一種基於螢光納米發光和磁性納米材料的甲胎蛋白(afp)的檢測方法

2023-05-02 10:11:31

專利名稱：：一種基於螢光納米發光和磁性納米材料的甲胎蛋白(afp)的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及臨床檢測領域，具體涉及一種利用CdTe量子點和Fe304~"Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法。
背景技術：
：原發性肝癌作為我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢，己成為我國第二位癌症殺手。甲胎蛋白AFP屬於胚胎性蛋白，主要由胚胎時期的肝細胞和卵黃囊產生，出生後濃度即迅速下降，數月至一年內接近成人水平〈20ng/ml。AFP是診斷原發性肝癌的特異性腫瘤標誌物，具有確立診斷、早期診斷、鑑別診斷的作用。一般認為測定血清中AFP陽性或定量〉400毫微克/毫升、〉200毫微克/亳升，持續8周，而谷丙轉氨酶正常，並排除妊娠和生殖腺胚胎瘤，原發性肝癌的診斷確立。目前常用的AFP定量的方法有酶標法、酶標電泳法、放射免疫法檢測。但酶不穩定、放射性物質設備要求高，且危害較大。Fe304是一種重要的鐵的氧化物，是應用最為廣泛的軟磁性材料之一。以磁流體形式存在的Fe304納米粒子在液體中具有一般的液體屬性和順磁性，在外加磁場的情況下，能發生定向移動。並且Fe304納米粒子經過表面修飾能夠和多種生物分子相連接，在外加磁場的作用下，能夠實現這些生物分子的固定化或者純化。CdTe量子點是一種螢光半導體納米晶，量子點具有強度高、穩定性好、能夠用一種波長的光源激發多種波長、發射波長隨著粒徑的增大而有規律地紅移等螢光特性。水相合成的CdTe量子點親水性好，經過表面修飾以後，能夠和多種生物分子相互作用。本發明通過使用特殊處理的半導體量子點來代替通常的時間分辨發光免疫分析方法中發光體——稀土離子鰲和物和使用磁分離純化，來解決該免疫分析法的背景光幹擾、選擇性不好等問題，從而富集目標物，來顯著簡化甲胎蛋白(AFP)的檢測過程。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服現有免疫分析法測定AFP中背景光幹擾、選擇性不好以及操作繁瑣、靈敏度不高的缺點，提供一種利用CdTe量子點和Fe304~~DeXtran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法。本發明提供的一種利用CdTe量子點和Fe304~~Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法包括下列步驟(a)Fe304—Dextmn—第一抗體複合物的製備利用共沉澱方法製備表面包覆了Dextmn的Fe304，並將抗人甲胎蛋白抗體連接到Fe304—Dextran上形成Fe304—Dextran—第一抗體複合物；(b)CdTe—第二抗體複合物的製備-利用水熱法製備CdTe量子點，並將羊抗人抗體連接到CdTe上，形成CdTe—第二抗體複合物；(c)繪製"螢光強度一AFP濃度"標準工作曲線，算出工作方程；(d)測定所得螢光強度數值通過工作方程得到肝癌病人AFP的含量。步驟(a)所述的Fe304—Dextran—第一抗體複合物的製備具體包括如下步驟(2)共沉澱方法製備Fe304~~Dextran顆粒-將lgDextran溶於2ml超純水中，抽真空20min後充氮氣20min，將Fe"鹽和Fe^鹽溶於3.4ml超純水中並將其倒入到溶解有Dextran的水中，再向其中加入過量的濃氨水得到黑色的沉澱，結合磁分離用去離子水反覆洗滌沉澱多次。所述的F^+鹽可為水合FeCl3，所述的F,鹽可為水合FeS04、FeCl2，Fe^鹽與F^+鹽摩爾比為2:1，所述氨水濃度為25%。(3)Fe304—Dextran—第一抗體複合物的製備在Fe304—Dextran中加入過量的KI03，再將磁性粒子分散在pH8.4的硼酸緩衝液中，然後加入抗人甲胎蛋白抗體於4'C下保存過夜。