具有抗炎活性的皮膚細胞及其製備方法和該細胞在皮膚感染創面中的應用的製作方法

2023-05-01 15:10:41 2

專利名稱：具有抗炎活性的皮膚細胞及其製備方法和該細胞在皮膚感染創面中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉來源於皮膚的醫用配置品，特別是一種具有抗炎活性的皮膚細胞及其製備方法和該細胞在皮膚感染創面中的應用。
背景技術：
由於創傷、燒傷、感染和糖尿病等原因造成的皮膚缺損和皮膚潰瘍日益增多。加速大面積皮膚缺損和皮膚潰瘍的修復，減少致殘率是外科領域面臨的重要課題。隨著現代醫學技術的發展，自體和異體皮膚移植，異體或異種無細胞真皮替代物，人工合成代用品等皮膚移植技術有了長足的進步。特別是近年來生命科學與工程學交叉誕生了組織工程學。組織工程學的建立和發展為皮膚缺損的修復開闢了新路。
組織工程皮膚實施策略是1.獲得種子細胞經體外擴增以後直接種植於缺損的皮膚表面。2.擴增的種子細胞與載體結合植入皮膚缺損處。3.種子細胞—載體複合物在體外形成人工皮膚，再植入皮膚缺損處。然而，臨床和實驗研究發現，這三種方法均不同程度的存在由於感染造成的移植失敗，種子細胞難以在缺損的皮膚表面成活。究其原因，首先是皮膚缺損環境多見有感染；其次是經過處理的種子細胞自身的活性差，缺乏抗感染能力。因此，提高種子細胞活性和抗感染能力成為皮膚細胞和皮膚結構物移植成功的關鍵。
有研究將種子細胞進行基因改造，提高了種子細胞的活性，但發現誘導分化趨向難以控制，生物安全性不穩定。有學者提出要求移植皮膚環境絕對無菌，但從臨床實踐的角度出發，創面的絕對無菌難以保證。
中國專利1070568公開了「一種複合的活的皮膚等同物」，它是由培養角化細胞的表皮層、無孔膠原層和多孔的膠聯化的膠原海綿基質上，有培養的成纖維細胞真皮層所組成，並經胃蛋白酶處理，用於皮膚移植和離體實驗各種物質對皮膚的影響。
中國專利1466999公開的是「活性無細胞真皮基質及其製備方法」，該基質含有(a)基本上不含細胞的真皮基質，(b)有效量選自下組細胞因子成纖維細胞生長因子，血管內皮細胞生長因子，血小板衍生生長因子，轉化生長因子-α或其混合物。本發明可在短時間內與創面基底建立良好的血液循環，提高移植成活率，並改善移植效果。
中國專利1468634則公開了一種「雙層人工皮膚及其製備方法」，它包括(a)真皮層含有聚羥基乙酸等生物可降解材料、成纖維細胞和基質蛋白，(b)位於真皮層一個表面之上的表皮層。在該皮膚中有連續的表達細胞生長在成纖維細胞-PGA複合物表面，且表皮細胞分化良好，有較明顯的分層。切片顯示組織工程人工皮膚具有和正常人體皮膚相似的組織結構特徵。

發明內容
本發明是為了解決現有皮膚移植過程中，種子細胞自身的活性差，缺乏抗感染能力，而提供一種具有良好增殖活性和抗感染活性的具有抗炎活性的皮膚細胞及其製備方法和該細胞在皮膚感染創面中的應用。
一種具有抗炎活性的皮膚細胞，其特徵在於該細胞具有抗炎活性和功能活性表達，抗炎誘導液中原代細胞濃度為1×104～1×106/ml；傳代細胞培養細胞濃度為1×104～1×105/ml。
一種具有抗炎活性的皮膚細胞的製備方法，其特徵在於a.二步酶消化法分離皮膚，獲得表皮細胞和成纖維細胞，將兩種細胞以1∶5～1∶15的比例在37℃，5％CO2條件下共培養，獲得角質形成細胞的單細胞懸液和成纖維細胞的單細胞懸液；b.角質形成細胞的單細胞懸液和成纖維細胞的單細胞懸液在其成分包括MEM基礎培養液50～90％，胎牛血清5～40％，中藥提取液0.5～10％的抗炎誘導液中配製成細胞濃度為1×104～1×106/ml的細胞懸液，用作原代細胞；c.再以細胞濃度為1×104～1×105/ml的原代細胞接種在培養瓶中，在37℃，5％CO2條件下傳代培養，使細胞在抗炎誘導液的環境下，大量增殖為具有抗炎活性的皮膚細胞，使皮膚細胞具有抗炎活性和功能活性。
所述的製備方法，其中藥提取液，包括當歸2～20g、生地4～40g、龜板2～20g、血餘2～20g、象皮3～30g、爐甘石3～30g，加潔淨水100～2000ml，浸泡1～5小時；100℃加熱浸煮30～120分鐘，或微波提取10～60分鐘。將獲取的中藥提取液進行活性炭脫色，水浴60～90℃濃縮，收集濃縮液10～200ml。
