀的前向角散射光FLl-H和側向角散射光SSC-H，進樣量設定在散點圖上持續打出10000個點，在SSC-H/FL1-H散點圖上根據核酸含量圈定噬菌體範圍，通過與BD流式細胞儀相連的WinMDI 2.9計算機分析軟體分析散點圖上噬菌體範圍和計數。
【文檔編號】G01N21/47GK104483290SQ201410595919
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】魏雲林, 孫策, 季秀玲, 李珊, 林連兵, 張琦 申請人:昆明理工大學