用於衛生監控的表面潔淨檢測試劑的製作方法
2023-05-01 15:00:01 2
專利名稱：用於衛生監控的表面潔淨檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於衛生防疫技術領域，涉及衛生檢測與監控，尤其涉及一種
基於ATP生物螢光法和酶循環放大技術相結合來實現衛生表面潔淨度快速 檢測的試劑。
背景技術：
在食品、化妝品、電子、醫療等行業的正常運轉過程中，對操作人員 手、使用器具及工作檯面等環境衛生的控制和檢測至關重要。目前，大多 數企業和衛生監督機構主要以物體表面的微生物數量來評估環境衛生狀 況，且檢測時依賴於傳統或改進的瓊脂平板培養法，其檢測速度慢，效率 低，從採集樣品到取得結果至少需要24 48小時，無法達到企業及衛生 質量監督機構快速獲取環境微生物信息的要求。另一方面，物體表面往往 不僅存在微生物，其上的大量體細胞或產品殘留物也將極大地影響物體表 面的清潔程度。因此，需要研製開發一種快速、準確、簡便的衛生表面清 潔快速檢測方法，來對環境衛生狀況進行實時而有效的檢測和監控。
三磷酸腺苷(ATP)生物螢光法是目前有望實現即時檢測衛生表面清 潔程度的快速方法。該法是利用生物體中ATP與螢光素、螢光素酶反應產 生的螢光與ATP濃度在一定範圍內呈線性關係的原理，來檢測生物體的存
在。該法無需培養過程，操作簡便、靈敏度高，數分鐘內即可得到檢測結 果，因此在微生物汙染及生物量檢測中得到了迅速發展，許多國家已將它 作為環境衛生現場監督檢測的有效手段，而國內尚處於起步階段。然而，
ATP生物螢光法由於反應生成的螢光信號較弱且衰減很快，其靈敏度往往 達不到檢測要求，需要進一步結合其它手段來提高檢測靈敏度。
酶循環放大技術是一種最為直接、簡便的改善ATP生物螢光法靈敏度 的技術。它主要是在磷酸鹽(或磷酸基)化合物存在時，利用ATP再生酶 的催化作用來促使ATP生物螢光反應的產物AMP (—磷酸腺苷)再轉化 為ATP，從而放大ATP生物反應產生的螢光信號。近年來，國內已有專利 CN1338003涉及到將ATP再生酶應用於檢體汙染物的檢測，但所用磷酸 基化合物熱穩定性差且用量大，可能存在ATP再生效率低、不經濟的問題。
發明內容
本發明的目的就是針對以上不足，為環境衛生質量控制提供一種操作 簡便、檢測速度快、靈敏度高且檢測成本低的檢測試劑，可用於現場快速 檢測，用於食品、化妝品、醫療等行業的物體表面潔淨度快速檢測及衛生 質量監督機構的現場衛生監督。
為達到以上目的，本發明的解決方案是提供一種將三磷酸腺苷(ATP) 生物螢光法和酶循環放大技術相結合來實現衛生表面潔淨快速檢測與現 場評估的試劑，該檢測試劑主要包括ATP釋放劑及含有ATP再生酶的熒 光誘導劑。
本發明的提供的用於衛生監控的表面潔淨檢測試劑，由三磷酸腺苷釋
放劑和含有三磷酸腺苷再生酶的螢光誘導劑組成；其中-
三磷酸腺苷釋放劑中按每毫升計，含有0.005 2mg的離子型表面活 性劑、0.01 12mg的非離子型表面活性劑和20 200mM的三羥甲基氨基 甲烷(Tris)緩衝液；
含有三磷酸腺苷再生酶的螢光誘導劑中按每毫升計，含有0.005 3mg的螢光素、0.005 1.2mg的螢光素酶、1 15mM可溶性無機鎂鹽、 0.5 80mM的酶穩定劑、(U 8mM的螢光增強劑、(U 15mM的中和劑、 0.001 1.3mM的多磷酸化合物、0.002 100U的三磷酸腺苷再生酶以及 20 500mM的三羥甲基氨基甲垸緩衝液，該緩衝劑的pH=7.2-7.8。
