使用重組植物懸浮培養物製備疫苗主細胞系的製作方法

2023-05-01 17:24:06 2

專利名稱：使用重組植物懸浮培養物製備疫苗主細胞系的製作方法
技術領域：
本申請一般地涉及植物細胞培養和在植物細胞培養物中生產蛋白質的領域。具體地，本發明涉及能夠生產多種可以用作治療劑和疫苗的簡單和複雜蛋白質的通用生產系統和植物細胞系。

背景技術：
重組DNA技術已經在包括疫苗的藥物和獸藥的安全性、質量、功效和費用方面提供了實質性的改善。Curtiss & Cardineau發明了植物生產的黏膜疫苗。參見U.S.專利號5,654,184；5,679,880和5,686,079，通過引用的方式合併入本申請。其它人公開了表達免疫保護性抗原的轉基因植物和生產方法，包括Arntzen，Mason和Lam。參見U.S.專利號5,484,717；5,914,123；6,034,298；6,136,320；6,194,560和6,395,964，通過引用的方式將其整體合併入本申請。
通過在確定成分培養基中進行細胞培養的植物細胞生產避免了在生長培養基中對動物來源組分的需要，從而基本上消除了傳播來自生產過程的致病性汙染物的風險。植物細胞能夠進行翻譯後糖基化，並且通常植物細胞生長培養基比目前疫苗生產中使用的常規生長培養基便宜、容易操作和製備。
在植物系統中生產疫苗抗原和具有藥學的或者相關的生物活性的蛋白質呈現出超過常規生產系統的許多優勢。衍生自植物的亞單元蛋白質不能回復毒力(常規或者重組生產的活載體疫苗的特徵)。從常規製備方法生產的亞單位蛋白質由於蛋白質的不穩定性和生物化學提取問題而可能是生產和純化困難的，並且當在原核生物中生產時要求糖基化的亞單位疫苗組分將不能被糖基化。
植物提供了獨特的益處，該益處很難從任何一個常規的或者哺乳動物來源的重組DNA系統中獲得。常規地，亞單位疫苗或者蛋白質活性劑(proteinaceous agents)1)由於低產率的原因而難於從重組或者常規來源純化，從而使得它們的生產受阻；2)由於純化過程中的蛋白酶水解、pH或者使用的溶劑而是不穩定的；3)由於是非天然的，或者由於純化過程引起關鍵表位變性，故具有較低的有效性；和4)當在哺乳動物系統中生產時受到外來的生物學來源材料的妨礙(如上提及的) 用於生物藥生產的「主細胞系」原理(「master cell line」principle)，利用活生物體作為生產過程的一部分，並依賴於一些基本的原則1)具有確定來源和傳代歷史的單一培養物，以確定的細胞表型特徵和所期望的生產特徵被保存；2)保存，典型的深低溫保存是持久的(跨越幾年或者更長)；3)細胞可以被恢復、擴增、無限地傳代為「工作種子」(working seed)，並可以接受另一個時期的深低溫保存(要求細胞強壯的原則)；和4)在確定次數的傳代之後，細胞不丟失在最開始的冷藏之前所存在的確定的細胞表型特徵和所期望的生產特性。
因此，本領域需要在主種子(master seed)原理下能夠長期生長、反覆深低溫保存和穩定地生物生產靶組分的植物細胞和植物細胞培養物。


發明內容
本發明提供適於按照法規和GMP製造標準(優良製造標準)生產蛋白質活性劑的植物細胞培養物和培養和儲存植物細胞的方法。在本發明的某些方面，轉基因細胞培養物用於表達在疫苗及工業的、醫藥的和藥學的製劑中有用的簡單或者複雜的生物藥物蛋白質和肽活性劑。本發明的其它方面提供由植物細胞生產的疫苗的生產系統。而且，本文所述的植物主細胞系展現出足以符合監管要求的穩定性和強壯性。
附圖簡要說明