然後加入5%的BSA封閉磁性納米顆粒表面多餘活性位點，形成"Fe304—Dextran—第一抗體"複合物。所述抗人甲胎蛋白抗體可為鼠抗人甲胎蛋白抗體、兔抗人甲胎蛋白抗體。步驟(b)所述的製備CdTe—第二抗體複合物的步驟具體如下(1)水熱法製備CdTe量子點在飽含N2的超純水中，分別加入5%Na-~citrate、0.04mol/LCdCl2'2.5H20、0.01mol/LNa2Te03、50mg穩定劑L一cysteine和50mgNaBH4，在IOO'C下煮沸lh。所述CdCl2與Na2Te03的摩爾比為6:1。(2)CdTe—第二抗體複合物的製備將CdTe加入到溶解有羊抗人的PH6.0的乙酸緩衝液中，形成"CdTe—第二抗體"複合物。步驟(c)所述的繪製"螢光強度一AFP濃度"標準工作曲線和計算工作方程的步驟具體如下(1)分別取300^1的"Fe304—Dextran—第一抗體"與0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室溫下反應30min;(2)結合磁分離，將步驟(l)中的各個微型離心管樣品用pH6.0的醋酸緩衝溶液洗滌2次，然後定溶到l.Oml，然後分別加入"CdTe—第二抗體"複合物200^1，室溫下反應30min;(3)結合磁分離，用pH6.0的醋酸緩衝溶液小心洗滌2次，然後用pH8.4的硼酸緩衝溶液定溶到lml，測螢光；(4)根據抗原濃度和558nm處的螢光強度關係，繪製"螢光強度一AFP濃度"標準工作曲線；(5)根據步驟(4)的工作曲線，算出工作方程y=+(Z+4.5)，式中7為AFP的濃度，單位為ng/ml，V所採取的血樣的體積，單位為ml，X為三明治複合物在558nm處的螢光強度，單位為a.u.。本發明通過使用磁分離純化和用特殊處理的半導體量子點來代替通常的時間分辨發光免疫分析方法中的稀土離子鰲和物的方法，解決該免疫分析法的背景光幹擾、選擇性不好等問題，從而富集目標物，可以顯著簡化甲胎蛋白(AFP)的檢測手段，這種檢測手段簡單，並且靈敏度高，可以讓很多癌症初期的病人較簡易地檢測到病情，並及時採取治療手段，為肝癌的臨床檢測開闢了一條嶄新的道路。圖l為實施例l所製得的CdTe量子點的螢光和紫外吸收；圖2為實施例1所繪製的"螢光強度-AFP濃度"標準工作曲線；具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例1Fe304_Dextran的製備1.稱取lg的DextranT40，溶解於2ml超純水中，抽真空20min，N2飽和20min;2.稱取90mg的FeCl3.6H20和154mg的FeS04-7H20，溶解於3.4ml超純水中，抽真空20min，N2飽和20min;3.將步驟1和2做得產物混合，置於60'C水浴中，加磁子攪拌，滴入0.6ml的濃氨水，反應15min;4.結合磁分離，用超純水清洗數次。CdTe量子點製備1.將40mL超純水中先抽真空20min再充入氮氣20min。2.在磁力攪拌下，依次加入2mL5%Na~citrate溶液，4mL0.04mol/LCdCl2.2.5H20溶液，4mL0.01mol/LNa2Te03溶液，50mgL~cysteine和50mgNaBH4。3.磁力攪拌反應5分鐘形成清亮的綠色溶液。在100'C沸水浴中回流lh，即製備出CdTe量子點。"Fe304—Dextran—第一抗體"複合物的製備1.取2mlFe304~Dextran加入過量的KI03，室溫黑暗條件下磁力攪拌5h，磁子表面Dextran的一OH被氧化成一CHO，後磁分離將其洗乾淨；2.將固體Fe304^Dextran分散在pH8.0的硼酸緩衝液中，然後將lmgl/ml的兔抗人抗體加入其中，4'C條件下過夜，這樣抗體就和Fe304—Dextran結合在一起了；3.再加入200ttl、5^。的BSA，在4'C條件下過夜，沒有參加反應的基團就被封閉了；."CdT卜第二抗體"複合物的製備1.