所述的製備方法，其酶消化分離皮膚是採用動物或人體的去掉表面毛髮和皮下結締組織的健康皮膚。
一種具有抗炎活性的皮膚細胞在皮膚感染創面中的應用，其特徵在於將原代細胞和具有抗炎活性的皮膚細胞接種於實驗動物和臨床感染創面，細胞接種密度為1×102～1×104/cm2，細胞在抗炎誘導液的環境裡，可在感染創面成活，促進皮島生成，加速創面癒合。
使用這種方法製備的皮膚細胞能在感染性的皮膚缺損或潰瘍創面存活且能保持良好的表皮細胞生物學特性，降低皮膚細胞和皮膚結構物移植感染率，促進皮膚缺損修復，創面癒合後瘢痕組織鬆軟；這樣製備的硝基藍四唑鹽(MTT)增殖曲線明顯增高，成纖維細胞分泌I型、III型膠原陽性表達增加，角質形成細胞分泌角蛋白19陽性率明顯高於對照組。


圖1為本發明培養的表皮細胞圖。
圖2為本發明培養的成纖維細胞圖。
圖3為本發明成纖維細胞的細胞增殖實驗圖。
圖4為本發明表皮細胞的細胞增殖實驗圖。
圖中OD為吸光度，EGF為表皮細胞生長因子。
具體實施例方式
本發明採用常規無菌操作技術，取正常哺乳動物或人體皮膚，厚度1mm～3mm，去除皮膚表面的毛髮和皮下結締組織，用含有青黴素10U/ml、鏈黴素10μg/ml的Hank’s液洗滌3次。將皮膚組織修剪成1mm×3mm大小，進入第一步酶消化加入5-10倍量的0.01～0.25％ Dispase II液，在4℃冰箱中進行8～24小時消化。用少量胎牛血清終止消化；用Hank’s液洗滌後分離表皮層和真皮層。第二步酶消化將獲取的表皮放入0.01～0.25％胰蛋白酶液中，37℃搖床培養箱中消化1～5小時。加入胎牛血清終止消化，將細胞懸液經100目鋼網過濾，獲得角質形成細胞的單細胞懸液。將獲取的真皮放入0.05～0.5％胰蛋白酶液中，37℃搖床培養箱中消化1～5小時。加入胎牛血清終止消化，將細胞懸液經100目鋼網過濾，獲得成纖維細胞的單細胞懸液。
將角質形成細胞和成纖維細胞分別在800～1500rpm/min離心8分鐘，棄去上清夜，用含有MEM基礎培基50～90％、胎牛血清5～40％、中藥提取液0.5～10％的抗炎誘導培養液配製成細胞濃度為1×104～1×106/ml的細胞懸液。可用作原代細胞種植、傳代培養、深低溫凍存。原代細胞用於創面種植，角質形成細胞和成纖維細胞的比例為1∶5～1∶15，細胞濃度為1×102～1×104/cm2；傳代培養細胞的細胞濃度為1×1041×105/ml，接種於50～200ml塑料培養瓶中，在37℃、5％CO2條件下進行培養，每3天更換抗炎誘導液一次，該細胞在抗炎誘導液的環境下可獲得大量增殖，硝基藍四唑鹽(MTT)增殖曲線明顯增高，成纖維細胞分泌I型、III型膠原陽性表達增加，角質形成細胞分泌角蛋白19陽性率明顯高於對照組。
抗炎誘導液中中藥提取液的製備當歸10g、生地20g、龜板10g、血餘10g、象皮15g、爐甘石15g，加入潔淨水100～2000ml，浸泡1～5小時；100℃加熱浸煮30～120分鐘或微波爐提取10～60分鐘。將獲取的中藥提取液進行活性炭脫色，水浴60℃～90℃濃縮，收集濃縮液10～200ml。
將原代和傳代增殖的細胞用微量注射器接種於感染性皮膚缺損，要求創面肉芽組織紅活，接種角質形成細胞與成纖維細胞比例1∶5～1∶15，接種密度為1×102～1×104/cm2。細胞接種後暴露創面10～30分鐘，用中藥提取液中藥材製成的軟膏覆蓋創面，加壓包紮。24～48小時後打開傷口換藥(無需無菌換藥)，3～7天後創面出現皮島雛形(晶瑩的亮點)，亮點逐漸加大變白色—即皮島形成，皮島間相互連接完成上皮化，至創面癒合。