所述的檢測試劑，其中，離子型表面活性劑是從十二垸基三甲基溴化 銨(DTAB)、十二烷基二甲基苄基溴化銨(BDDAB)、苄索氯銨(BZC)、 十六垸基氯化吡啶(CPC)等季銨鹽型，以及十二烷基磺酸鈉(SDS)、月 桂基磺酸鈉、十二垸基苯磺酸鈉等磺酸鹽型表面活性劑中至少選取一種組 成。
所述的檢測試劑，其中，非離子表面活性劑是從脂肪醇聚氧乙烯(15) 醚(AEO-15)、烷基酚聚氧乙烯(15灘(OP-15)、辛基苯基聚氧乙烯醚(Triton X-IOO)、壬基酚聚氧乙烯(10)醚(NP-10)等聚乙二醇型表面活性劑中 至少選取一種組成。
所述的檢測試劑，其中，酶穩定劑是從牛血清白蛋白、凝膠、甘油、 乙烯基乙二醇、硫酸銨中至少選取一種組成。
所述的檢測試劑，其中，螢光增強劑是從輔酶A、焦磷酸鹽、二硫蘇 糖醇、巰基乙醇、巰基丙氨酸、聚乙二醇、二乙氨乙基葡聚糖中至少選取
一種組成。
所述的檢測試劑，其中，中和劑是從環式糊精、吐溫、乙二胺四乙酸、 環己烯二氨四乙酸中至少逸取一種組成。
所述的檢測試劑，其中，三磷酸腺苷再生酶是從丙酮酸正磷酸二激酶、 丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、磷酸基轉移酶、多磷酸合成酶等中至少選取一 種組成。
具體實施例方式
本發明提供的將ATP生物螢光法和酶循環放大技術相結合來實現衛 生表面潔淨度快速檢測與現場評估的試劑，主要包括ATP釋放劑及含有 ATP再生酶的螢光誘導劑。
ATP釋放劑，主要含有十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、十二烷基苄 基二甲基溴化銨(BDDAB)、苄索氯銨(BZC)、十六垸基氯化吡啶(CPC) 等季銨鹽型，以及十二垸基磺酸鈉(SDS)、月桂基磺酸鈉、十二垸基苯磺 酸鈉等磺酸鹽型表面活性劑中至少一種離子型表面活性劑，以及脂肪醇聚 氧乙烯(15)醚(AEO-15)、烷基酚聚氧乙烯(15)醚(OP-15)、辛基苯基聚氧 乙烯醚(Triton X-IOO)、壬基酚聚氧乙烯(10)醚(NP-10)等聚乙二醇 型表面活性劑中至少一種非離子型表面活性劑。
其製備過程為取0.005 2g的離子型表面活性劑和0.01 12g的非 離子型表面活性劑溶解於20 200mM的Tris緩衝液(用鹽酸或10%氫氧 化鈉調節pH-7.2-7.8)中，使其終體積為1L。這裡，所有試劑均採用分析 純，mM是指一種濃度單位(即毫摩爾/升)。此釋放劑可在室溫條件下2min 內將樣品中微生物、體細胞及產品殘渣中的ATP全部釋放出來，為ATP 生物螢光反應提供可定量檢測的反應物質ATP。含有ATP再生酶的螢光誘導劑，是由螢光素、螢光素酶和可溶性無 機鎂鹽、穩定劑、螢光增強劑、中和劑、多磷酸化合物、ATP再生酶和 Tris緩衝液(pH=7.8)組成。其中，螢光素、螢光素酶和可溶性無機鎂鹽 為ATP生物螢光反應的必需試劑；酶穩定劑和螢光增強劑為用於穩定反應 試劑、提高反應活性的輔助試劑，分別從牛血清白蛋白、凝膠、甘油、乙 烯基乙二醇、硫酸銨中以及輔酶A、焦磷酸鹽、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、 巰基丙氨酸、聚乙二醇、二乙氨乙基葡聚糖中至少選取一種組成。