取取1.5ml的QDs原液，加pH6.0的HAc—NaAc緩衝液3.5ml，得到4ml、3xl(r4mol/的CdTe(兩者體積比例為3:5);2.取1500^1、0.3mM的CdTe與9(Hil第二抗體混合，室溫下反應20min，得到"CdTe—第二抗體"複合物。"螢光強度一AFP濃度"曲線的製備1.分別取30(^1的"Fe304—Dextran—第一抗體"與0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室溫下反應30min;2.結合磁分離，將步驟1中的各個微型離心管樣品用pH6.0的醋酸緩衝溶液洗滌2次，然後定溶到1.0ml，然後分別加入"CdTe—第二抗體"複合物200^1，室溫下反應30min;.3.結合磁分離，用pH6.0的醋酸緩衝溶液小心洗滌2次，定溶到0.5ml，測螢光；4.繪出"螢光強度一AFP濃度"曲線。5.根據"螢光強度一AFP濃度"標準工作曲線，得出工作方程r=+(Z+4.5)。式中Y為AFP的濃度，單位為ng/ml，V所採取的血樣的體積，單位為ml，X為三明治複合物在558nm處的螢光強度，單位為a.u.。檢測病人血清中AFP的含量-1.取血清lml，與300^1的"Fe304—Dextran—第一抗體"混合，在室溫下反應30min;2.結合磁分離，將步驟1中的各個微型離心管樣品用pH6.0的醋酸緩衝溶液洗滌2次，然後定溶到1.0ml，然後分別加入"CdTe"第二抗體"複合物200n，室溫下反應30min;3.結合磁分離，用pH6.0的醋酸緩衝溶液小心洗滌2次，使用pH8.4的硼酸緩衝溶液定溶至!]0.5ml，測螢光；4.將所得到的結果帶入工作方程y-丄(Jir+4.5)中，計算出血清中AFP的含量，並將結果與時間分辨螢光檢測結果對比。表1本發明的檢測方法與時間分辨螢光檢測結果對比tableseeoriginaldocumentpage8權利要求1.一種利用CdTe量子點和Fe3O4—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於包括下列步驟(a)Fe3O4—Dextran—第一抗體複合物的製備共沉澱方法製備表面包覆了Dextran的Fe3O4，並將抗人甲胎蛋白抗體連接到Fe3O4—Dextran上形成Fe3O4—Dextran—第一抗體複合物；(b)CdTe—第二抗體複合物的製備水熱法製備CdTe量子點，並將羊抗人抗體連接到CdTe上，形成CdTe—第二抗體複合物；(c)繪製「螢光強度—AFP濃度」標準工作曲線，算出工作方程；(d)測定所得螢光強度數值帶入工作方程得到肝癌病人AFP的含量。2.根據權利要求1所述的利用CdTe量子點和Fe304—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(a)所述的Fe304—Dextran—第一抗體複合物的製備具體包括如下步驟(1)共沉澱方法製備Fe304~~Dextran顆粒將lgDextran溶於2ml超純水中，抽真空20min後充氮氣20min，將Fe"鹽和F^+鹽溶於3.4ml超純水中並將其倒入到溶解有Dextran的水中，再向其中加入過量的濃氨水得到黑色的沉澱，結合磁分離用去離子水反覆洗滌沉澱多次；'(2)Fe304—Dextran—第一抗體複合物的製備在Fe304—Dextran中加入過量的KI03，再將磁性粒子分散在pH8.4的硼酸緩衝液中，然後加入抗人甲胎蛋白抗體於4'C下保存過夜。然後加入5%的BSA封閉磁性納米顆粒表面多餘活性位點，形成"Fe304—Dextran—第一抗體"複合物。3.根據權利要求2所述的利用CdTe量子點和Fe304—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(l)所述的F^+鹽為水合FeCl3，所述的Fe"鹽為水合FeS04或FeCl2。4.根據權利要求3所述的利用CdTe量子點和Fe304—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於所述的Fe"鹽為FeCl3'6H20，所述的Fe"鹽為FeS04.7H20。