圖1A和1B(SEQ ID NOs1和2)顯示NDV株「Lasota」的HN基因的植物優化的編碼序列和蛋白質序列。
圖2顯示含有由組成型CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)啟動子驅動，並且由MAS 3』(甘露氨酸合酶)元件終止的植物選擇標記PAT(膦絲菌素乙醯轉移酶)的pBBV-PHAS-iaaH的圖譜。來自土壤桿菌屬(Agrobacterium)生物的LB和RB(左和右T-DNA邊界)元件確定出待整合入植物基因組的DNA的邊界。
圖3顯示pC！H的圖譜，pC！H是「模板載體」，其用作多種用於表達免疫保護性抗原的植物表達載體的起始質粒。
圖4顯示用於表達NDV HN蛋白的pCHN表達載體的圖譜。HN表達載體或者表達盒由組成型CsVMV啟動子驅動並由大豆vspB 3』元件終止。
圖5顯示用於表達NDV HN蛋白的pgHN表達載體的圖譜。HN表達盒由具有TEV 5』UTR的塊莖特異性GBSS啟動子驅動並且由大豆vspB 3』元件終止。
圖6顯示用於NDV HN蛋白表達的pgHN151表達載體的圖譜。HN表達盒由塊莖特異性GBSS啟動子及其天然5』UTR和內含子驅動，並由大豆vspB 3』元件終止。該載體衍生自pBBV-PHAS-iaaH，含有由CsVMV啟動子驅動，並且由MAS 3』元件終止的植物選擇標記PAT。LB和RB(左和右T-DNA邊界元件)確定待整合入植物基因組的DNA的邊界。
圖7顯示用於NDV HN蛋白表達的pgHN153表達載體的圖譜。HN表達盒由塊莖特異性GBSS啟動子及其天然5』UTR和內含子驅動，並由菜豆的菜豆蛋白3』元件終止。該載體衍生自含有由CsVMV啟動子驅動並且由MAS 3』元件終止的植物選擇標記PAT的pBBV-PHAS-iaaH。LB和RB(左和右T-DNA邊界元件)確定出待整合入植物基因組的DNA的邊界。
圖8顯示表達NDV HN蛋白的pMHN表達載體的圖譜。HN表達盒由組成型4OCSΔMAS啟動子(P2方向)驅動，並由大豆vspB 3』元件終止。該載體衍生自含有由CsVMV啟動子驅動並且由MAS 3』元件終止的植物選擇標記PAT的pBBV-PHAS-iaaH。LB和RB(左和右T-DNA邊界元件)確定出待整合入植物基因組的DNA的邊界。
圖9顯示用於AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的pCHA表達載體的圖譜。
圖10顯示AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白質序列(SEQ ID NOs3和4)。
圖11顯示pGLTB中間載體的圖譜。
圖12顯示pCLT105中間載體的圖譜。
圖13顯示編碼VP2的二元載體pDAB2423。
圖14顯示傳染性法氏囊病(IBD)病毒(IBDV)超強毒株Ehime 91的VP2基因的DNA序列(SEQ ID NO10)。
序列簡述 圖1A和1B中顯示的SEQ ID NOS1和2是NDV株「Lasota」的HN基因的植物優化的編碼序列和蛋白質序列。
圖10中顯示的SEQ ID NOS3和4是AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白質序列。
SEQ ID NO5是用於末端剪裁(end-tailor)pCP！H上的CsVMV啟動子的PCR引物。
SEQ ID NO6是用於末端剪裁pCP！H上的CsVMV啟動子的PCR引物。
SEQ ID NO7是用於產生Nco I位點的誘變引物。
SEQ ID NO8是互補於5』區的正向引物。
SEQ ID NO9是用於產生XhoI I位點的誘變引物。
顯示於圖14中的SEQ ID NO10是傳染性法氏囊病病毒的VP2基因的DNA序列。
SEQ ID NO11是編碼E/91 VP2變異的植物優化的DNA序列(1425個鹼基)。E/91VP2的植物優化的編碼區包含鹼基第16至1383位(1371個鹼基)。在鹼基1384至1425位發現六個讀框終止。
SEQ ID NO12包含由E/91 VP2編碼區的植物優化的序列(SEQ IDNO11)編碼的E/91 VP2蛋白的序列。
SEQ ID NO13是在六個讀框中編碼翻譯終止(「終止」)密碼子的DNA序列。該序列用於終止在轉化過程中DNA整合後無意發生的開放閱讀框翻譯，並且包括SacI，BstE II和Bgl II限制性酶識別位點(TsukamotoK.，Kojima，C.，Komori，Y.，Tanimura，N.，Mase，M.，和Yamaguchi，S.(1999)，使用表達IBDV VP2的重組MDV可以給予雞抵抗超強毒性的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)和馬立克氏病病毒(MDV)的保護作用(Protection of chickens against very virulent infectious bursal diseasevirus(IBDV)and Marek’s disease virus(MDV)with a recombinant MDVexpressing IBDV VP2)，Virol.257352-362)。
發明詳述 本發明的某些方面提供用於生產蛋白質活性劑的植物細胞培養物，其包括表達編碼蛋白質活性劑的轉基因的穩定轉化的植物細胞系，和生長培養基，其中所述培養基支持所述植物細胞培養物的生長，但是不支持支原體科生物(Mycoplasmataceae)的生長，並且不包含動物來源的材料。該植物細胞系能夠連續傳代以致可以在傳代期間維持一致的轉基因表達，並且能夠被深低溫保存以致一旦從深低溫保存恢復後可以恢復一致的轉基因表達。
本發明的其它方面提供生產蛋白質疫苗或者治療劑的植物細胞培養物，其具有下述一個或者多個特徵a)在培養性培養基/生長培養基中缺少動物產品；b)無可檢測水平的植物次生代謝物(例如菸鹼代謝物)；或者c)無可檢測水平的支原體、病毒、細菌或者真菌。因此，本發明提供的植物細胞培養物可以具有本段落中列出的特徵中的任何之一、之二或者全部三個(例如特徵a)；或者特徵b)或者特徵c)；或者特徵a)和b)；或者特徵a)和c)；或者特徵b)和c)；或者特徵a)和b)和c))。
本發明還提供了基於穩定轉化的植物的疫苗生產系統，該系統包括下述一個或者多個特徵a)可以選擇和建立表達蛋白質活性劑的重組植物細胞培養物主細胞系，該細胞系可以被永久保存，並且可以作為所有其它傳代細胞(衍生出所有其它的種子和傳代細胞)的來源；b)能夠創建工作種子(即，衍生自主細胞系並且可以被用於製備生產種子的保存源)和生產種子(即，處於特定範圍的傳代水平上的重組細胞，其不經進一步的增殖而用於起始由植物製造的蛋白質活性劑的生產)；c)在缺少(不使用)動物來源產品(例如哺乳動物(如馬、胎牛等等)來源的血清)的生物反應器中，通過生長穩定轉化的植物細胞而可以生產蛋白質活性劑；d)對於經皮、肌內、鼻內或者口服遞送而向動物進行的施用是安全的；e)沒有可檢測水平的植物次生代謝物(例如多環芳烴和亞硝胺，包括新菸草鹼、新菸鹼、苯並芘、菸鹼和去甲菸鹼)；f)無支原體、病毒、真菌或者細菌；g)可以生產蛋白質活性劑或者疫苗，其中所述蛋白質活性劑或疫苗在環境條件、冷藏或者冷凍條件下，作為凍乾粉末可以長期穩定，該期限多達幾年，優選1至10年，並且更優選1至5年；h)經組配(assembled)的蛋白質活性劑(疫苗)(例如，與佐劑組合的疫苗抗原或者蛋白質活性劑)在冷藏條件下可以幾個月穩定；i)該系統可以用於在容器條件(containedconditions)下可以實施並且不需要再生可育植物的方法中；j)該系統提供可以以高恢復率融解的主細胞系(例如恢復率達到100％，或者恢復率至少為或者大於90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％恢復)；k)使得可以自深低溫保存的主細胞系製備和恢復具有高恢復率的深低溫保存的工作種子(例如恢復率達到100％，或者恢復率至少為或者大於90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％恢復)；l)獲得的蛋白質活性劑或者疫苗可以被配製為常規疫苗組配物(assemblies)(蛋白質活性劑/疫苗與已知佐劑組合)，或者被配製為新疫苗組配物(例如，cell pastes)，並可以施用以在接種個體中提供血清學轉化和/或抗疾病保護作用；m)可以提供常規或者新的疫苗製劑，該製劑具有低於針對家畜或家禽業已建立的耐受水平的2，4-D水平；n)可按比例放大到商業生產過程(例如系統或者細胞可以在從搖瓶至生物反應器的容器中培養，生物反應器的範圍是10升至100,000升，優選100升至1,000或5,000或10,000升)；o)產生穩定轉化的植物細胞系；和/或p)可以用於製備主參考和工作參考(即，其效力在宿主動物中被直接或者間接地相關的參考材料(例如細胞因子的生物活性或者疫苗抗原的抗原性/免疫原性)。本發明的某些方面提供具有所有上述特徵的由植物製備的疫苗生產系統。
如本文使用的，術語「無可檢測水平」的次生代謝物應理解為指使用標準的技術(例如GC/MS和LC/MS技術)不能檢測到被測的物質。這些技術的檢測限為100ng/ml。術語「無支原體、病毒、真菌和細菌」指通過例如本文實施例5中公開的生物學測試法，確定無這樣的生物體存在。
家禽的2，4-D耐受水平對於由防止鳥類疾病病毒而進行的免疫接種所引起的2，4-D殘留，保守估計是目前EPA在卵中建立的2，4-D耐受量的無關緊要的0.007％。目前，EPA在家禽中建立的2，4-D耐受量是0.05mg/kg或50μg/kg。對於由防止鳥類病毒而進行的免疫接種所引起的2，4-D殘留，保守估計是目前EPA在家禽組織中建立的2，4-D耐受量的無關緊要的0.00079％。
術語「穩定轉化」，「穩定轉化的植物細胞系」或者「基於穩定轉化的植物的疫苗生產系統」或者「一致的轉基因表達」指植物細胞系或者基於植物的疫苗生產系統可以持續一百多代旺盛地生長和生產生物學和免疫學活性抗原，並且任選地，如基於遺傳分析(例如Southern印跡、PCR或AFLP)證明的，含有不隨時間和傳代次數而改變的重組插入物(遺傳事件)，從而導致表型生長率或者轉基因表達水平無顯著改變。
本申請所述植物細胞培養物可以包括衍生自低等植物、雙子葉植物或者單子葉植物的轉化的植物細胞系。可以產生轉化細胞系的雙子葉植物的非限制性實例是西紅柿(tomato)、馬鈴薯(potato)、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、豆科植物(legumes)(包括苜蓿(alfalfa)和大豆(soybean))、胡蘿蔔(carrot)、草莓(strawberry)、萵苣(lettuce)、櫟(oak)、槭樹(maple)、胡桃(walnut)、玫瑰(rose)、薄荷(mint)、向日葵(sunflower)、紅花(safflower)、棉(cotton)、菸草(tabacco)、南瓜(squash)、雛菊(daisy)、Canola或者仙人掌(cactus)。本發明的某些方面使用菸草細胞系，例如NT-1或BY-2。當自單子葉植物產生轉化的植物細胞系時，例如，小麥(wheat)、草(turf)，草坪草(turf grass)、穀類(cereal)、玉米(maize)或玉蜀黍(corn)、稻(rice)、燕麥(oat)、小麥、大麥(barley)、高粱(sorghum)、蘭(orchid)、鳶尾(iris)、百合(lily)、洋蔥(onion)、香蕉(banana)、甘蔗(sugarcane)、高粱或者棕櫚(palm)等植物可以被用於建立該植物細胞系。另外，可以從低等植物建立細胞系，低等植物例如是羊齒植物(ferns)、裸子植物(gymnosperms)、針葉樹(conifers)、木賊類植物(horestails)、石松類(club mosses)、苔類植物(liverwarts)、角苔類植物(hornworts)、苔蘚類(mosses)、紅藻類(red algaes)、褐藻類(brown algaes)、蕨類植物(pteridophytes)的配子體、孢子體或者綠藻類(green algaes)。本發明中使用的植物細胞培養物優選為衍生自玉蜀黍、稻或者菸草植物的植物細胞培養物。
蛋白質藥物或者疫苗活性劑包括，但不限於酶、毒素、細胞受體、配體、病毒或者細菌蛋白質或者抗原、信號轉導物、細胞因子或者其它在轉基因植物細胞培養物中表達的治療蛋白質。編碼這些蛋白質藥物或者疫苗活性劑的多核苷酸序列可以從商業資料庫(例如EMBL、SWISSPROT或NCBI資料庫)獲得。蛋白質活性劑也可以是一種或者多種來自特定的致病病毒的蛋白質(抗原)，包括但不限於AIV(禽流感病毒)的HA(血凝素)蛋白，1型糖蛋白；鳥類NDV(新城疫病毒)的HN(血凝素/神經氨酸酶)蛋白，2型糖蛋白(參見U.S.專利號5,310,678，通過引用的方式合併入本申請)；傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的結構蛋白VP2；ADP核糖基轉移酶(大腸桿菌(E.coli.)熱不穩定性毒素的LT-A亞基)；由兩個亞基組成的大腸桿菌細菌毒素LT；人病毒，包括但不限於脊髓灰質炎病毒、人鼻病毒(HRV)、A型肝炎病毒(HAV)、免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)，小RNA病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)，黃病毒例如登革病毒和西尼羅病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。典型地，在轉基因植物細胞培養物中生產的蛋白質活性劑在功能或者結構活性方面等同於分離自天然來源的相同蛋白質。在SEQ IDNOs1、2、3、4、11和12中也列出了病毒抗原的非限制性實例。