中和劑， 是從環式糊精、吐溫、乙二胺四乙酸、環己烯二氨四乙酸中至少選取一種 組成，主要用於緩解體系中剩餘的ATP釋放劑對生物螢光反應的抑制作 用；ATP再生酶，則是從丙酮酸正磷酸二激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、 磷酸基轉移酶、多磷酸合成酶中至少選取一種組成，主要用來催化ATP 生物螢光反應的產物AMP (—磷酸腺苷)與多磷酸化合物中的磷酸根結 合形成ATP，從而使ATP得到循環利用來進一步放大反應產生的螢光信 號。其製備過程為先取1 15mM的可溶性無機鎂鹽、0.5 80mM的酶 穩定劑、0.1 8mM的螢光增強劑和0.1 15mM的中和劑溶解於20 500mM的Tris緩衝液(用鹽酸或醋酸調節PH為7.8)中，使溶液終體積 為10mL，然後再加入0.05 30mg的螢光素和0.05 12mg的螢光素酶使 其溶解，並對溶液進行分裝、避光保存以備用。所有試劑均採用分析純， 這樣便獲得了含有中和劑的ATP生物螢光反應體系，此體系可直接用於定
量檢測ATP，也可以在此基礎上進一步加入0.001 1.3mM的多磷酸化合 物和0.002 100U/mL的三磷酸腺苷再生酶來形成更高靈敏度的螢光誘導劑。 '下面結合具體實施例對本發明進行描述 實施例l:優選一套檢測試劑，其組成及濃度如下所示。ATP釋放劑組成為十二垸基三甲基溴化銨 0.2 mg/ml脂肪醇聚氧乙烯(15)醚 1.2 mg/mlTris-HCl (20mM) PH7.4不含ATP再生酶的螢光誘導劑的組成為螢光素 0.3mg/mL螢光素酶 0.05mg/mL氯化鎂 10mM牛血清白蛋白 O.llmM乙二胺四乙酸 2mM焦磷酸四鈉 0.02 mM二硫蘇糖醇 lmM環式糊精 6mMTris-HCl (50mM) PH7.8將以上ATP釋放劑和不含ATP再生酶的螢光誘導劑，按所示濃度配 制出一套檢測試劑，來快速檢測實驗室的稱量工具的表面潔淨度。檢測時， 先對待測物體用棉拭子在其整個表面上來回塗抹2 3次進行取樣後，將 樣品分散於5mL溶液中，獲得樣品溶液；然後取出0.05mL的樣品溶液置 於試管中，加入0.05mL的ATP釋放劑後稍加振蕩；再加入0.3mL的螢光 誘導劑，結合螢光檢測儀來檢測，用相對發光值RLU來表示測定值。測 得天平託盤、稱量勺和稱量瓶對應的螢光檢測值分別為79RLU、 6RLU和 37RLU。實施例2:優選了一套檢測試劑，其組成及濃度如下所示。ATP釋放劑組成為十二垸基磺酸鈉O.lmg/ml曲拉通X-100lmg/mlTris-HCl (20mM)PH7.8含有ATP再生酶的螢光誘導劑的組成為螢光素0.25mg/mL螢光素酶0.04mg/mL氯化鎂10mM牛血清白蛋白O.llmM乙二胺四乙酸2mM輔酶A0.05 mM二硫蘇糖醇lmM多磷酸化合物0.05mM
多磷酸合成酶 0.1U/mL 腺苷酸激酶 0.5U/mL Tris-HCl (50mM) PH7.8將以上ATP釋放劑和含有ATP再生酶的螢光誘導劑，按所示濃度分 別配製得到一套檢測試劑，來對實驗室工作環境的表面清潔度進行快速檢 測；同時配製不含ATP再生酶的螢光誘導劑，作對比檢測。檢測時，先 對待測表面用棉拭子塗抹100cm2的面積進行取樣，對表面面積不足 100cm2的門把手則用棉拭子在整個表面上來回塗抹2 3次進行取樣，獲 得樣品溶液；然後取出0.05mL的樣品溶液置於試管中，依次加入0.05mL 的ATP釋放劑和0.3mL的螢光誘導劑，結合螢光檢測儀來檢測，用相對 發光值RLU來表示測定值，測得結果見表1所示。可以看出，在有ATP再生酶存在時的發光量檢測值要明顯低於無ATP 再生酶時，這是因為無ATP再生酶時獲得的螢光量完全是由樣品中的ATP 引起的，此螢光容易發生衰減而不穩定；而一旦加入ATP再生酶和相應 的多磷酸化合物，就可以促使ATP生物螢光反應的AMP再次轉化為ATP 而循環參與螢光反應， 一定程度上穩定了樣品中的ATP參與反應得到的 螢光量，從而有效地提高了檢測的靈敏度。