5.根據權利要求2或3或4所述的利用CdTe量子點和Fe:A—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於所述FeS+鹽與Fe^鹽摩爾比為2:1。6.根據權利要求2或3或4所述的利用CdTe量子點和FeA—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於所述氨水濃度為25%。7.根據權利要求2所述的利用CdTe量子點和FeA—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(2)所述的抗人甲胎蛋白抗體為鼠抗人甲胎蛋白抗體或兔抗人甲胎蛋白抗體。8.根據權利要求1所述的利用CdTe量子點和FeA—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(b)所述的製備CdTe—第二抗體複合物的步驟具體如下(1)水熱法製備CdTe量子點在飽含N2的超純水中，分別加入Na-"Citrate、CdCl22.5H20、Na2Te03、L~~cysteine和NaBH4，在IOO'C下煮沸lh;(2)CdTe—第二抗體複合物的製備將CdTe加入到溶解有羊抗人的pH6.0的乙酸緩衝液中，形成"CdTe—第二抗體"複合物。9.根據權利要求8所述的利用CdTe量子點和Fe304—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(1)所述的Na-^itrate濃度為5X，CdCl22.5H20濃度為0.04mol/L，Na2Te03濃度為0.01moI/L，L~cysteine為50mg，NaBH4為50mg。10.根據權利要求8所述的利用CdTe量子點和FeA—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(1)所述的CdCl2與Na2TeCb的摩爾比為6:1。11.根據權利要求1所述的利用CdTe量子點和Fe304—Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於步驟(c)所述的繪製"螢光強度^AFP濃度"標準工作曲線和計算工作方程的步驟具體如下(1)分別取300^1的"Fe304—Dextran—第一抗體"與0、10、20、30、40、50、60ng的抗原混合，在室溫下反應30min;(2)結合磁分離，將步驟(l)中的各個微型離心管樣品用pH6.0的醋酸緩衝溶液洗滌2次，然後定溶到1.0ml，然後分別加入"CdTe—第二抗體"複合物200nl，室溫下反應30min;(3)結合磁分離，用pH6.0的醋酸緩衝溶液小心洗滌2次，然後用pH8.4的硼酸緩衝溶液定溶到lml，測螢光；(4)根據抗原濃度和558nm處的螢光強度關係，繪製"螢光強度一AFP濃度"標準工作曲線；(5)根據步驟(4)的工作曲線，算出工作方程y=+(Z+4.5)，式中r為AFP的濃度，單位為ng/ml，V所採取的血樣的體積，單位為ml，X為三明治複合物在558nm處的螢光強度，單位為a.u.。全文摘要本發明涉及一種利用CdTe量子點和Fe3O4-Dextran納米顆粒檢測血清中AFP含量的方法，其特徵在於其步驟包括(a)Fe3O4-Dextran-第一抗體複合物的製備(b)CdTe-第二抗體複合物的製備(c)繪製「螢光強度一AFP濃度」標準工作曲線，算出工作方程；(d)測定所得螢光強度數值帶入工作方程得到肝癌病人AFP的含量。該方法檢測手段簡單，靈敏度高，可以讓很多癌症初期的病人較簡易地檢測到病情，並及時採取治療手段，為肝癌的臨床檢測開闢了一條嶄新的道路。文檔編號G01N33/574GK101441218SQ20081020724公開日2009年5月27日申請日期2008年12月18日優先權日2008年12月18日發明者倪似愚,周興平,凱李,靖李,胡栩華申請人:東華大學