免疫接種定義為通過使用含有蛋白質活性劑的免疫原性製劑接種宿主而提供抗病原體的保護作用或者誘導血清轉變(例如抗體生成)的手段，其中所述接種導致宿主的免疫系統被刺激，並且防止或者減輕隨後的有害病變(與宿主對隨後暴露於該病原體的反應相關)。
疫苗是用於免疫接種動物(包括人)的組合物，其含有至少一種蛋白質活性劑，該蛋白質活性劑可以誘導對宿主免疫系統的刺激，並且，防止或者減輕之後的有害病變(與宿主對隨後暴露於該病原體的免疫保護性抗原物的反應相關)。
致病生物是在其感染的動物或宿主中引起疾病或者引起誘導的/受控的生理情況的細菌、病毒、真菌或者原生動物。
基於本發明的目的，佐劑是加強、增加、調節或者增強對免疫原或者抗原的免疫應答的物質。典型地，佐劑增強體液和細胞免疫應答兩者，但是增加其中任一種應答但不增加另一種應答的物質也定義為佐劑。而且，佐劑及其用途對於免疫學家而言是熟知的，並且典型地，當免疫原的劑量有限時，當免疫原具有差的免疫原性時或者當給藥途徑不是最佳時，佐劑被用於增強免疫應答。因此，術語「佐劑量(adjuvating amount)」是能夠增強對給定免疫原或者抗原的免疫應答的佐劑的量。等於「佐劑量」的量將是變化的並且取決於許多因素，包括但不限於，免疫原的特性、施用的免疫原的數量、宿主物種、給藥途徑以及施用免疫原的方案。假定一組特定的環境條件，「佐劑量」可以通過常規實驗而容易地確定。這是本領域普通技術人員能力所及之事，並且典型地通過針對施用的變化量的免疫原和佐劑進行常規的劑量反應測定來實現。所述反應可以通過使用酶聯免疫吸附試驗、放射性免疫試驗、血細胞凝集試驗等等，確定抗該免疫原的血清抗體效價或者細胞介導的應答而測量。
有效劑量是在人或者動物中誘導如下免疫應答所必需的量，其中所述免疫應答足以使得該人或者動物有效地抵抗病原體發動的攻擊或者響應動物的生理需求(例如針對糖尿病的自身免疫抗原)。向這樣的人或者動物施用的劑量將由醫師、獸醫或者受過訓練的科學工作者考慮相關條件而確定，所述的相關條件包括具體的免疫保護性顆粒或者顆粒的組合、人或者動物的狀況以及選擇的施用途徑。一般地，有效劑量的範圍為大約1ng至大約0.5mg，優選大約1μg至大約50μg。對於新城疫病毒(HN抗原)，在家禽中通過SQ途徑的有效劑量是大約0.5μg至大約50μg，優選大約2.5μg至大約5μg。通過IN/眼黏膜途徑，HN的有效劑量在家禽中是大約0.5μg至大約50μg，優選大約5μg至大約25μg和更優選大約10μg至大約12μg。對於禽流感病毒(HA抗原)，通過IN/眼途徑的有效劑量是大約0.5μg至大約50μg，優選大約1μg至大約30μg，並更優選大約24μg至大約26μg，以及通過SQ途徑的有效劑量優選是大約1μg至大約5μg。對於傳染性法氏囊疾病(VP2抗原)，家禽中通過SQ途徑的有效劑量是0.5μg至大約50μg，優選大約5μg至大約25μg，並更優選大約5μg至大約20μg。對於LT抗原，有效的口服劑量的範圍是大約50ng至大約250ng，優選大約100ng至大約200ng。對於LT抗原，有效的SQ或IN/眼劑量是大約50ng至大約100μg；優選大約1μg至大約50μg，並更優選大約2μg至大約10μg。這裡公開的劑量範圍不欲以任何方式限制本發明的範圍，並且作為本領域技術人員的一般指導而呈現。
本文定義轉基因植物為衍生自轉化的植物細胞或者原生質體的植物細胞培養物、植物細胞系、植物組織培養物、低等植物、單子葉植物細胞培養物、雙子葉植物細胞培養物或者其後代，其中轉化的植物的基因組含有由實驗室技術導入的外源DNA，即該DNA最初並不存在於相同物種的天然的、非轉基因植物細胞中。術語「轉基因植物」和「轉化的植物」在本領域中有時被用作同義詞，定義為其DNA含有外源DNA分子的植物。
用於轉化植物或者轉化植物細胞培養物的基因盒的構建可以通過使用熟知的方法容易地完成，所述的方法例如在Sambrook等人(1989)和Ausubel等人，(1987)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York，NY中描述的那些。本發明還包括與公開的編碼免疫保護性抗原或者蛋白質活性劑的序列有實質的序列同源性的DNA序列，所述同源性使得所述DNA序列在表達後能夠具有公開的效果。如在本申請中使用的，術語「實質的序列同源性」用於指核苷酸序列(DNA或者RNA)或者胺基酸序列(蛋白質或者多肽)與另一個核苷酸序列或者胺基酸序列表現出實質的、功能或者結構上的等價性。在具有實質的序列同源性的兩個序列之間，任何的功能或者結構差異是微小的，即這些差別將不影響序列發揮本申請指出的功能的能力。具有與本文公開的序列有實質的序列同源性的序列通常是該公開序列的變體，例如突變體，但是也可以是合成的序列。
在大多數的情況下，與本文具體公開的序列有95％的同源性的序列將作為等價物發揮功能，並且在許多情況下，顯著較低的同源性，例如75％或80％，也是可以接受的。定位這些序列中的非關鍵部分可能是耗時的，但是卻是常規的，並且是本領域技術人員所掌握的。用於修飾多核苷酸序列的技術的實例包括使用寡核苷酸介導的定點誘變。參見Zoller等人(1984)；Higuchi等人(1988)；Ho等人(1989)；Horton等人(1989)和PCR TechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，(編輯)Erlich(1989)。
在製備用於本發明的構建體時，可以操作多個DNA片段，以提供具有正確方向並且視情況而定於正確讀碼框中的DNA序列。可以使用連接物或者接頭來連接這些DNA片段，或者可以通過其它操作以提供方便的限制性位點、移除多餘的DNA、移除限制性位點等等。
在實施多個步驟時，可以通過克隆以擴增含有用於隨後導入期望宿主細胞的目的啟動子/基因的載體。可以獲得大量的克隆載體，該克隆載體包括在大腸桿菌中有功能的複製系統，和供選擇轉化的細胞所用的標記。示例性載體包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等等。因此，可以將序列在合適的限制性位點插入載體，獲得的質粒用於轉化大腸桿菌宿主(例如大腸桿菌菌株HB101、JM101和DH5α)，該大腸桿菌在合適的營養培養基上生長，以及收穫和裂解細胞，並回收質粒。分析可以涉及序列分析、限制性分析、電泳或者等等。在每次操作之後，用於最終構建體的DNA序列可以被限制性酶切並連接到下一個序列上，其中每個部分構建體可以被克隆入相同或者不同的質粒。
可以獲得或者可以容易地製備用於轉化植物細胞的載體。一般地，質粒或者病毒載體應該含有對於在給定的宿主中維持和表達異源DNA序列兩者所必需的所有DNA調控序列。這樣的調控序列一般地包括引導序列和編碼翻譯起始信號密碼子、翻譯終止密碼子的DNA序列，和編碼調控信使RNA加工的3』UTR信號的DNA序列。根據本申請公開的教導，本領域普通技術人員將能夠選擇合適的元件以優化在任何特定的物種中的表達。最後，載體應該如所期望的含有能夠提供表型特徵的標記基因，其中該表型可以允許鑑定含有該載體的宿主細胞。
插入植物細胞的外源編碼序列(例如，免疫保護劑或者蛋白質活性劑)的活性依賴於鄰近該插入物的內源植物DNA的影響。一般地，使用任何的轉化技術，異源基因的插入似乎是隨機的，但是，目前存在用於將DNA定點重組入植物細胞的植物生產技術(參見，WO91/09957)。導致所需要的序列在啟動子控制下表達的任何方法或者方法的組合都是可以接受的。
本申請提供的植物細胞培養物不受任何特定的用於轉化植物細胞的方法的限制。將DNA導入植物細胞的技術是本領域技術人員熟知的。已經公開了四種用於將外源DNA遞送入植物細胞的基本方法。化學方法(Graham和van der Eb，Virology，54(02)536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660136-153，1992)；物理方法包括顯微注射(Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2)584-587，1982；Fromm，Taylor，Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985；U.S.專利號5,384,253)和基因槍(Johnston和Tang，Methods Cell.Biol.，43(A)353-365，1994；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24)11478-11482，1993)；病毒方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，J.Exp.Med.178(6)2089-2096，1993；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，Avd.Exp.Med.Biol.，24119-27，1988)和受體介導的方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)8850-8854，1991；Curiel，Wagner，Cotten，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)6099-6103，1992)。
將DNA通過電穿孔的方法導入植物細胞是本領域技術人員熟知的。使用植物細胞壁降解酶(例如果膠降解酶)，以提供比未處理的細胞對電穿孔轉化更敏感的受體細胞。為了使用電穿孔有效轉化，可以直接使用鬆散的組織例如細胞的懸浮培養物，或者胚發生愈傷組織、或者未成熟胚或者其它有組織的組織。通常，以控制的方式使用果膠降解酶或者機械損傷方法部分地降解靶植物材料的細胞壁是必要的。這樣處理的植物材料容易通過電穿孔接受外源DNA。
另一種用於遞送外源轉化DNA到植物細胞的方法是通過微粒轟擊。在這個方法中，微粒上包被外源DNA並通過推力而被遞送入細胞中。這樣的微粒典型地由鎢、金、鉑和相似的金屬製成。微粒轟擊的優勢是不需要分離原生質體(Cristou等人，1988，Plant Physiol.，87671-674，)也不需要對農桿菌感染具有易感性。通過加速作用將DNA遞送入玉米細胞的方法的一個實例性實施方案是生物射彈粒子遞送系統(Biolistics ParticleDelivery System)，通過其可以將包被有DNA或者細胞的微粒推過濾膜表面上方的屏，而在該濾膜表面上覆蓋有懸浮培養的玉米細胞。該屏使微粒分散，從而使得其不以大的聚集物的形式遞送到受體細胞。對於轟擊，懸浮的細胞優選在濾膜或者固體培養基上濃縮。作為選擇，可以將未成熟胚或者其它靶細胞安排在固體培養基上。將待被轟擊的細胞放置在微粒停止板下方的合適距離處。在轟擊轉化中，可以優化轟擊前培養條件和轟擊參數，以產生最大數目的穩定轉化體。在這個技術中，轟擊的物理和生物學參數都是重要的。物理因素是涉及操作DNA/微粒沉澱的那些因素或者是影響微粒的飛行或速率的那些因素。生物學因素包括涉及在轟擊前和緊接轟擊後操作細胞的所有步驟，調整靶細胞的滲透性以幫助緩解與轟擊相關的創傷，以及轉化DNA的性質(例如線性化的DNA或者完整的超螺旋質粒)。
農桿菌介導的轉移是用於將外源DNA導入植物細胞的廣泛適用的系統，因為該DNA可以被導入完整的植物組織，從而不需要從原生質體再生完整的植物。使用農桿菌介導的植物整合載體將DNA導入植物細胞在本領域是熟知的。參見，例如在Fraley等人，1985，Biotechnology，3629；Rogers等人，1987，Meth.in Enzymol.，153253-277中公開的方法。另外，Ti-DNA的整合是幾乎不導致重排的相對精確的方法。待轉移的DNA的區域由邊界序列確定，並且間插DNA通常被插入到植物基因組中，如Spielmann等人，1986，Mol.Gen.Genet.，20534；Jorgensen等人，1987，Mol.Gen.Genet.，207471所公開的。
現在的農桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌中複製，使得可以方便地操作。而且，最近在用於農桿菌介導的基因轉移的載體上的技術進步，改良了基因和限制性位點在載體中的排列，從而有助於能夠表達多種蛋白質或者多肽的載體的構建。側翼為(用於指導插入的多肽編碼基因表達的)啟動子和多腺苷酸化位點的、方便的多接頭區適用於本發明的目的。另外，含有帶甲和卸甲Ti基因的農桿菌可以被用於轉化。
通過基於磷酸鈣沉澱、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法可以實現植物原生質體的轉化(參見，例如Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199183；Marcotte等人，Nature，335454，1988)。這些系統在不同的植物物種中的適用性取決於從原生質體再生該特定物種的能力。
