一種規模化高效培養聚球藻7002的方法與流程
2023-05-01 14:59:16 3
本發明屬於微藻培養領域，具體涉及一種聚球藻7002規模化高效培養的方法。
背景技術：
微藻被認為是可持續生產食品、飼料、化工材料和燃料等最具有廣闊發展前景的原料。微藻具有很高的營養價值，含有豐富的色素、蛋白質、脂類以及多種礦物元素和維生素等。聚球藻是海洋中兩種最主要的藍藻之一，是海洋浮遊植物群落的優勢組分，對海洋初級生產力的貢獻達16.7%，在海洋生態系統的光合作用、碳循環以及食物鏈中扮演著舉足輕重的角色。聚球藻7002是近海的一種模式微藻，也是目前發現的分裂速度最快的藍細菌，具有天然的外源DNA轉化系統，其全基因組也已被破譯，是目前公認的一種理想的「工程微藻」構建平臺。多株轉基因聚球藻7002藻株被先後構建，因此其在發酵生產活性物質領域具有巨大潛力。
國家非常重視新資源食品的研究開發，新資源食品目錄中不乏微藻類食品，如蛋白核小球藻、雨生紅球藻、杜氏鹽藻等。聚球藻7002含有豐富的色素、蛋白質、脂質和礦物質元素，營養價值很高，具有被開發成為新資源食品的巨大潛力。聚球藻7002生長過程中會產生嗜鐵素等多種次級代謝產物，這些次級代謝產物同樣具有良好的功能活性，可以用於功能保健食品的開發。對聚球藻進行綜合利用開發的前提是可以進行規模化高效率的生產。目前，還未見關於聚球藻7002大規模培養的相關案例。
微藻進行廣泛應用的前提是其可以進行大規模培養，在短時間內獲得足夠的生物質。微藻培養的規模、成本和效率往往成為其在研究利用中的限制因素。實驗室進行少量的微藻培養時一般對培養基進行充分滅菌，因為溫度、光照等培養條件控制良好，且沒有細菌汙染，所以培養的效果較好。然而，微藻大規模培養時不可避免的會出現溫度波動、光照不充分、細菌汙染等不利因素。
聚球藻7002的規模化培養存在以下困難：
1）不同於螺旋藻、小球藻等微藻，聚球藻7002對於外界細菌汙染的敏感度高，容易受到細菌汙染的影響；2）不同生長階段的聚球藻7002對培養條件的需求不同，不恰當的光和碳供應容易對其生長造成抑制；3）儘管分裂速度較快，但是規模化培養時的效率較低，短時間內無法達到較高的密度，培養成本高。因此，開發一種高效的規模化培養方法，對於聚球藻的研究利用具有非常重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種聚球藻7002規模化高效培養的方法，於短時間內獲得足量的聚球藻7002生物質，為其廣泛應用提供技術保障，以彌補現有技術的不足。
本發明以聚球藻7002為藻種，採用逐級放大培養的模式，利用懸掛式培養袋對其進行規模化培養，對光照強度、二氧化碳濃度和通氣量大小進行逐級調整，以實現聚球藻的高效規模化培養。
為達到上述目的，本發明採取的具體技術方案為：
一種聚球藻7002規模化高效培養的方法，包括以下步驟：
（1）首先接種種子液，初始接種密度值OD750為0.10-0.15，每個培養袋的培養體積為15-20 L，培養基中的維生素B12濃度提高到10-40 µg/L，控制光照強度為20-30 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.5%-0.6%，通氣量為45-60 L/ h；
（2）實時監測聚球藻7002的生長情況，當其密度達到OD750 為0.4-0.6時，調整光照強度為40-60 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.7%-0.8%，通氣量為60-80 L/h；
（3）當聚球藻7002的密度達到OD750為1.0-1.5時，調整光照強度為80-120 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.8%-1.0%，通氣量為90-120 L/h，此時補充添加鐵離子，添加量為40-160 µg/L；
（4）當聚球藻7002的密度達到OD750 超過2時，調整光照強度為120-160 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為1.2-1.5%，通氣量為120-160 L/h，聚球藻的藻密度OD750達到4以上即可收穫。
通過逐級調節培養，培養至14 d左右聚球藻的藻密度OD750 可以達到4以上，可收穫聚球藻乾重2.5-4.0 g/L。
上述整個培養過程中的溫度為25℃-38℃。
上述培養過程中光源為陽光結合日光燈，當陽光較為強烈時用遮陽網進行遮蔽，陽光較弱時，使用日光燈補光，光照方式為每天至少12 h光照。