表l有無ATP再生酶時的對比檢測結果檢測對象取樣面積發光量檢澳隨(RLU)(cm2)有ATP再生酶無ATP再生酶門把手1<畫24556門把手2<畫16723水池1100630270水池2100480190工作檯面1100298161工作檯面210022063工作檯面310052權利要求
1、一種用於衛生監控的表面潔淨檢測試劑，由三磷酸腺苷釋放劑和含有三磷酸腺苷再生酶的螢光誘導劑組成；其中三磷酸腺苷釋放劑中按每毫升計，含有0.005～2mg的離子型表面活性劑、0.01～12mg的非離子型表面活性劑和20～200mM的三羥甲基氨基甲烷緩衝液；含有三磷酸腺苷再生酶的螢光誘導劑中按每毫升計，含有0.005～3mg的螢光素、0.005～1.2mg的螢光素酶、1～15mM可溶性無機鎂鹽、0.5～80mM的酶穩定劑、0.1～8mM的螢光增強劑、0.1～15mM的中和劑、0.001～1.3mM的多磷酸化合物、0.002～100U的三磷酸腺苷再生酶以及20～500mM的三羥甲基氨基甲烷緩衝液；三羥甲基氨基甲烷緩衝劑的pH＝7.2-7.8。
2、 如權利要求1所述的檢測試劑，其中，離子型表面活性劑是從十 二烷基三甲基溴化銨、十二烷基二甲基苄基溴化銨、苄索氯銨、十六垸基 氯化吡啶、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉中至少選取一種組成。
3、 如權利要求1所述的檢測試劑，其中，非離子表面活性劑是從脂 肪醇聚氧乙烯(15)醚、烷基酚聚氧乙烯(15)醚、辛基苯基聚氧乙烯醚、壬基 酚聚氧乙烯(10)醚中至少選取一種組成。
4、 如權利要求1所述的檢測試劑，其中，酶穩定劑是從牛血清白蛋 白、凝膠、甘油、乙烯基乙二醇、硫酸銨中至少選取一種組成。
5、 如權利要求1所述的檢測試劑，其中，螢光增強劑是從輔酶A、 焦磷酸鹽、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、巰基丙氨酸、聚乙二醇、二乙氨乙基 菊聚糖中歪小逸取一種組成。
6、 如權利要求1所述的檢測試劑，其中，中和劑是從環式糊精、吐 溫、乙二胺四乙酸、環己烯二氨四乙酸中至少選取一種組成。
7、 權利要求1所述的檢測試劑，其中，三磷酸腺苷再生酶是從丙酮 酸正磷酸二激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、磷酸基轉移酶、多磷酸合成 酶中至少選取一種組成。
全文摘要
本發明公開了一種用於衛生監督的表面潔淨度檢測試劑，是基於ATP生物螢光法和酶循環放大技術相結合來實現衛生表面潔淨度的快速檢測與現場評估。包括ATP釋放劑及含有ATP再生酶的螢光誘導劑。其ATP釋放劑可以同時釋放微生物、體細胞及產品殘渣中的ATP，螢光誘導劑可與ATP反應產生可定量的螢光，並結合ATP再生酶對反應產生的螢光信號作進一步的循環放大。本發明的優點在於，試劑使用方便，操作簡單，響應快，靈敏度高且檢測成本低，適合廣泛用於食品、化妝品、醫療等行業的衛生監控與現場衛生監督。
文檔編號C12Q1/25GK101126718SQ20061011241
公開日2008年2月20日 申請日期2006年8月16日 優先權日2006年8月16日
發明者何保山, 劉春秀, 周愛玉, 嶽偉偉, 羅金平, 蔡新霞 申請人:中國科學院電子學研究所