對於本發明的實踐，優選轉化可以培養和迅速擴大的植物細胞系。使用植物細胞培養物避免了開場生產並且極大地降低了基因逃逸和食品汙染的機會。優選例如NT-1和BY-2的菸草懸浮細胞培養物(Kato等人1972，Proc.IV IFSFerment.Technol.Today 689-695；An，G.，1985，PlantPhysiol.79，568-570；Nagata等人1992，International Review of Cytology132，1-30)，因為這些細胞系尤其易於接受培養操作，並且容易轉化、產生穩定整合的事件，並且適於深低溫保存。
菸草懸浮細胞系NT-1適用於本發明的實踐。NT-1細胞最初開發自菸草栽培品種(Nicotiana tabacum L.cv.)Bright Yellow 2。NT-1細胞系廣泛使用並且容易獲得，但是，任何的菸草懸浮細胞系都可用於本發明的實踐。而且，細胞系是可變的並將響應培養條件而改變。適合用於下述實施例的NT-1細胞可獲得自美國典型培養物保藏中心，保藏號ATCC No.74840。也參見U.S.專利號6,140,075，通過引用的方式將其整體合併入本申請。
已經公開了許多植物細胞培養技術和系統，從實驗室規模的搖瓶到幾千升的生物反應器，並且它們是植物細胞培養領域所熟知的。例如參見Fischer，R.等人，1999 Biotechnol.Appl.Biochem.30，109-112和Doran，P.，2000 Current Opinions in Biotechnology 11，199-204。在將轉化的植物細胞培養到所需要的質量後，收穫植物細胞，溫和的洗滌並放置於用於破裂細胞的合適的緩衝液中。許多不同的緩衝液適用於本發明。一般地，緩衝液是不含有可用於溶解膜的苛刻去汙劑的、具有中性pH值或者接近中性pH值的水性等滲緩衝鹽溶液。優選的緩衝液包括Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水和含有1mM EDTA的PBS。
在製備穩定轉化的植物細胞系之後，通過證實基因插入物(遺傳事件)，可以完成本發明的培養物，其中該證實可以使用PCR擴增整個基因插入物，並隨後進行限制性酶消化而完成。然後根據9 CFR 113.26中列出的程序，評估主細胞系和工作細胞系的細菌和真菌汙染。
主或者工作細胞最初可以在瓊脂板上以愈傷組織的形式回收。隨後可以將其轉移到液體懸浮培養中。針對工作細胞和生產培養物的傳代可以是1-50或者100次。
動物來源的成分不用於培養本發明的植物細胞培養物。用於瓊脂板和懸浮培養的培養基基於普通的植物培養基(Murashige和Skoog；MS)，並且在本申請中詳細公開。主細胞系儲存在液氮的氣相中。以這種方式維持的培養物可以無限期地儲存，並且可以被用於在瓊脂培養基上製備愈傷組織培養物。工作細胞系儲存在液氮的氣相中，並可以無限期地儲存和用於製備愈傷組織培養物。
用作生產工作細胞或者疫苗的接種物的主細胞和工作細胞培養物可以通過在瓊脂平板上周期循環愈傷組織而維持，或者可以以懸浮培養物形式進行培養。可以將冷凍的主細胞或者工作細胞融化並傳至瓊脂平板上，在25℃持續大約一至兩周傳代培養一或多次。然後挑開愈傷組織並用於接種液體懸浮培養基的搖瓶，以產生工作細胞或者生產培養物。用作生產培養物的接種物的工作細胞培養物在室溫生長，其間持續攪拌，並在液體懸浮培養基中傳代。取決於觀察到的生長程度，大約每3-14天傳代培養物一次，並且可以每次傳代時以1∶3或1∶10分傳。
為了從主細胞瓊脂平板產生工作細胞系，選擇健康的愈傷組織，無菌挑開並將挑開的部分放置入含有液體懸浮培養基的搖瓶中。也可以使用1∶3或1∶10的分傳比，將工作細胞系從液體培養到液體培養進行傳代，同時增加培養物的體積，直到在搖瓶中達到1升的體積。一至三升的搖瓶培養物可以作為接種物轉移到十升的攪拌釜反應器中。生產培養物在具有100升工作體積的攪拌釜反應器中製備。100升的發酵罐可以以1∶10比例接種來自攪拌釜反應器或者多個搖瓶的培養物。在大於10升的攪拌釜反應器中的培養物在沒有篩選試劑的液體懸浮培養基中生長。
針對工作細胞培養物，培養物在室溫在持續攪拌的條件下生長3-14天。在大多數情況下，工作細胞培養物每7天以1∶10的分傳比傳代。在工作細胞按比例擴大期間，培養物以1∶10的分傳比傳代並且生長至少7天。在收穫之前生產培養物生長7-15天。每天觀察培養物的生長特性，定期無菌移出生產培養物的樣品用於顯微鏡觀察和確定收集細胞體積。在收穫的時刻，基於目測評估，細胞的密度應該增加到收集細胞體積(PCV)的大約35％，並且應該含有至少50％的健康活細胞。細胞的顯微鏡檢測應該顯示細胞中可視的細胞核，但是其它細胞結構應觀察不到。
通氣可以基於培養物的氧需求而改變。溶解氧應該被控制在大約100％至20％之間。攪拌的速度可以基於氧需求而改變，但是不應超出500rpm。典型地，不必要控制pH。在接種後7至15天之間，可以通過重力或者真空過濾，使用常規的過濾介質，收穫生產培養物。然後可以使用常規的蛋白質純化方法，以分離藥用的蛋白質物質。
本申請涉及或者引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物，以與本說明書的明確教導相一致的程度，通過引用的方式，整體地(包括所有的附圖和表格)併入本申請。
下文是舉例說明用於實施本發明的方法的實施例。這些實施例不應被解釋為限制本發明。如無另行說明，所有的百分比是重量百分比，並且所有的溶劑混合物的比例是體積比。
實施例1載體 基因構建分析NDV株「Lasota」的HN基因(Genbank檢索號AF077761)、AIV株ATurkey/wisconsin/68的HA基因，IBDV株E19的VP2基因(GenBank檢索號X00493)和大腸桿菌的LT基因的編碼序列的密碼子使用，以及不希望的序列基序(所述基序能夠介導假mRNA加工和不穩定性，或者基因組DNA的甲基化)的存在。參見Adang MJ，BrodyMS，Cardineau G，Eagan N，Roush RT，Shewmaker CK，Jones A，OakesJV，McBride KE(1993)，在原生質體和馬鈴薯植物中構建和表達蘇雲金芽孢桿菌cryIIIA基因，Plant Mol Biol 211131-1145。設計植物優化的編碼序列，該序列具有反映西紅柿和馬鈴薯的密碼子使用的雜合密碼子偏好(Ausubel F.，等人編輯(1994)Current Protocols in Molecular Biology，vol.3，p.A.1C.3 Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)使用在轉基因植物中生產的重組細菌抗原口服免疫，Science 268714-716)。針對HN設計的序列在圖1中顯示。合成的HN基因由商業供應商(Retrogen)組裝，並且在兩個分開的質粒中收到，這兩個質粒各含有克隆入pCR-Blunt中的該基因的5』(p4187-4203-1)半部分或者3』(p42111-4235-1c-1)半部分。
質粒構建用於農桿菌介導的植物轉化的二元載體基於圖2顯示的pBBV-PHAS-iaaH載體進行構建，該圖2所示載體使用植物選擇標記膦絲菌素乙醯轉移酶(PAT)(公開在U.S.專利號5,879,903；5,637,489；5,276,268和5,273,894，其通過引用的方式合併入本申請)，並且該PAT由公開在WO 97/48819中的組成型木薯葉脈花葉病毒啟動子(CsVMV)驅動。我們首先通過使用PacI消化pBBV-PHAS-iaaH而刪除iaaH基因和菜豆蛋白啟動子序列，並且重新連接以形成pCVMV-PAT。然後，我們通過使用Klenow酶填平的方式刪除唯一的HindIII位點，並且重新連接以形成pCP！H。我們通過使用引物CVM-Asc(5′-AtggcGCgccagaaggtaattatccaag，SEQ IDNO5)和CVM-Xho(5′-ATCTCGAGccatggtttggatcca，SEQ ID NO6)在模板pCP！H上進行PCR而對CsVMV啟動子進行末端剪裁，並且將產物克隆入EcoRV消化的、具T尾的pBluescriptKS，以製備pKS-CVM7。pCP！H的圖譜在圖3中顯示。我們通過連接載體pKS-CVM7/NcoI-EcoRI和3個插入片段，即，在NcoI/PstI上的HN 5』半部分、PstI/KpnI上的HN3』半部分和KpnI-EcoRI(Haq 1995)上的大豆vspB 3』元件而構建HN表達盒pKS-CHN。然後通過連接載體pCP！H/AscI-EcoRI和pKS-CHN的AscI-EcoRI片段而組裝二元T-DNA載體pCHN。pCHN的圖譜在圖4中顯示。
我們使用U.S.專利號5,824,798(通過引用的方式合併入本申請)中描述的顆粒結合性澱粉合酶(GBSS)啟動子製備其它的載體。使用擴增自馬鈴薯栽培品種(Solanum tuberosum L.cv.)「Desiree」的基因組DNA的啟動子片段製備這些構建體，該擴增使用自Genbank檢索號X83220中的序列針對中國馬鈴薯栽培品種「Dongnong」設計的引物。使用誘變引物「GSS-Nco」(5』-[tgccatgGtgatgtgtggtctacaa]SEQ ID NO7)，和在-1800bp互補於5』區的正向引物「GSS-1.8F」(5』-[gatctgacaagtcaagaaaattg]SEQ IDNO8)，產生與翻譯起始密碼子重疊的Nco I位點；將該1825bp PCR產物克隆入T尾pBluescriptKS，以製備pKS-GBN並測序。使用誘變引物「GSS-Xho」(5』-[agctcGAGCTGTGTGAGTGAGTG]SEQ ID NO9)，和引物「GSS-1.8F」，產生恰好位於轉錄起始位點3』的XhoI位點；該1550bpPCR產物克隆入T尾pBluescriptKS，以製備pKS-GBX並測序。
通過連接由HindIII/XhoI消化的載體pTH210與pKS-GBX的HindIII/XhoI片段以組裝含有TEV 5』UTR(非翻譯區，在U.S.專利號5,891,665中公開，通過引用的方式合併入本申請)的GBSS啟動子表達盒，其可以實現811bp GBSS啟動子對CaMV 35S啟動子的替代，以製備pTH252A。參見Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)，使用在轉基因植物中生產的重組細菌抗原口服免疫，Science 268714-716。通過連接NcoI/PstI中的HN 5』半部分和PstI/KpnI中的HN 3』半部分而將HN基因插入到pTH252A/NcoI-KpnI，以製備pHN252A。通過連接由NsiI和EcoRI消化的載體pGLTB(圖11顯示)和片段pHN252A/NsiI-KpnI和pTH210/KpnI-EcoRI而製備二元T-DNA載體pgHN。pgHN圖譜在圖5中顯示。
通過連接由HindIII/NcoI消化的載體pTH210(Haq 1995)與pKS-GBN的HindIII/NcoI片段而組裝含有GBSS 5』UTR(在U.S.專利號5,824,798中公開，通過引用的方式合併入本申請)和其內含子的GBSS啟動子表達盒，其可以實現使用1084bp GBSS啟動子/5』-UTR對(花椰菜花葉病毒)CaMV 35S啟動子/TEV 5』UTR的替代，以製備pTH251A。通過連接載體pCLT105(圖12顯示)和片段pTH251A/HindIII-NcoI和pHN252A/NcoI-KpnI而製備二元T-DNA載體pgHN151。 pgHN151的圖譜在圖6中顯示。
構建含有GBSS 5』UTR和其內含子和菜豆的菜豆蛋白3』元件(在U.S.專利號5,270,200；6,184,437；6,320,101中公開，通過引用的方式合併入本申請)的GBSS啟動子表達盒。首先，在單一的KpnI位點消化pCP！H，使用T4 DNA聚合酶平端化，並重新連接以製備pCP！HK，其中的KpnI位點被去除。使用NsiI消化pCP！HK，並且使用T4 DNA聚合酶平端化，然後再使用PacI消化。獲得的載體與SacI消化pgHN151產生的2848bp片段連接，然後使用T4 DNA聚合酶平端化，再使用PacI消化，以製備pgHN153。pgHN153圖譜在圖7中顯示。
使用嵌合組成型啟動子(4OCSΔMAS U.S.專利號5,001,060；5,573,932和5,290,924，通過引用的方式合併入本申請)構建另一個HN的表達載體。質粒pAGM149使用EcoRV消化並使用BamHI部分消化。此片段與使用PmeI/PstI消化的pCHN和通過使用BamHI/PstI消化pKS-CHN而獲得的合成HN基因的5』半部分連接。獲得的pMHN顯示在圖8中。
含有AIV A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的HA基因的質粒從DavidSuarez(SEPRL，Athens，GA)獲得(圖10)。通過PCR對其末端進行剪裁，以在5′加入限制性位點NcoI和在3′加入限制性位點KpnI，並插入到含有35S啟動子、TEV 5′-UTR和vspB 3′末端的載體pIBT210.1(Haq等人，1995)中。通過使用HindIII和EcoRI(不完全)消化而將表達盒轉移到二元載體pGPTV-Kan(Becker等人，Plant Mol Biol 1992；201195-7)，以製備pIBT-HAO。通過使用NcoI和EcoRI(不完全)消化而獲得來自pIBT-HAO的HA基因/vspB3′末端片段，並插入pKS-CVM7以製備pKS-CHA。使用AscI和EcoRI(不完全)消化，從pKS-CHA獲得含有CsVMV啟動子，HA基因和vspB3′末端的表達盒，並與pCP！H連接以製備pCHA，顯示在圖9中。