上述培養過程中通入氣體為空氣和二氧化碳的混合氣，經空氣過濾裝置除菌，加樣完畢後在加樣口覆蓋通氣封口膜。
上述空氣過濾裝置可為大直徑孔徑為0.22 µm的過濾器。
上述步驟（1）中種子液的獲得方式為純培養，具體方法為用接種環在固體平板上挑取藻株進行250 mL搖瓶培養，裝瓶量40%-50%，溫度32 ℃， pH 8.2，光強100 µmol/(m2•s)，搖速150 r/min；培養一周後轉入5 L培養瓶通氣培養，裝瓶量60%-80%，培養密度達到OD750在4以上，進行接種；其中通氣為1%的二氧化碳，通氣量為30-40 L/h。
本發明的優點和有益效果是：本發明提供了一種聚球藻7002高效培養的新模式，採用懸掛式培養袋進行培養，節約空間，降低成本，便於控制；通過光照強度、二氧化碳濃度和通氣量大小的調整對聚球藻7002進行階段化培養，操作簡單，適用性強，培養效率高。採用空氣過濾裝置對培養氣體進行過濾，以及在加樣口覆蓋封口膜等方式有效避免了外源汙染，提高了聚球藻7002的生產品質；培養過程通過調整維生素B12和鐵離子的量，促進了藻細胞的快速生長，使其迅速形成種群優勢。
本發明適用於室內或室外對聚球藻進行培養。顯然，本發明能較大規模地對聚球藻7002進行高效發酵，充分提高了效率，節約了成本，是一種獲得聚球藻7002藻粉及附加發酵產物的有效方法。本發明採用培養袋進行培養，提供相對密閉的培養空間，培養效果較好，且培養袋經濟便捷，便於進行條件控制，可重複使用。
附圖說明
圖1為聚球藻7002的規模化高效培養的聚球藻藻液圖。
圖2為聚球藻7002規模化高效培養模式圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。
實施例1：
一種聚球藻7002規模化高效培養的方法，包括以下步驟（培養流程如圖2所示）：
（1）首先，接種種子液，初始接種密度值OD750為0.10，每個培養袋的培養體積為15 L，培養基中的維生素B12濃度提高到10 µg/L，控制光照強度為20 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.5%，通氣量為45 L/ h；
（2）其次，實時監測聚球藻7002的生長情況，當其密度達到OD750 為0.4時，調整光照強度為40 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.7%，通氣量為60 L/h；
（3）當聚球藻7002的密度達到OD750為1.0時，調整光照強度為80 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.8%，通氣量為90 L/h，此時補充添加鐵離子，添加量為40 µg/L；
（4）當聚球藻7002的密度達到OD750 超過2時，調整光照強度為120 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為1.2 %，通氣量為120 L/h。
通過逐級調節培養，培養至14 d左右，可收穫聚球藻乾重2.5 g/L。
上述培養過程中的溫度為25℃-38℃，光源為陽光結合日光燈，當陽光較為強烈時用遮陽網進行遮蔽，陽光較弱時，使用日光燈補光，光照方式為每天至少12 h光照；通入氣體為空氣和二氧化碳的混合氣，經空氣過濾裝置除菌，加樣完畢後在加樣口覆蓋通氣封口膜。
上述空氣過濾裝置可為孔徑為0.22 µm的濾器，也可為其他市售可進行空氣過濾除菌的裝置。
上述種子液的獲得方式為純培養，具體方法為用接種環固體平板上挑取藻株進行250 mL搖瓶培養，裝瓶量40%，溫度32℃， pH 8.2，光強100 µmol/(m2•s)，搖速150 r/min。培養一周後轉入5 L培養瓶通氣培養，裝瓶量60%，培養密度達到OD750在4以上，進行接種。其中通氣為1%的二氧化碳，通氣量為30 L/h。
實施例2：
一種聚球藻7002規模化高效培養的方法，包括以下步驟（培養流程如圖2所示）：
（1）首先，接種種子液，初始接種密度值OD750為0.12，每個培養袋的培養體積為18 L，培養基中的維生素B12濃度提高到20 µg/L，控制光照強度為25 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.5%，通氣量為55 L/ h；