動物實驗研究選用窩1月齡大耳白兔，取其中一隻，常規去毛並無菌消毒皮膚，切取刃厚皮膚2×2cm，放入含有青黴素10U/ml，鏈黴素10μg/ml的Hank｀s液中，洗滌三次。將皮膚剪成1×3mm大小，按照二步酶消化法獲取角質形成細胞和成纖維細胞，將兩種細胞按照1∶5～1∶15接種於含有50～90％MEM基礎培養液基，5～40％胎牛血清和0.5～10％中藥提取液的條件培養液中培養，製備成細胞懸液，細胞數1×104～1×106/ml。將同窩另外3隻大耳白兔，常規去毛，消毒皮膚，製作直徑3cm的圓型創面，去除皮膚和皮下結締組織，深至肌層，放置15億/ml金黃色葡萄球菌1ml浸漬的紗布，包紮傷口。24～72小時後0.9％Nacl溶液清潔創面，待創面乾燥後，接種皮膚細胞1×104～1×106/ml 100μl，覆蓋中藥提取液藥材製備的藥膏，包紮傷口，以後隔日換藥1次，無需無菌操作，接種抗炎活性細胞的創面，其肉芽組織紅活，皮島形成，上皮化過程加速，最終提高創面癒合率。
臨床實驗研究外傷感染造成的下肢21cm×8cm皮膚缺損，創面嚴重感染，換去腐生肌中藥去除壞死組織後，常規無菌條件下取對側刃厚皮膚2cm×3cm，放入含有青黴素10U/ml，鏈黴素10μg/ml的Hank｀s液中，清洗三次，在無菌條件下，將皮膚修剪成1×3mm大小，按照二步酶消化法獲取角質形成細胞和成纖維細胞，將兩種細胞按照1∶5～1∶15接種於含有50～90％MEM基礎培養液基，5～40％胎牛血清和0.5～10％中藥提取液中培養。細胞數配製為1×104～1×104/ml，原代細胞直接種植在感染創面，接種密度1×102～1×104/cm2，接種10～30分鐘後，用中藥提取液藥材製備的藥膏敷於創面，包紮傷口，隔日換中藥膏，不需無菌操作。抗炎活性細胞在感染創面成活，4～7天出現晶瑩透明的皮島雛形，以後逐漸增大，無數皮島相互連接，最後完成創面癒合，創面癒合速度明顯增快，癒合皮膚均質，顏色相同，瘢痕鬆軟，肢體的功能良好。
權利要求
1.一種具有抗炎活性的皮膚細胞，其特徵在於該細胞具有抗炎活性和功能活性表達，抗炎誘導液中原代細胞濃度為1×104～1×106/ml；傳代細胞培養細胞濃度為1×104～1×105/ml。
2.一種具有抗炎活性的皮膚細胞的製備方法，其特徵在於a.二步酶消化法分離皮膚，獲得表皮細胞和成纖維細胞，將兩種細胞以1∶5～1∶15的比例，在37℃ ，5％CO2條件下共培養，獲得角質形成細胞的單細胞懸液和成纖維細胞的單細胞懸液；b.角質形成細胞的單細胞懸液和成纖維細胞的單細胞懸液在其成分包括MEM基礎培養液50～90％，胎牛血清5～40％，中藥提取液0.5～10％的抗炎誘導液中配製成細胞濃度為1×104～1×106/ml的細胞懸液，用作原代細胞；c.再以細胞濃度為1×104～1×105/ml的原代細胞接種在培養瓶中，在37℃，5％CO2條件下傳代培養，使細胞在抗炎誘導液的環境下，大量增殖為具有抗炎活性的皮膚細胞，使皮膚細胞具有抗炎活性和功能活性。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於中藥提取液，包括當歸2～20g、生地4～40g、龜板2～20g、血餘2～20g、象皮3～30g、爐甘石3～30g，加潔淨水100～2000ml，浸泡1～5小時；100℃加熱浸煮30～120分鐘，或微波提取10～60分鐘。將獲取的中藥提取液進行活性炭脫色，水浴60～90℃濃縮，收集濃縮液10～200ml。
4.一種具有抗炎活性的皮膚細胞在皮膚感染創面中的應用，其特徵在於將原代細胞和具有抗炎活性的皮膚細胞接種於實驗動物和臨床感染創面，細胞接種密度為1×102～1×104/cm2，細胞在抗炎誘導液的環境裡，可在感染創面成活，促進皮島生成，加速創面癒合。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗炎活性的皮膚細胞及其製備方法和該細胞在皮膚感染創面中的應用，屬於來源於皮膚的醫用配置品。採用二步酶消化法對人體或實驗動物中獲取的皮膚進行分離，分離後的表皮細胞和成纖維細胞在含有包括MEM基礎培養液50～90％，胎牛血清5～40％，中藥提取液0.5～10％的抗炎誘導液中進行共培養，細胞濃度為1×10
文檔編號A61P17/02GK1676602SQ20041001882
公開日2005年10月5日 申請日期2004年4月2日 優先權日2004年4月2日
發明者李秀蘭, 白仁驍, 張楊, 師宜健, 靜藹晨 申請人:天津市天津醫院