本領域已知編碼大腸桿菌菌株H10407的LT-B基因的植物優化的序列(Mason HS，Haq TA，Clements JD，Arntzen CJ，1998，Vaccine161336-1343)。編碼大腸桿菌菌株H10407的LT-A基因的植物優化的序列在WO/00/37609中公開，WO/00/37609最初以U.S.臨時申請60/113,507提出，其整體通過引用的方式合併入本申請。WO/00/37609公開了三個二元T-DNA載體(pSLT102，pSLT105、pSLT107)的構建，這些載體在實施例2中用於菸草(Nicotiana tabacum)NT-1細胞的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的植物細胞轉化。獲得的轉化的NT-1細胞系(SLT102、SLT105和SLT107)表達和累積完整組裝的LT和LT類似物(其由LT-B和LT-A亞基的修飾形式組成)。圖12顯示pSLT107，其含有由Arg72替代Ala72的修飾的LT-A基因。除了在LT-A基因中含有不同的改變(在pSLT102中Ser63改變為Lys63；在pSLT105中Arg192改變為Gly192)，SLT102和SLT105表達產物相同。這些細胞系含有未確定拷貝數的穩定整合入核染色體DNA的質粒T-DNA區。如通過神經節苷脂依賴的ELISA確定的，轉基因NT1細胞以高達總可溶性蛋白質0.4％的水平積累LT-B亞基，該亞基組裝為結合神經節苷脂的五聚體。轉基因NT1細胞也積累修飾的LT-A亞基，其中的一些與LT-B五聚體組裝，如通過使用LT-A特異性抗體的神經節苷脂依賴性ELISA所確定的。
由基礎二元載體(pBBV)構建了用於農桿菌介導的植物細胞轉化的二元載體，該pBBV載體在唯一的BamHI位點經修飾而具有用於添加VP2和選擇標記表達盒的AgeI接頭。VP2的側翼是RB7 MAR元件(U.S.專利號5,773,689；U.S.專利5,773,695；U.S.專利號6,239,328，WO 94/07902和WO 97/27207)和CsVMV啟動子，以及根癌農桿菌(Atu)ORF24(GenBank檢索號X00493)3』UTR。選擇標記PAT由擬南芥(Arabidopsisthaliana)(At)泛素10啟動子(Plant J.1997.11(5)1017；Plant Mol.Biol.1993.21(5)895；Genetics，1995，139(2)921)和Atu ORF1(U.S.專利號5428147；Plant Molecular Biology.1983.2335；GenBank檢索號X00493)3』UTR調控；獲得的質粒pDAB2423在圖13中顯示。
基於報導的VP2胺基酸序列(GenBank檢索號AB024076)，以及來自UK661株的胺基酸#454-456(GenBank檢索號NC_004178)，使用傳染性法氏囊病(IBD)病毒超強毒株Ehime 91(J Vet Med Sci.1992.54(1)153；JVI.2002.76(11)5637)產生VP2的植物優化的核苷酸序列。VP2的序列參見圖14。
實施例2製備轉基因菸草 在轉化前的3至4天，通過添加2ml的NT-1培養物到40ml的NT-1培養基中，將1周齡的NT-1培養物亞培養在新鮮的培養基中。將亞培養物在25±1℃，暗處以100rpm在搖床中維持。
NT-1培養基 B1肌醇貯存液(100x)(1升) 鹽酸硫胺素(Vit B1)-0.1g MES(20x)(1升) MES(2-N-嗎啉乙磺酸)-10g 肌醇-10g Miller′s I(1升) KH2PO4-60g 將含有目的表達載體的根癌農桿菌從甘油貯存培養物劃線到含有50mg/l壯觀黴素的LB培養基平板上。將細菌培養物在暗處30℃孵育24至48小時。選擇一個形態良好的菌落並轉移到3ml含有50mg/L壯觀黴素的YM培養基中。液體培養物在暗處，30℃，250rpm的振蕩培養器中孵育，直到OD600達到0.5-0.6。這大約需要24hr。
LB培養基 YM培養基 (備選的，可以購買粉末形式的YM(Gibco BRL；目錄號#10090-011)。為了製備液體培養基，將11.1g加入到1升水中)。
在轉化當天，將1μl的20mM乙醯丁香酮添加入每毫升的NT-1培養基中。在轉化當天製備乙醯丁香酮的乙醇貯存液。使NT-1細胞受創傷以提高轉化效率。對於產生創傷，將懸浮培養物上下抽吸重複通過5ml的無菌寬口移液管(20次)。轉移4毫升的懸浮液分別到10個每個為60x15mm的Petri皿。留出一個皿作為未轉化的對照。大約50至100μl農桿菌懸浮液分別加入到剩餘的9個皿中。用parafilm將皿包好，然後在暗處，25±1℃，100rpm的搖床上孵育3天。
將細胞轉移到無菌的50ml圓錐離心管中，並加入NTC培養基(含有高壓滅菌之後加入的500mg/L羧苄青黴素的NT-1培養基)使終體積為45ml。混合然後在配備有吊桶式轉頭的離心機上1000rpm離心10分鐘。去除上清，並將獲得的沉澱重懸浮於45ml的NTC中。重複洗滌。離心懸浮液，棄掉上清，並將沉澱重懸浮於40ml的NTC中。將5ml的等分試樣鋪於每個含有NTCB10培養基(使用8g/l瓊脂/瓊脂固化的NTC培養基，補加10mg/l雙丙氨膦(bialaphos)，高壓滅菌後加入)的Petri皿(150x15mm)上。使用parafilm將皿包好，然後在暗處，25±1℃存放。在轉移到培養室之前，將皿敞口放置於層流罩超淨臺中，以使得過多的液體蒸發。在6至8周之後，出現推定的轉化體。選擇並將其轉移到新鮮的NTCB5(使用8g/l瓊脂/瓊脂固化的NTC培養基，補加5mg/l雙丙氨膦，高壓滅菌後加入)。使用parafilm將皿包好，然後在暗處，25±1℃培養。
在死亡的未轉化細胞的背景上，推定的轉化體以愈傷組織小簇的形式出現。將這些愈傷組織轉移到NTCB5培養基中，並使其生長几周。選擇每個推定的轉化體的一部分用於ELISA分析。通過至少2輪ELISA之後，選擇具有最高抗原水平的細胞系。然後在平板培養基以及偶爾在液體培養基中擴增每個原種系的愈傷組織材料的量。
實施例3植物製備的蛋白質的穩定性 由於蛋白酶、糖基化酶、脂酶或者與蛋白質和細胞組分共同純化的其它酶，從重組或者天然來源提取的蛋白質經常是不穩定的。但從NT-1細胞分離的蛋白質和免疫保護性顆粒本身是穩定的並且對許多不同類型的下遊加工活動具耐受性。在圖14中，從10升發酵罐中收穫處於穩定期的CHN-18細胞，過濾，通過離心澄清並且被微流體化(microfluidized)。然後通過0.2或0.45微米的濾膜過濾上清以除去任何可能在經過過濾或者微流體化(microfluidization)的操作期間引入的細菌性成分。不向這些懸浮液中添加穩定劑，穩定性是衍生自這些轉基因細胞的蛋白質所固有的。然後將材料儲存在2-7℃，25℃或者凍存在-80℃；發現材料在所有的溫度都是穩定的，但是最有意義的結果是當維持在25℃(環境溫度)時，發現分離的蛋白質是穩定的(圖14顯示)。儘管在月和月之間觀察到信號差異，但是在數月之後分離的蛋白質的量顯示出顯著的穩定性，從這些數據可以計算出的半衰期顯示出對於0.45微米的樣品，外推的半衰期為8個月，而對於0.2微米過濾的樣品，半衰期大於一至幾年。
應該理解的是，本申請公開的實施例和實施方案僅僅用於舉例說明目的，並且根據本中請的實施例和實施方案，多種修飾或者改變是本領域技術人員明了的並且將包括在本申請的精神和範圍內以及所附的權利要求的範圍內。另外，本申請公開的任何發明或者其實施方案的任何要素或者限定可以與任何和/或所有的其它要素或者限定(單獨地或者以本申請公開的任何組合方式)進行組合，或者與任何其它的發明或者其實施方案進行組合，並且所有這些組合均包含在本發明的範圍內而不對本發明的範圍構成限制。
實施例4培養基配方 下述是用於在瓊脂上和在液體懸浮液中培養天然NT-1細胞和重組NT-1細胞的培養基配方。另外，也給出了用於深低溫保存NT-1、重組NT-1細胞的培養基配方。
培養基製備 A.成分 除非另行指出，使用可信賴的供應商提供如下原料化學藥品 B.配方 1.10X Batch salts a.成分 量/升 b.製備 i.將750ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在加熱攪拌臺上並使用攪拌棒混合。可能必需加熱水以溶解所有的組分。
iii.將所有的組分加入水中。
iv.在最後的組分溶解之後，將體積定容到1000ml。
v.通過0.2μ濾膜對溶液過濾除菌。
vi.貯存在室溫並標記1年的有效期。
B.2.雙丙氨膦(5mg/mL) a.成分 量/50mL b.製備 i.將50ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將雙丙氨膦加入水中並混合直到溶解。
iv.通過0.2μ濾膜過濾除菌。
v.冷凍貯存並標記1年的有效期。
B.3.100X改良的MS維生素 a.成分 量/升 b.製備 i.將500ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將所有的組分加入水中。
iv.在最後的組分溶解之後，將體積定容到1000ml。
v.通過0.2μ濾膜過濾除菌。
vi.貯存在2℃-10℃並標記1年的有效期。
B.4.L-脯氨酸(2.5M) a.成分 量/100mL b.製備 i.將50ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將L-脯氨酸加入水中。
iv.當L-脯氨酸溶解之後，將體積定容到100ml。
v.貯存在2℃-10℃並標記3月的有效期。
B.5.NT-1瓊脂板 a.成分 量/升 b.製備 i.將500ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在熱攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.除了瓊脂，將所有的組分加入水中。
iv.在最後的組分溶解之後，將體積定容到1000ml。
v.將瓊脂添加到溶液中並加熱，直到瓊脂完全溶解。
vi.當溶液仍然熱時，通過0.2μ濾膜對溶液過濾除菌。
vii.使培養基冷卻，直到接近室溫。
viii.向每個15cm2無菌Petri皿加入大約25mL的瓊脂，並允許每個平板完全冷卻。
ix.將平板倒置貯存在2℃-10℃並標記3月的有效期。
B.6.NT-1液體培養基 a.成分量/升 b.製備 i.將500mLRO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將所有的組分加入水中。
iv.在最後的組分溶解之後，將體積定容到1000mL。
v.分配成750ml的等分試樣，並且在≥121℃高壓滅菌30分鐘。
vi.貯存在2℃-10℃並標記1年的有效期。
B.7.NT1VP培養基 a. 成分 量/升 b.製備 i.將500ml RO/DI水添加到合適容器中。
ii.將容器放置在攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將所有的組分加入水中。
iv.在最後的組分溶解之後，將體積定容到1000mL。
v.分配為500ml的等分試樣，並在≥121℃高壓滅菌30分鐘。
vi.貯存在2℃-10℃並標記1年的有效期。
B.8.深低溫保存培養基 a.成分 量 b.製備 i.將甘油添加到合適容器中。
ii.將容器放置在熱攪拌臺上並使用攪拌棒混合。
iii.將NT1VP培養基加入容器。
iv.在低熱混合併緩慢添加蔗糖直到溶解。
v.添加DMSO。
vi.通過0.2μ濾膜過濾除菌。
vii.在2℃-10℃貯存培養基並標記1年的有效期。
實施例5 對植物細胞生長培養基和懸浮培養物是否支持支原體生長進行評估 本申請公開的重組菸草衍生的植物細胞系CHN-18 NT-1和生長培養基不支持支原體的生長。本研究的目的是確定NT-1生長培養基或者NT-1和CHN-18 NT-1懸浮培養物是否可以支持兩個支原體物種(豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(Acholeplasma laidlawii))的生長。
該方法遵循9 CFR 113.28。在支原體接種之前，在測試的第0天，將供試材料放置於支原體瓊脂上，以證明在供試材料中缺乏支原體的存在。在測試的第0天，並未將使用支原體陽性對照物接種的供試材料放置於支原體瓊脂上。在第3、7、10和14天將支原體接種的供試材料在支原體瓊脂上傳代培養。在測試的第一天，陽性對照通過使用支原體陽性對照物接種支原體培養液和瓊脂而製備。通過使用支原體培養液接種支原體培養液和瓊脂而製備陰性對照。在第3、7、10和14天將陽性和陰性對照在支原體瓊脂上傳代培養。在接種後10-14天，檢測所有的支原體瓊脂板上的典型的支原體集落。
供試材料是NT-1植物細胞生長培養基和CHN-18植物細胞生長培養基以及NT-1和CHN-18植物懸浮細胞培養物。在植物懸浮培養物活躍生長時(即，3至4天齡培養物)，使用支原體接種植物懸浮培養物。
NT-1生長培養基不支持支原體的生長(表1)。自使用支原體陽性對照生物體接種的NT-1生長培養基傳代培養的任何支原體瓊脂板，其上沒有觀察到支原體集落。在支原體陽性對照物加入之前放置於瓊脂板上的NT-1培養基，也沒有顯示出支原體生長。陽性對照在支原體培養液中混濁生長，並且在所有的支原體瓊脂板上觀察到支原體集落。陰性對照在支原體培養液中沒有生長，並且在任何的支原體瓊脂板上沒有支原體集落。

