與層粘連蛋白結合的神經生長因子及其編碼基因與應用的製作方法
2023-05-02 08:10:01
專利名稱：與層粘連蛋白結合的神經生長因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與層粘連蛋白結合的神經生長因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
神經生長因子(NerveGrowth Factor, NGF)分子量為 140kDa 左右，由 α、β、 Y 3種亞基借非共價鍵構成，其組合比例為α2β y 2 (Greene and Shooter, 1980) 0其中 β亞基是由兩條相同的單鏈以非共價健連接而成的同源二聚體，其單鏈含有118個氨基 酸殘基。β亞基的三維空間結構單元是由三對反向平行的β摺疊構成的一種立體構型， 含有四個環區。環區具有識別不同受體的特徵，是NGF與受體結合產生信號轉導的關鍵區 域(Greene LA, Shooter EM(1980)The nerve growth factor :biochemistry, synthesis, and mechanism of action. Annu Rev Neurosci3 :353_402.)。它是唯一具有 NGF 生物活 性的片段，可以完全表現NGF的功能效應(BaxB，Blundell TL, Murray-Rust J, McDonald NQ (1997) Structure of mouse 7S NGF -.a complex of nerve growth factor with four binding proteins. Structure5 :1275-1285.)。在生理情況下NGF可以調控交感和感覺神 經元的生長發育及分化。周圍神經損傷後，NGF可保護神經元並促進軸突再生。因此NGF對 於神經系統疾病的治療起著重要的作用(Sofroniew MV, Howe CL, Mobley WC(2001)Nerve growth factor signaling,neuroprotection, and neural repair. Annu Rev Neurosci24 1217-1281.)。臨床應用證實，局部用藥可以使神經直接得到營養，利於神經的軸漿流動，促使神 經再生。目前NGF治療神經損傷的用藥方式主要有①在損傷局部直接給藥；②局部通過微 滲透泵緩慢釋放；③通過轉基因技術將表達NGF的細胞移植到損傷局部。然而在實際應用 中，由於體液的快速擴散作用，一次性在損傷局部直接給藥無法使NGF長時間保留在神經 損傷部位，並保持有效的生物濃度，這造成了治療的低效率。因此需要間隔性的多次給藥， 這種方式需要的藥物量很大，治療費用非常昂貴，而且由於過量的使用NGF，會引起炎症反 應，帶來副作用。微滲透泵存在有排斥反應和體內吸收問題；基因治療的載體選擇和安全性 問題較難解決，這些方法都難以在臨床推廣應用。層粘連蛋白是神經元細胞外基質的主要成分之一，它與其他細胞外基質共同構 成了神經元生長的空間支架(Yurchenco PD, Smirnov S, Mathus T(2002)Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins. Methods Cell Biol 69:111-144·)。當周圍神經受到損傷 時，損傷部位的施旺細胞會大量分泌層粘連蛋白(Fu SY,Gordon T(1997)The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobioll4 :67_116.)。
發明內容
本發明的目的是提供一種與層粘連蛋白結合的神經生長因子及其編碼基因與應用。
本發明提供的與層粘連蛋白結合的神經生長因子(LBD-NGF)，它自氨基末端至羧 基末端依次包括層粘連蛋白結合區和神經生長因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結合區(LBD)如序列表的1所示。所述與神經生長因子β亞基片段為神經生長因子β亞基(GenBank Accession Number :AAA59931)自氨基末端第122-239位胺基酸殘基；LBD是一個基本核心，在其前後加十個左右的胺基酸都不會影響其功能。即 XXXXXXXXXX 「LBD」YYYYYYYYYY，其中X和Y為任意胺基酸殘基。所述與層粘連蛋白結合的神經生長因子中還可包括組氨酸標籤序列；所述與層粘 連蛋白結合的神經生長因子自氨基末端至羧基末端依次包括所述組氨酸標籤序列、所述 層粘連蛋白結合區和所述神經生長因子β亞基片段。所述與層粘連蛋白結合的神經生長因子具體可為如下(a)或(b)或(C)的蛋白 質(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位胺基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的蛋白質經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與神經損傷修復相關的由其衍生的蛋白質。為了使(a)或(b)中的蛋白便於純化，可在由序列表中序列3所示的胺基酸序列 組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列
權利要求
一種與層粘連蛋白結合的神經生長因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括層粘連蛋白結合區和神經生長因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結合區如序列表的序列1所示；所述神經生長因子β亞基片段為神經生長因子β亞基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122 239位胺基酸殘基。
2.如權利要求1所述的神經生長因子，其特徵在於所述層粘連蛋白結合的神經生長 因子中還包括組氨酸標籤序列；所述層粘連蛋白結合的神經生長因子自氨基末端至羧基末 端依次包括組氨酸標籤序列、層粘連蛋白結合區和神經生長因子β亞基片段。
3.如權利要求1或2所述的神經生長因子，其特徵在於所述層粘連蛋白結合的神經 生長因子為如下(a)或(b)或(c)的蛋白質(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位胺基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列3所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(c)將(a)或(b)的蛋白質經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與神經損傷修復相關的由其衍生的蛋白質。
4.權利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白結合的神經生長因子的編碼基因。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下1)或2)或 3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列4自5'末端第64至861位核苷酸所示的DNA分子；2)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的 DNA分子。
6.含有權利要求4或5所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.根據權利要求6所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為將含有序 列表的序列4自5'末端第64至861位核苷酸的DNA片段導入pET28a得到的重組質粒。
8.權利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白結合的神經生長因子、權利要求4或5中 任一所述與層粘連蛋白特異結合的神經生長因子的編碼基因、權利要求6或7所述重組表 達載體中的任意一種在製備神經損傷修復藥物中的應用。
9.一種神經損傷修復藥物，它的活性成分為權利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白 特異結合的神經生長因子、權利要求4或5中任一所述與層粘連蛋白特異結合的神經生長 因子的編碼基因、權利要求6或7所述重組表達載體中的至少一種。
10.如權利要求9所述的藥物，其特徵在於所述神經損傷為周圍神經損傷，具體為坐 骨神經損傷。
全文摘要
本發明公開了一種與層粘連蛋白結合的神經生長因子及其編碼基因與應用。本發明提供的與層粘連蛋白結合的神經生長因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括層粘連蛋白結合區和神經生長因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結合區的GenBankAccession Number為NM205527；所述神經生長因子β亞基片段為神經生長因子β亞基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122-239位胺基酸殘基。本發明實現了在保持神經生長因子活性的同時，大大減少其用量，減少用量過大造成的風險，其方法可同時適用於所有促進神經損傷修復的因子以及富含層粘連蛋白的組織修復，具有重大意義。
文檔編號A61P25/02GK101955543SQ20091008971
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月21日 優先權日2009年7月21日
發明者孫文杰, 戴建武, 肖志峰, 陳冰 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所