一種高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的方法

2023-05-02 02:55:56

專利名稱：一種高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，涉及一種定量測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的研究方法，特別涉及一種運用高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的相關技術。
背景技術：
酪氨酸(tyrosine，Tyr)屬於人體的非必需胺基酸，由苯丙氨酸(phenylalanine， Phe)經苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)脫去羥基轉化而來，是合成兒茶酚胺類神經遞質-多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的前體物質，與神經元的傳遞有重要關係。L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)是人體內必需胺基酸之一，參與人體蛋白質合成和代謝調節，是5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5_HT)的前體物質，而5-HT是人體內重要的神經遞質，可能是中樞神經系統病變的神經生物學基礎。研究表明，Tyr、Trp和5-HT 三種胺基酸在人體神經精神系統中均發揮著重要的作用。目前，國內外報導測定Tyr、Trp和5-HT的方法有很多，其中，報導最多的為運用 HPLC法測定其中的一種或者兩種進行測定，但未見採用HPLC-FLD同時測定血清中Tyr、Trp 和5-HT含量的報導，本發明利用Tyr、Trp和5-HT具有自然螢光的特性，在國內外首次公開一種同時測定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD，血清標本去蛋白後取上清直接進樣， Tyr.Trp和5-HT通過色譜柱分離後，通過波長轉換，在特定的時間段，以各自的最適螢光激發和發射波長進行檢測。

發明內容
本發明的目的是公開一種能夠同時測定血清中Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD 法，可滿足醫療臨床工作和科研對於Tyr、Trp和5-HT的快速、準確測定。一種高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的方法以Atlantis C18色譜柱為固定相，所述色譜柱規格為4. 6mmX 150mm i.d. ,5ym； 以0. ImoVLKH2PO4 甲醇混合溶液為流動相，所述0. lmol/L KH2PO4與甲醇的體積比為 85 15;流動相pH值為4.3;流速為1.01111/1^11;將待測樣品經色譜柱洗脫、分離後，用螢光檢測器進行分析、測定；螢光檢測器激發波長和發射波長0 ^iin分別為228nm和306nm， 4 7. 5min 為 278nm 和 338nm, 7. 5min 後為 285nm 和 353nm0所述的螢光檢測器為多波長螢光檢測器，具有多通道，可調波長的特點。所述的流動相使用前，用0. 22 μ M的微孔濾膜過濾，超聲脫氣20min。酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺的標準工作液配製方法如下準確稱取酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺，用2. 5% ν/ν的高氯酸溶液溶解、混勻；分別配製成55 μ mol/L、49 μ mol/L、 1. 176 μ mol/L的標準工作液。待測血清樣品的處理將空腹靜脈血2ml於促凝管內，常溫常速離心分離血清，取血清於印pendorf管內，加入等量5 %高氯酸溶液，充分混勻後室溫放置lOmin，10000r/min 離心lOmin，取上清液20 μ L進樣分析。本發明利用Tyr、Trp和5-HT三種氨胺基酸均具有自然螢光的特性，並經過大量實驗條件的摸索，建立了一種能同時測定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD法，本方法簡單、快速，血清標本去蛋白後，取上清液直接進樣，Tyr、Trp和5-HT通過色譜柱分離後，採用波長轉換，在特定的時間段，以各自的最適激發和發射波長進行檢測，IOmin即可完成檢測， 本發明明顯優於已公開的技術，簡便、快速、靈敏度高，無需柱前、柱後衍生；因此是一項非常值得廣泛應用、推廣的技術。