TNTC太多以致於不能計數，每板＞100個集落 ND沒有做，在第0天檢測沒有支原體陽性對照生物體的NT-1培養基，沒有支原體集落 NT-1細胞懸浮培養物不支持支原體的生長(表2)。自使用支原體陽性對照生物體接種的NT-1細胞懸浮培養物傳代培養的任何支原體瓊脂板，其上沒有觀察到支原體集落。在支原體陽性對照加入之前放置於瓊脂板上的NT-1細胞懸浮培養物也沒有顯示出支原體生長。陽性對照在支原體培養液中混濁生長，並且在所有的支原體瓊脂板上觀察到支原體集落。陰性對照在支原體培養液中沒有生長，並且在任何的支原體瓊脂板上沒有支原體集落。

TNTC太多以致於不能計數，每板＞100個集落 ND沒有做，在第0天檢測沒有支原體陽性對照生物體的NT-1細胞懸浮培養物，並且沒有支原體集落 CHN-18生長培養基和細胞懸浮培養物不支持支原體的生長(表3)。自使用支原體陽性對照生物體接種的CHN-18生長培養基或者細胞懸浮培養物傳代培養的任何支原體瓊脂板，在其上沒有觀察到支原體集落。在支原體陽性對照物加入之前放置於瓊脂板上的CHN-18培養基或者CHN-18細胞懸浮培養物，沒有觀察到支原體生長。陽性對照在支原體培養液中混濁生長，並且在所有的支原體瓊脂板上觀察到支原體集落。陰性對照在支原體培養液中沒有生長，並且在任何的支原體瓊脂板上沒有支原體集落。