（2）其次，實時監測聚球藻7002的生長情況，當其密度達到OD750 為0.5時，調整光照強度為50 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.7%，通氣量為70 L/h；
（3）當聚球藻7002的密度達到OD750為1.2時，調整光照強度為100 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.9%，通氣量為105 L/h，此時補充添加鐵離子，添加量為80 µg/L；
（4）當聚球藻7002的密度達到OD750 超過2時，調整光照強度為140 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為1.2 %，通氣量為140 L/h。
通過逐級調節培養，培養至14 d左右，可收穫聚球藻乾重3.5 g/L。
上述培養過程中的溫度為25℃-38℃，光源為陽光結合日光燈，當陽光較為強烈時用遮陽網進行遮蔽，陽光較弱時，使用日光燈補光，光照方式為每天至少12 h光照；通入氣體為空氣和二氧化碳的混合氣，經空氣過濾裝置除菌，加樣完畢後在加樣口覆蓋通氣封口膜。
上述空氣過濾裝置可為孔徑為0.22 µm的濾器，也可為其他市售可進行空氣過濾除菌的裝置。
上述種子液的獲得方式為純培養，具體方法為用接種環固體平板上挑取藻株進行250 mL搖瓶培養，裝瓶量50%，溫度32 ℃，pH 8.2，光強100 µmol/(m2•s)，搖速150 r/min。培養一周後轉入5 L培養瓶通氣培養，裝瓶量70%，培養密度達到OD750在4以上，進行接種。其中通氣為1%的二氧化碳，通氣量為35 L/h。
實施例3：
一種聚球藻7002規模化高效培養的方法，包括以下步驟（培養流程如圖2所示）：
（1）首先，接種種子液，初始接種密度值OD750為0.15，每個培養袋的培養體積為20 L，培養基中的維生素B12濃度提高到40 µg/L，控制光照強度為30 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.6%，通氣量為60 L/ h；
（2）其次，實時監測聚球藻7002的生長情況，當其密度達到OD750 為0.6時，調整光照強度為60 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為0.8%，通氣量為80 L/h；
（3）當聚球藻7002的密度達到OD750為1.5時，調整光照強度為120 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為1.0%，通氣量為120 L/h，此時補充添加鐵離子，添加量為160 µg/L；
（4）當聚球藻7002的密度達到OD750 超過2時，調整光照強度為160 µmol/(m2•s)，二氧化碳濃度為1.5%，通氣量為160 L/h。
通過逐級調節培養，培養至14 d左右，可收穫聚球藻乾重4.0 g/L。
上述培養過程中的溫度為25℃-38℃，光源為陽光結合日光燈，當陽光較為強烈時用遮陽網進行遮蔽，陽光較弱時，使用日光燈補光，光照方式為每天至少12 h光照；通入氣體為空氣和二氧化碳的混合氣，經空氣過濾裝置除菌，加樣完畢後在加樣口覆蓋通氣封口膜。
上述空氣過濾裝置可為孔徑為0.22 µm的濾器，也可為其他市售可進行空氣過濾除菌的裝置。
上述種子液的獲得方式為純培養，具體方法為用接種環固體平板上挑取藻株進行250 mL搖瓶培養，裝瓶量50%，溫度32 ℃， pH 8.2，光強100 µmol/(m2•s)，搖速150 r/min。培養一周後轉入5 L培養瓶通氣培養，裝瓶量80%，培養密度達到OD750在4以上，進行接種。其中通氣為1%的二氧化碳，通氣量為40 L/h。
如圖1所示，其中，圖1.A是聚球藻7002種子液的製備；圖1.B 聚球藻7002的袋式培養效果圖；圖1.C 收穫後的藻液。本發明以聚球藻7002為藻種，採用逐級放大培養的模式，利用懸掛式培養袋對其進行規模化培養，每20 cm懸掛一個培養袋，可根據培養空間進行多個培養袋同時培養；本發明中的種子液是通過純培養方式得到的藻密度OD750達到4以上的聚球藻7002；為了減少空氣中的細菌汙染，本發明在通氣培養過程中安裝了空氣過濾裝置進行除菌，培養袋加樣口覆蓋通氣封口膜；考慮到聚球藻不同生長階段對培養條件的需求不同，本發明根據聚球藻7002的密度對光照強度、二氧化碳濃度和通氣量大小進行逐級調整，同時為提高其生長速率，培養過程中調整了維生素B12和鐵離子的濃度，實現了聚球藻的高效規模化培養，培養規模大，效率高，成本低。