圖1為混合標準品Tyr、Trp和5-HT的色譜圖；圖2為正常成人血清樣品Tyr、Trp和5_HT的色譜圖。
具體實施例方式下面結合實施方式和實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。本發明方法的建立過程1儀器和試劑儀器高效液相色譜儀包括Waters 510色譜泵和M75螢光檢測器、Milli-Q純水器、Rheodyne 7725手動進樣器(帶20 μ L進樣環)、0. 22 μ m濾膜及其抽濾器。試劑L_Tyr、 L-Trp,5-HT, L_Phe、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、0. lmol/L KH2PO4和甲醇(色譜純)。2Tyr、Trp和5-HT含量測定條件的選擇2.1檢測波長的選擇本發明發現，通過對Tyr，5-HT和Trp激發光波譜範圍QOOnm 450nm)和發射光波譜O50nm 500nm)掃描，得到各自的最適激發光波長和最適發射光波長，分別為228nm 和 306nm>278nm 和 338nm>285nm 和 353nm02. 2流動相中有機相甲醇含量的選擇本發明發現，改變流動相中甲醇體積百分比(5^^10^^15^^20% )，以混合標準工作液作為樣品進行分析，色譜圖顯示，隨著甲醇含量的增加，Tyr、5-HT和Trp相應的保留時間均縮短。而當甲醇體積分數為5%時，分析時間較長，而當甲醇體積分數為20%時，分離效果不佳，在甲醇體積分數為15%時分離度較好，三者在IOmin內可以較好地分離，且分離度好，故採用含體積分數為15%甲醇的流動相。2. 3流動相PH值的選擇本發明發現，加入冰乙酸調節PH，分別調至4. 0,5. 0和6. 0進行分析，發現不同 PH條件下，Tyr、Trp和5-HT的保留時間和峰面積沒有明顯改變，所以直接選擇0. Imol/ LKH2PO4 甲醇(85 15, V V ;PH = 4. 3)溶液作為流動相。2. 4流動相流速的選擇本發明發現，通過改變流動相的流速0. 6,0. 8,0. 9,1. 0,1. 2,1. 4ml/min。Tyr,Trp 和5-HT的保留時間明顯縮短，但同時鋒面積也相應減小，同時較大的流速也需要提供較大的泵壓，使柱子承受較大的壓力，綜上考慮，選擇流速為l.Oml/min最優。
2. 5蛋白質沉澱劑的選擇本發明發現分別選用5%的高氯酸、0. 6mol/L的三氯乙酸溶液(TCA)、0. 4mol/L 的磺基水楊酸溶液(SSA)做為蛋白質沉澱劑去除血清蛋白質，對血清進行測定。結果發現用SSA去蛋白的血清有幹擾峰且嚴重影響Tyr、Trp和5-HT的測定，而高氯酸和三氯乙酸去蛋白的血清效果很好，本實驗選擇用高氯酸做沉澱劑。3. Tyr、Trp和5-HT的定性定量分析Tyr.Trp和5-HT採用峰保留值比較法和疊加法進行定性分析，即比對混合標準品和血清樣品在相同條件下的色譜峰和相對保留時間。實驗結果表明，在血清樣品中加入標準品前後，三種Tyr、Trp和5-HT的出峰位置是一致的。用外標法測定峰面積進行定量分析，用公式表示為血清Tyr、Trp 或 5-ΗΤ 濃度=j X Cs X 2Au為血清中Tyr、Trp或5-HT峰面積；As為混合標準液中Tyr、Trp或5-HT峰面積；Cs為混合標準液中Tyr、Trp或5-HT濃度；4.方法學評價4. 1精密度的實驗日內不精密度取混合血清，同一樣本一天內連續測定20次；日間不精密度同一樣本一天測一次，連續測定20天，計算日內、日間不精密度。見表1表lTyr、Trp和5-HT的日內和日間不精密度
權利要求
1.一種高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的方法，其特徵在於，以Atlantis C18色譜柱為固定相，所述色譜柱規格為4. 6mmX 150mm i. d.， 5 μ m ；以0. lmol/L KH2PO4 甲醇混合溶液為流動相，所述0. lmol/L KH2PO4與甲醇的體積比為85 15;流動相pH值為4.3;流速為1.01111/1^11;將待測樣品經色譜柱洗脫、分離後， 用螢光檢測器進行分析、測定；螢光檢測器激發波長和發射波長0 ^iin分別為和 306nm, 4 7. 5min 為 278nm 和 338nm, 7. 5min 後為 285nm 和 353nm0
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的螢光檢測器為多波長螢光檢測器。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的流動相使用前，用0.22 μ M的微孔濾膜過濾，超聲脫氣20min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺的標準工作液配製方法如下準確稱取酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺，用2. 5% ν/ν的高氯酸溶液溶解、 混勻；分別配製成55 μ mol/L、49 μ mol/LU. 176 μ mol/L的標準工作液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於待測血清樣品的處理將空腹靜脈血2ml 於促凝管內，常溫常速離心分離血清，取血清於印pendorf管內，加入等量5 %高氯酸溶液， 充分混勻後室溫放置lOmin，10000r/min離心lOmin，取上清液20 μ L進樣分析。
全文摘要
本發明提供了一種高效液相色譜-螢光法同時測定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羥色胺含量的方法。本方法準確、快速，包括以下步驟血清經5％的高氯酸去蛋白後採用高效液相色譜技術檢測，其中色譜條件為色譜柱規格為4.6mm×150mm ID的Atlantis C18柱；以0.1mol/L KH2PO4—甲醇體積比85∶15混合溶液為流動相，流速為1.0ml/min；螢光檢測器激發波長和發射波長0～4min分別為228nm和306nm，4～7.5min為278nm和338nm，7.5min後為285nm和353nm，在特定時間段調節波長對酪氨酸、5-羥色胺和色氨酸進行分離檢測。
文檔編號G01N30/88GK102213703SQ20111008980
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月11日 優先權日2011年4月11日
發明者唐愛國, 李影, 穆薩 申請人:中南大學