TNTC太多以致於不能計數，每板＞100個集落 ND沒有做，在第0天檢測沒有支原體陽性對照生物體的CHN-18生長培養基和細胞懸浮培養物，並且沒有支原體集落 支原體沒有在用於NT-1細胞生產的NT-1生長培養基中生長，也沒有在CHN-18生長培養基中生長。而且，NT-1懸浮培養物和CHN-18細胞懸浮培養物都不能支持支原體的生長。這些數據證明NT-1和CHN-18生長培養基，以及NT-1和CHN-18細胞培養物都不能支持支原體的生長。
序列表
Mihaliak，Charles A.
Fanton，Matthew J.
McMillen，Janis K.
使用重組植物懸浮培養物製備疫苗主細胞系
DAS-130X
US 60/733,702
2005-11-04
13
PatentIn version 3.3
1
1753
DNA
新城疫病毒

misc_feature
(1)..(1753)
參見圖1a和1b

misc_feature
(1)..(1753)
新城疫病毒(NDV)株「Lasota」的血凝素/神經氨酸酶(HN)基因的植物優化的編碼序列
1
atggacagag cagtttcaca agtggcccta gagaatgatg agagggaagc caagaatacc 60
tggaggctta tattcagaat agccatctta ttccttactg tggtcaccct agcaatctct 120
gttgcatccc tcctctattc tatgggagca agcaccccct cagacttggt gggcataccc 180
acaagaatct ctagggcaga agaaaaaatc accagtaccc ttggctccaa ccaagatgtt 240
gtggacagaa tctacaaaca ggtggcactt gaaagtccac ttgcattact caacacagag 300
actaccatca tgaatgcaat taccagccta tcctatcaaa ttaatggggc tgccaacaat 360
tcaggttggg gagccccaat tcatgatcca gactatattg gaggtattgg caaagagctt420
attgtagatg atgcttcaga tgttacatct ttctatcctt cagctttcca ggaacacctg480
aatttcattc ctgcacccac aactgggagt gggtgcacta gaataccctc atttgacatg540
agtgctacac actactgcta cacacataat gttattctct ctggctgtag ggaccactct600
cactcttatc aatacttagc tcttggagtt ctcagaacat ctgctactgg tagagtcttt660
ttctcaactc ttaggagtat caacctagat gatacacaaa ataggaaaag ttgctctgta720
tctgctacac ctttgggctg tgatatgcta tgcagtaaag taacagaaac tgaagaagag780
gactataatt ctgctgtccc tacaaggatg gtgcatggca gattgggttt tgatggtcaa840
tatcatgaaa aagatttgga tgtcactaca ttgtttgggg attgggtagc taattaccca900
ggagttggag gtggtagctt cattgactcc agagtctggt tctctgtcta tggtggttta960
aaacctaaca gtcctagtga tactgtgcaa gagggaaagt atgttatcta caagaggtat1020
aatgatactt gtcctgatga acaggattac cagattagga tggctaagtc atcatacaaa1080
ccaggaagat ttggaggtaa gaggatacaa caagctattt tgagtattaa ggttagcaca1140
tcattgggag aggacccagt ccttactgtt ccaccaaaca ctgtaacact catgggagct1200
gagggaagga ttttaactgt tggtactagc cattttcttt atcagagagg aagttcctat1260
tttagcccag cattactgta tccaatgact gtgagcaaca agacagctac attacattca1320
ccatatactt ttaatgcttt tacaagacct ggatcaattc cttgccaggc ttcagctaga1380
tgtccaaatt catgtgtgac tggagtttac actgatcctt accctttgat attttacaga1440
aatcatacct tgagaggggt ttttggaaca atgttggatg gtgttcaagc taggctcaat1500
cctgcctctg ctgtttttga ttctacatca agatcaagaa taaccagggt ttcctctagt1560
tccactaagg cagcatatac tacctccaca tgtttcaaag ttgtaaagac taacaaaact1620
tattgtctga gcatagctga gatctctaac actctttttg gggagttcag aattgttcca1680
cttttggtgg aaattctgaa ggatgatggt gtaagggaag caagatctgg ttaagtcttc1740
aggtaccgag ctc1753
2
577
PRT
新城疫病毒

misc_feature
參見圖1a和1b

misc_feature
新城疫病毒(NDV)株「Lasota」的血凝素/神經氨酸酶(HN)基因的植物優化的蛋白質序列
2
Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu
20 25 30
Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met
35 40 45
Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser
50 55 60
Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val
65 70 75 80
Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His
115 120 125
Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp
130 135 140
Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
245 250 255
Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val
275 280 285
Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile
340 345 350
Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg
355 360 365
Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Ash Thr Val Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser
420 425 430
Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg
465 470 475 480
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln
485 490 495
Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser
500 505 510
Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser
565 570 575
Gly
3
1647
DNA
禽流感病毒

misc_feature
(1)..(1647)
參見圖10

misc_feature
(1)..(1647)
禽流感病毒(AIV)A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的DNA序列.
3
gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg 60
gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa 120
ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg 180
cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta 240
gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa 300
ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac 360
tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg 420
tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata 480
aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac 540
cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta 600
ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat 660
ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc 720
tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga 780
gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc 840
ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga 900
gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg 960
cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg 1020
caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat 1080
gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca 1140
atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa 1200
aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac 1260
aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat 1320
gtcaagaacc tatacgataa ggtccgactc cagctgagag ataatgcaaa agaattgggc 1380
aatgggtgtt tggagttctc ccacaaatgt gacaatgaat gcatggaaag tgtgagaaac 1440
ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat 1500
ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg 1560
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga 1620
tcattgcaat gcagaatttg catctag 1647
4
548
PRT
禽流感病毒

misc_feature
參見圖10.

misc_feature
禽流感病毒(AIV)A/Turkey/wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的蛋白質序列.
4
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val
1 5 10 15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
35 40 45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65 70 75 80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
100 105 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
115 120 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
130 135 140
Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
165 170 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
180 185 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
195 200 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
245 250 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
260 265 270
Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
275 280 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
290 295 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
325 330 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
340 345 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
355 360 365
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
370 375 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu
385 390 395 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
405 410 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
420 425 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
435 440 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu
450 455 460
Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
465 470 475 480
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
485 490 495
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
500 505 510
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
515 520 525
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
530 535 540
Arg Ile Cys Ile
545
5
28
DNA
合成序列

misc_feature
(1)..(28)
用於末端剪裁pCP！H上的組成型木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的PCR引物，CVM-Asc
5
atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag28
6
24
DNA
合成序列

misc_feature
(1)..(24)
用於末端剪裁pCP！H上的木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子的PCR引物，CVM-Xho
6
atctcgagcc atggtttgga tcca 24
7
25
DNA
合成序列

misc_feature
(1)..(25)
用於產生Nco I位點的誘變引物
7
tgccatggtg atgtgtggtc tacaa 25
8
23
DNA
合成序列

misc_feature
(1)..(23)
互補於5』區的正向引物
8
gatctgacaa gtcaagaaaa ttg23
9
23
DNA
合成序列

misc_feature
(1)..(23)
用於產生XhoI I位點的誘變引物
9
agctcgagct gtgtgagtga gtg23
10
1368
DNA
傳染性法氏囊病病毒

misc_feature
(1)..(1368)
參見圖14.

misc_feature
(1)..(1368)
傳染性法氏囊病病毒VP2基因的DNA序列.
10
atgaccaacc tccaagatca aactcaacag attgttccct tcatacgcag ccttctcatg60
ccaaccactg gacctgcttc cattcctgat gacaccttgg agaagcacac tctccgctct120
gagacctcaa cctacaactt gactgttggt gacactggct ctgggttgat tgtctttttc180
cctgggttcc ctggctccat tgtgggtgct cactacacat tgcagtccaa tggcaactac240
aagtttgatc aaatgctctt gactgcccag aatcttccag cctcctacaa ctattgccgt300
cttgtgtctc gctccctcac agtgaggtcc tcaacactcc ctggtggagt gtatgcactc360
aatggcacca tcaacgcagt gactttccaa ggaagccttt cagaattgac tgatgtgagc420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaatgaca agattgggaa tgtccttgtt480
ggagaaggag tcaccgtcct ctcactccca acatcctatg atcttggcta tgtgagactt540
ggtgatccca ttcctgccat aggacttgat cccaaaatgg ttgccacatg tgacagctct600
gatcgtccaa gggtttacac catcacagca gctgatgact accaattctc ctcacagtac660
caagctggtg gagtcaccat cacactcttc tcagccaaca tagatgccat cacaagcctc720
agcattggtg gagaacttgt ctttcagaca tctgtccaag ggctcatcct tggtgccacc780
atctacttga ttggctttga tggcactgct gtcatcacca gagcagtggc tgcagacaat840
gggctcacag ctggcactga caacctcatg ccattcaaca ttgtgattcc cacctctgag900
atcacccagc caatcacttc catcaagttg gagatagtga cctcaaagtc cggtggacaa960
gctggtgatc agatgtcctg gtctgcatct gggagcttgg ctgtgaccat tcatggtggc1020
aactaccccg gagccctcag acctgtgact ttggttgcct atgaacgcgt tgcaactggc1080
tctgttgtca ctgttgctgg tgtcagcaac tttgagttga tcccaaatcc tgaacttgca1140
aagaacttgg tcacagagta tggaaggttt gaccctggtg ccatgaacta cacaaaattg1200
atcctctcag agagggacag acttggcatc aagactgttt ggccaaccag agagtacact1260
gacttccgcg agtacttcat ggaggttgct gacctcaaca gccctctcaa gatagctgga1320
gcctttggtt tcaaagacat cataagggct attcgtcgca tcgctgtt 1368
11
1425
DNA
傳染性法氏囊病病毒

misc_feature
編碼E/91 VP2(傳染性法氏囊病病毒的結構蛋白質)變體的多核苷酸(DNA)
11
agatctgaag acaacatgac caacctccaa gatcaaactc aacagattgt tcccttcata 60
cgcagccttc tcatgccaac cactggacct gcttccattc ctgatgacac cttggagaag 120
cacactctcc gctctgagac ctcaacctac aacttgactg ttggtgacac tggctctggg 180
ttgattgtct ttttccctgg gttccctggc tccattgtgg gtgctcacta cacattgcag 240
tccaatggca actacaagtt tgatcaaatg ctcttgactg cccagaatct tccagcctcc 300
tacaactatt gccgtcttgt gtctcgctcc ctcacagtga ggtcctcaac actccctggt 360
ggagtgtatg cactcaatgg caccatcaac gcagtgactt tccaaggaag cctttcagaa 420
ttgactgatg tgagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa tgacaagatt 480
gggaatgtcc ttgttggaga aggagtcacc gtcctctcac tcccaacatc ctatgatctt 540
ggctatgtga gacttggtga tcccattcct gccataggac ttgatcccaa aatggttgcc 600
acatgtgaca gctctgatcg tccaagggtt tacaccatca cagcagctga tgactaccaa 660
ttctcctcac agtaccaagc tggtggagtc accatcacac tcttctcagc caacatagat 720
gccatcacaa gcctcagcat tggtggagaa cttgtctttc agacatctgt ccaagggctc 780
atccttggtg ccaccatcta cttgattggc tttgatggca ctgctgtcat caccagagca 840
gtggctgcag acaatgggct cacagctggc actgacaacc tcatgccatt caacattgtg 900
attcccacct ctgagatcac ccagccaatc acttccatca agttggagat agtgacctca 960
aagtccggtg gacaagctgg tgatcagatg tcctggtctg catctgggag cttggctgtg 1020
accattcatg gtggcaacta ccccggagcc ctcagacctg tgactttggt tgcctatgaa 1080
cgcgttgcaa ctggctctgt tgtcactgtt gctggtgtca gcaactttga gttgatccca 1140
aatcctgaac ttgcaaagaa cttggtcaca gagtatggaa ggtttgaccc tggtgccatg 1200
aactacacaa aattgatcct ctcagagagg gacagacttg gcatcaagac tgtttggcca 1260
accagagagt acactgactt ccgcgagtac ttcatggagg ttgctgacct caacagccct 1320
ctcaagatag ctggagcctt tggtttcaaa gacatcataa gggctattcg tcgcatcgct 1380
gtttgagtag ttagcttaat cacctagagc tcggtcacca gatct 1425
12
456
PRT
傳染性法氏囊病病毒

misc_feature
由SEQ ID NO11編碼的E/91 VP2(傳染性法氏囊病病毒的結構蛋白質)的多肽變異
12
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr
65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val
450 455
13
42
DNA
傳染性法氏囊病病毒

misc_feature
(1)..(42)
編碼翻譯終止(「終止」)密碼子的DNA序列，該序列用於終止在轉化過程中DNA整合後無意發生的開放閱讀框翻譯(包括Sac I，BstE II和Bgl II限制性酶識別位點)
13
tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 4權利要求
1、用於生產蛋白質活性劑的植物細胞培養物，包括
a)經穩定轉化以表達編碼蛋白質活性劑的轉基因的植物細胞系；
b)生長培養基，其支持所述植物細胞培養物的生長但是不支持支原體科生物生長，並且不含有動物來源的材料；
其中所述植物細胞系能夠連續傳代以致可以在傳代期間維持一致的轉基因表達，並且其中所述的植物細胞系能夠被深低溫保存以致一旦從深低溫保存中恢復後可以恢復一致的轉基因表達。
2、權利要求1的植物細胞培養物，其中該轉化的植物細胞系是低等植物細胞系、雙子葉植物細胞系或者單子葉植物細胞系。
3、權利要求2的植物細胞培養物，其中該轉化的植物細胞系是雙子葉植物細胞系。
4、權利要求3的植物細胞培養物，其中所述轉化的植物細胞系是菸草細胞系。
5、權利要求4的植物細胞培養物，其中所述菸草細胞系選自NT-1或BY-2。
6、權利要求3的植物細胞培養物，其中所述雙子葉植物的轉化的細胞系衍生自選自西紅柿、馬鈴薯、甘薯、木薯、包括苜蓿和大豆的豆科植物、胡蘿蔔、草莓、萵苣、櫟、槭樹、胡桃、玫瑰、薄荷、向日葵、紅花、棉、菸草、南瓜、雛菊、Canola或者仙人掌的植物。
7、權利要求2的植物細胞培養物，其中所述單子葉植物的轉化的細胞系衍生自選自小麥、草，草坪草、穀物、玉米或玉蜀黍、稻、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭、鳶尾、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高粱和棕櫚的植物。
8、權利要求2的植物細胞培養物，其中所述轉化的低等植物細胞系衍生自羊齒植物、裸子植物、針葉樹、木賊類植物、石松類、苔類植物、角苔類植物、苔蘚類、紅藻類、褐藻類、蕨類植物的配子體、孢子體或者綠藻類。
9、根據在前權利要求中任一項的植物細胞培養物，其中該蛋白質活性劑是來自禽病毒的蛋白質。
10、根據權利要求9的植物細胞培養物，其中該蛋白質是來自新城疫病毒(NDV)的血凝素/神經氨酸酶蛋白、來自禽流感病毒(AIV)的血凝素蛋白或者來自傳染性法氏囊病病毒的VP2蛋白。
11、權利要求9的植物細胞培養物，其中所述蛋白質包括SEQ IDNO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO12。
全文摘要
本發明提供用於生產蛋白質活性劑的植物細胞培養物，包括表達編碼蛋白質活性劑的轉基因的穩定轉化植物細胞系和生長培養基，其中該培養基支持所述的植物細胞培養物的生長而不支持支原體科生物的生長，並且不含有動物來源的材料。該植物細胞系能夠連續傳代以致於可以在傳代期間維持一致的轉基因表達。該植物細胞系也能夠被深低溫保存以致於一旦從深低溫保存中恢復後可以恢復一致的轉基因表達。
文檔編號A61K39/00GK101355961SQ200680050467
公開日2009年1月28日 申請日期2006年10月23日 優先權日2005年11月4日
發明者C·A·米哈裡埃克, M·J·方東, J·K·麥克米倫 申請人:美國陶氏益農公司